西洋杜鵑組織培養(yǎng)研究

西方杜鵑是杜鵑中最具花的品種，有2000多種。隨著人們生活水平的提高，對(duì)其的需求越來越大。然而，西方杜鵑的傳統(tǒng)繁殖方式很少，繁殖體系較低，阻礙了引進(jìn)西方杜鵑和推廣良種的過程。因此，西方杜鵑的快速繁殖技術(shù)是非常必要的。我國(guó)從80年代初開始杜鵑花組織培養(yǎng)方法的研究,但進(jìn)展較慢,目前僅見楊乃博、陳振光、董春枝等人對(duì)春夏鵑、錦繡杜鵑和西洋杜鵑少數(shù)品種進(jìn)行了研究,且多局限于杜鵑花組織培養(yǎng)再生植株的某些環(huán)節(jié),缺乏進(jìn)一步深層次的研究,缺乏系統(tǒng)性,多篇報(bào)道僅以簡(jiǎn)報(bào)形式出現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)力求從保持品種遺傳特性、避免變異角度考慮,著重研究西洋杜鵑莖尖再生植株技術(shù)環(huán)節(jié),篩選出最優(yōu)技術(shù)參數(shù)組合,建立西洋杜鵑最優(yōu)再生系統(tǒng)。1材料和方法供試材料為四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園林系盆栽1~1.5年生西洋杜鵑。1.1母株預(yù)處理早春摘去西洋杜鵑花芽,促其多萌發(fā)新梢,能夠提供較多的外植體。1.2制備培養(yǎng)低保液取2cm左右長(zhǎng)的新發(fā)幼莖,除去一部分較老葉片,用自來水沖洗2~4h,無菌條件下經(jīng)70%的酒精漂洗15~30s,無菌水沖洗1次,轉(zhuǎn)入0.1%HgCl2溶液消毒6~8min,無菌水沖洗5次,最后放入無菌培養(yǎng)皿中備用。1.3培養(yǎng)基的選擇試驗(yàn)旨在確定合適的基本培養(yǎng)基類型,以MS、改良MS、1/4MS、Read、Anderson5種杜鵑花組培常用的培養(yǎng)基為培養(yǎng)基,附加ZT(0.5),NAA(0.05)。各種培養(yǎng)基均含蔗糖3%,瓊脂0.6%,pH5.4。1.4培訓(xùn)條件溫度25±2℃,光照16h/黑暗8h,光照強(qiáng)度1500~2500lx。2結(jié)果與分析2.1不同基本培養(yǎng)基對(duì)植物基因型的影響基本培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)重要的基質(zhì),由于各種植物的遺傳特性,生物學(xué)特性和生態(tài)學(xué)特性不一樣,因而各種植物需求的營(yíng)養(yǎng)成分也不盡相同,對(duì)培養(yǎng)基成分要求也有差異。因此,選擇合適的培養(yǎng)基類型對(duì)于植物組織培養(yǎng)成敗至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)采用MS(高鹽,NH4+/NO3-=0.5),改良MS(高鹽,NH4+/NO3-=1),1/4MS(低鹽,NH4+/NO3-=0.5),Anderson(中鹽,NH4+/NO3-=0.7)和Read(低鹽,NH4+/NO3-=1)5種比較有代表性的用于杜鵑花組織培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基。盡管這5種培養(yǎng)在許多方面存在差異,但主要的區(qū)別在于培養(yǎng)基的總鹽量及銨態(tài)氮和硝態(tài)氮的比值。結(jié)果表明(表1):基本培養(yǎng)基以Read效果為最好,在該培養(yǎng)基上,外植體不僅生長(zhǎng)良好,還可以分化出較多的幼芽,其次為Anderson,在1/4MS培養(yǎng)基上材料僅能存活,而在改良MS及MS上,外植體葉片變脆、易落,生長(zhǎng)衰弱,瀕臨死亡。分析幾種基本培養(yǎng)基對(duì)西洋杜鵑莖尖分化產(chǎn)生差異的原因,可以認(rèn)為在其它相同條件下,培養(yǎng)基的總鹽分濃度以及NH4+/NO3-比值對(duì)分化效應(yīng)起著關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)中,低鹽分濃度及高比值的NH4+/NO3-適合西洋杜鵑,Read培養(yǎng)基即屬該類型培養(yǎng)基,這和杜鵑花組織培養(yǎng)多選用低含鹽量的培養(yǎng)基的結(jié)論是一致的。