基因克隆實例分析一、將大腸桿菌染色體上基因A克隆到質(zhì)粒載體pUC18上序列如下atacaattggttatgtgttttgggggcgatcgtgaggcaaagaaaacccggcgctgaggccgggttattcttgttctctggtcaaattatatagttggaaaacaaggatgcatatatgaatgaacgatgcagaggcaatgccgatggcgatagtgggtatcatgtagccgcttatgctggaaagaagcaataacccgcagaaaaacaaagctccaagctcaacaaaactaagggcatagacaataactaccgatgtcatatacccatactctctaatcttggccagtcggcgcgttctgcttccgattagaaacgtcaaggcagcaatcaggattgcaatcatggttcctgcatatgatgacaatgtcgccccaagaccatctctatgagctgaaaaagaaacaccaggaatgtagtggcggaaaaggagatagcaaatgcttacgataacgtaaggaattattactatgtaaacaccaggcatgattctgttccgcataattactcctgataattaatccttaactttgcccacctgccttttaaaacattccagtatatcacttttcattcttgcgtagcaatatgccatctcttcagctatctcagcattggtgaccttgttcagaggcgctgagagatggcctttttctgatagataatgttctgttaaaatatctccggcctcatcttttgcccgcaggctaatgtctgaaaattgaggtgacgggttaaaaataatatccttggcaaccttttttatatcccttttaaattttggcttaatgactatatccaatgagtcaaaaagctccccttcaatatctgttgcccctaagacctttaatatatcgccaaatacaggtagcttggcttctaccttcaccgttgttcggccgatgaaatgcatatgcataacatcgtctttggtggttcccctcatcagtggctctatctgaacgcgctctccactgcttaatgacattcctttcccgattaaaaaatctgtcagatcggatgtggtcggcccgaaaacagttctggcaaaaccaatggtgtcgccttcaacaaacaaaaaagatgggaatcccaatgattcgtcatctgcgaggctgttcttaatatcttcaactgaagctttagagcgatttatcttctgaaccagactcttgtcatttgttttggtaaagagaaaagtttttccatcgattttatgaatatacaaataattggagccaacctgcaggtgatgattatcagccagcagagaattaaggaaaacagacaggtttattgagcgcttatctttccctttatttttgctgcggtaagtcgcataaaaaccattcttcataattcaatccatttactatgttatgttctgaggggagtgaaaattcccctaattcgatgaagattcttgctcaattgttatcagct基本流程1、選用恰當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶2、進(jìn)行引物設(shè)計擴(kuò)增外源基因3、PCR擴(kuò)增外源基因，并純化4、酶切5、連接6、轉(zhuǎn)化7、篩選1、選用恰當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶

分析外源基因有哪些酶切位點1）可以用工具軟件，如bioedit2）可以通過生物信息網(wǎng)站，如

1、選用恰當(dāng)?shù)南拗菩院怂醿?nèi)切酶

分析載體上可用的有哪些酶切位點

選擇在MCS上有切點而外源基因上沒有切點的酶

本著經(jīng)濟(jì)實用的原則，盡量選擇常用的酶。最終可

選用EcoRI、BamHI、XbaI。我們以EcoRI和BamHI為

例

2、進(jìn)行引物設(shè)計擴(kuò)增外源基因?qū)τ谝镌O(shè)計的原則和方法，本堂課不作介紹，假設(shè)選用的兩條上下游引物分別是ATACAATTGGTTATGTGTTTTG

和AGCTGATAACAATTGAGCAAG需要做哪些進(jìn)一步的處理？添加酶切序列和保護(hù)堿基，如上游引物加入EcoRI位點，下游加入BamHI位點則需要合成的上游引物變?yōu)?/p>

CGAATTCATACAATTGGTTATGTGTTTTG

TCGGATCCAGCTGATAACAATTGAGCAAG3、PCR擴(kuò)增外源基因，并純化4、進(jìn)行酶切

載體和外源片段需要同時用兩種酶進(jìn)行酶切

根據(jù)所學(xué)的知識，在酶切前我們必須了解哪些信息A、兩種酶對鹽離子的要求如何，分別屬于哪一種酶：高鹽、中鹽、還是低鹽？查詢得知EcoRI為高鹽要求和BamHI為中鹽要求因此我們應(yīng)當(dāng)選擇怎么樣的操作策略？實際上，不同的公司均有自己獨特的緩沖液，并且提供了進(jìn)行雙酶切時使用哪種緩沖液效果較好的數(shù)據(jù)，可以此進(jìn)行

Takara公司為EcoRI提供的是10

×H，為BamHI提供的是10×K///cn根據(jù)Takara公司提供的雙酶切表，我們可以選用K緩沖液進(jìn)行雙酶切4、進(jìn)行酶切

載體和外源片段需要同時用兩種酶進(jìn)行酶切B、酶切溫度的選擇查看兩種酶的最適反應(yīng)溫度，EcoRI的為37℃而BamHI的為30℃可以如何操作？？

5、檢驗酶切是否完全一般酶切2h左右可以酶切完全，若無把握可以先進(jìn)行檢測：

外源片段和載體同時用這兩種酶進(jìn)行酶切，外源片段沒有直觀的檢測指標(biāo)，可以通過載體來檢測。載體主要是環(huán)形的，若酶切完全則變成線性的，同樣大小的環(huán)形和線性片段泳去速度不一樣，故可據(jù)此來判斷是否酶切完全。具體方法：酶切2h后，從載體反應(yīng)管中取少許進(jìn)行電泳，與原始載體進(jìn)行對比。酶切前酶切后若酶切完全則進(jìn)行下一步反應(yīng)若酶切不完全則繼續(xù)延長時間，可以酶切過夜6、完全酶切后分別進(jìn)行純化，用T4DNA連接酶連接純化產(chǎn)物（連接效果不和不好檢測，故一般連接過夜或一定時間后直接進(jìn)行下一步操作）

7、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，在無抗性的培養(yǎng)液中培養(yǎng)約1h（有什么作用？）

8、涂布于固體培養(yǎng)基（如果連接效率不高，可以考慮將菌液全部進(jìn)行涂布：約4000rpm，3-4分鐘后細(xì)菌沉淀于管底，用移液器吸走大部分液體，剩余約100ul，與細(xì)菌混勻，進(jìn)行涂布）

9、篩選

初篩：如何初篩？可以篩選得到？？篩選的目的是？

進(jìn)一步篩選：如何篩選？可以篩選得到？？篩選的

目的是？

最終的確證：什么方法？二、若在上述序列中僅有EcoRI沒有切點，而又想做到定向克隆，有什么方法？提示：1、一個粘端一個平端進(jìn)行：合成外源片段擴(kuò)增引物時，分別加EcoRI位點和SacI（酶切后形成3粘性末端）載體則用SphI（3粘性開端）和EcoRI進(jìn)行酶切。2、兩個粘端：同尾酶的選用，如BglII和BamHI5’NNNNNNGAATTCNNNNNN3’3’NNNNNNCTTAAGNNNNNN5’形成5粘性末端三、將基因B的編碼區(qū)序列與載體pEGFP—N1中的EGFP基因進(jìn)行融合表達(dá)，基因B編碼區(qū)序列如下ATGCGATCGTGAGGCAAAGAAAACCCGGCGCTGAGGCCGGGTTATTCTTGTTCTCTGGTCAAATTATATAGTTGGAAAACAAGGATGCATATATGAATGAACGATGCAGAGGCAATGCCGATGGCGATAGTGGGTATCATGTAGCCGCTTATGCTGGAAAGAAGCAATAACCCGCAGAAAAACAAAGCTCCAAGCTCAACAAAACTAAGGGCATAGACAATAACTACCGATGTCATATACCCATACTCTCTAATCTTGGCCAGTCGGCGCGTTCTGCTTCCGATTAGAAACGTCAAGGCAGCAATCAGGATTGCAATCATGGTTCCTGCATATGATGACAATGTCGCCCCAAGACCATCTCTATGAGCTGAAAAAGAAACACCAGGAATGTAGTGGCGGAAAAGGAGATAGCAAATGCTTACGATAACGTAAGGAATTATTACTATGTAAACACCAGGCATGATTCTGTTCCGCATAATTACTCCTGATAATTAATCCTTAACTTTGCCCACCTGCCTTTTAAAACATTCCAGTATATCACTTTTCATTCTTGCGTAGCAATATGCCATCTCTTCAGCTATCTCAGCATTGGTGACCTTGTTCAGAGGCGCTGAGAGATGGCCTTTTTCTGATAGATAATGTTCTGTTAAAATATCTCCGGCCTCATCTTTTGCCCGCAGGCTAATGTCTGAAAATTGAGGTGACGGGTTAAAAATAATATCCTTGGCAACCTTTTTTATATCCCTTTTAAATTTTGGCTTAATGACTATATCCAATGAGTCAAAAAGCTCCCCTTCAATATCTGTTGCCCCTAAGACCTTTAATATATCGCCAAATACAGGTAGCTTGGCTTCTACCTTCACCGTTGTTCGGCCGATGAAATGCATATGCATAACATCGTCTTTGGTGGTTCCCCTCATCAGTGGCTCTATCTGAACGCGCTCTCCACTGCTTAATGACATTCCTTTCCCGATTAAAAAATCTGTCAGATCGGATGTGGTCGGCCCGAAAACAGTTCTGGCAAAACCAATGGTGTCGCCTTAA簡要步驟1、外源片段的酶切位點分析軟件分析的結(jié)果為：沒有下列酶切位點AatII,AccI,AclI,AflII,AflIII,AhdI,AlwI,AlwNI,ApaI,ApaLI,AscI,AvaIAvrII,BaeI,BaeI,BamHI,BanI,BanII,BbsI,Bce83I,BcefI,BcgI,BcgI,BciVI，BclI,BglI,BglII,BmgI,BmrI,BplI,BplI,BpmI,Bpu1102I,BsaI,BsaAI,BsaHI，BsaWI,BsbI,BseRI,BseSI,BsgI,BsiHKAI,BsmI,BsmAI,BsmBI,BsmFI,Bsp24I，Bsp24I,Bsp1286I,BspEI,BspGI,BspLU11I,BsrBI,BsrFI,BsrGI,BssHII,BssSI，BstAPI,BstDSI,BstXI,BstYI,BstZ17I,Bsu36I,BtrI,CjeI,CjeI,ClaI,DraIII，DrdI,Eco47III,EcoNI,EcoO109I,EcoRI,EcoRV,FseI,FspI,HgaI,HgiEII,HincII，HindIII,HpaI,KpnI,MluI,MspA1I,MunI,NarI,NcoI,NgoAIV,NheI,NotI,NruI，NspI,NspV,PacI,Pfl1108I,PflMI,PinAI,PmeI,PmlI,PshAI,PsiI,Psp5II,PstI，PvuII,RcaI,RleAI,RsrII,SacI,SacII,SalI,SanDI,SapI,SbfI,ScaI,SexAI,SfcISfiI,SgfI,SgrAI,SmaI,SmlI,SnaBI,SpeI,SphI,SrfI,Sse8647I,SspI,StuI,SunI，SwaI,TaqII,TaqII,TatI,Tth111II,XbaI,XhoI,XmnI保護(hù)堿基的情況2、引物