外植體生長(zhǎng)勢(shì)中+:好;0:不變;-:差;--:瀕死。2.2洋樹林種子下胚軸為外植體的培養(yǎng)與應(yīng)用效果外植體供體植株的年齡、發(fā)育階段、生長(zhǎng)環(huán)境和外植體取材部位不同可導(dǎo)致外植體生理生化狀態(tài)差異,從而影響組織培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生。杜鵑花組織培養(yǎng)快速繁殖采用的外植體種類較多,包括莖尖、種子、花芽等,即使是同一類型的外植體,結(jié)果也不盡一致。陳云志莖尖培養(yǎng)成功率只有4%~5%,轉(zhuǎn)而采用種子下胚軸為外植體。本試驗(yàn)采用莖尖培養(yǎng),效果較好,與董春枝的錦繡杜鵑莖尖培養(yǎng)結(jié)果相似。在莖尖與莖段對(duì)比試驗(yàn)中,莖尖無論在生長(zhǎng)勢(shì)與分化率方面都較優(yōu)。雖然莖尖與莖段都為同一類型的材料都含芽原基,但效果差異較大,可能因?yàn)榍o尖從形態(tài)結(jié)構(gòu)上比莖段更趨于完整,具有更強(qiáng)的感受態(tài)。吳克賢研究長(zhǎng)白落葉松組培結(jié)果也表明,莖尖分化芽的能力最高,而莖段未出現(xiàn)分化。本試驗(yàn)同時(shí)采用頂芽、側(cè)芽為外植體,結(jié)果表明,頂芽的效果優(yōu)于側(cè)芽,這也和吳克賢的結(jié)論一致。從外觀形態(tài)上看,西洋杜鵑頂芽粗壯,長(zhǎng)勢(shì)旺,側(cè)芽細(xì)小,長(zhǎng)勢(shì)弱些,可以認(rèn)為這兩類外植體在內(nèi)源激素與養(yǎng)分等方面存在異差,其感受態(tài)也不一致,從而影響芽分化。因此,西洋杜鵑組織培養(yǎng)以頂芽莖尖為外植體為好。西洋杜鵑系灌木多叢枝,可提供較多頂芽,完全能夠滿足組織培養(yǎng)所需外植體。2.3最佳不同一月五月內(nèi)容測(cè)定取材季節(jié)對(duì)培養(yǎng)效果也有顯著影響,本試驗(yàn)在3月、5月、7月進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)。在3~5月取材時(shí),植物處于生長(zhǎng)旺盛期,細(xì)胞分裂強(qiáng)裂,帶菌少,表現(xiàn)為外植體粗壯、長(zhǎng)勢(shì)快,易消毒,接種后生長(zhǎng)能力強(qiáng),不容易發(fā)生褐變,反應(yīng)明顯。相反,在7月取材時(shí),頂芽瘦小,外被絨毛多,消毒困難,也容易褐變。因此,最佳取材時(shí)間為3~5月。這與大多數(shù)植物應(yīng)在生長(zhǎng)開始的季節(jié)取材較好,在生長(zhǎng)末期或已進(jìn)入休眠期采樣,外植體在培養(yǎng)中反應(yīng)遲鈍或不能培養(yǎng)成功的結(jié)論是較為一致的。3植物的nh4+NH4+/NO3-比率和總N(鹽)水平有影響器官形成的作用。一般認(rèn)為,硝態(tài)氮作氮源,作用溫和,效果更為理想。所以,絕大多數(shù)培養(yǎng)基配方和絕大多數(shù)植物組織培養(yǎng)所要求的NH4+/NO3-比率較低,甚至不含NH4+。而成功的杜鵑花組織培養(yǎng)幾乎都提高了NH4+水平。其原因是否在于植物對(duì)鹽的吸收是有選擇性的,即一種鹽的陰陽(yáng)離子以不等量進(jìn)入植物體,其結(jié)果勢(shì)必造成細(xì)胞內(nèi)外的電勢(shì)差。植物在選擇吸收離子時(shí)為了維持內(nèi)外電勢(shì)平衡采取以下方式:植物在呼吸中產(chǎn)生的HCO3-和H+和需要的離子進(jìn)行交換,H2O解離成H+和OH-也可用來進(jìn)行離子交換。另一種可能方式是被選擇吸收的離子與外液中H2CO3和H2O解離后的異號(hào)離子(H+,HCO3-,OH-)相伴進(jìn)入植物細(xì)胞。由于離子的選擇吸收