中心性血管化珊瑚石人工骨的血供和吸收情況

目前，珊瑚石人工骨已廣泛應(yīng)用于顱面科和其他領(lǐng)域。天然海倫石仍存在快速分解速度問題。天然珊瑚石人工骨植入后,由于周圍骨組織長入較緩,成骨量有限,降解過快則有可能出現(xiàn)骨不連接的情況。曾有學(xué)者以珊瑚石羥基磷灰石替代,因其不完全降解特性致骨組織替代緩慢,效果亦不甚佳。促進(jìn)新生骨組織生長的前提在于充分的血供支持,研究發(fā)現(xiàn),血管埋入能更好地保證血供,以更有效地發(fā)揮珊瑚石人工骨的骨傳導(dǎo)作用,加速成骨細(xì)胞在腔管中的爬行。本研究即探索一種中心性血管植入的新方法,為構(gòu)建內(nèi)生性血管化珊瑚石人工骨提供理論基礎(chǔ)。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1聯(lián)臂石1.1.2沖洗、去除菌珊瑚石去除表面雜物,清水洗凈后自然晾干。切塊置入5%次氯酸鈉浸泡3次,每次5天,每次浸泡后均先清水沖洗后去離子水振蕩沖洗24h,充分去除孔隙結(jié)構(gòu)內(nèi)殘留有機(jī)成分。置于80℃干燥箱內(nèi)4h。后切割為10mm×8mm×8mm長方形珊瑚石人工骨塊,骨塊縱軸制作一直徑3mm隧道后,縱向劈開骨塊,形成有凹槽的兩塊對應(yīng)骨塊,常規(guī)高溫高壓蒸汽滅菌后備用(圖1)。1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物成年健康清潔級新西蘭兔10只,體重2.5~3kg,雌雄不限。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1人工骨照對照第一模型:骨膜下植入中心性血管化珊瑚石人工骨,對側(cè)骨膜下植入單純珊瑚石人工骨對照;第二模型:皮下植入中心性血管化珊瑚石人工骨,對側(cè)皮下植入單純珊瑚石人工骨對照;第三模型:骨膜下植入中心性血管化珊瑚石人工骨,對側(cè)皮下植入單純珊瑚石人工骨對照。1.3.2中心性血管化模型在全麻下常規(guī)消毒,作兔雙側(cè)后腿內(nèi)側(cè)自腹股溝中點(diǎn)至膝關(guān)節(jié)的縱形切口。解剖雙側(cè)股神經(jīng)血管束,保護(hù)股神經(jīng),游離股動(dòng)脈,分離出右后腿上1/3(A組)及左后腿下1/3(C組)股骨干骨膜下間隙;同時(shí)分離出左后腿上1/3(B組)及右后腿下1/3(D組)皮下間隙。將珊瑚石人工骨塊分別置于A組骨膜下間隙處及B組皮下間隙處,將股動(dòng)脈移入人工骨塊中心隧道內(nèi),保持血流貫通,局部固定(圖2),形成中心性血管化的A組和B組結(jié)果。同法,將單純珊瑚石人工骨塊置于C組骨膜下間隙及D組皮下間隙處并固定,不引入血管,形成C組和D組結(jié)果。第一模型:A、C組組合;第二模型:B、D組組合;第三模型:A、B組組合。三組模型均在同一個(gè)體上建立,可除去個(gè)體差異造成的誤差。1.3.3動(dòng)物分組及模型建立將10只成年健康清潔級新西蘭兔隨機(jī)分為5小組,每小組2只,混合喂養(yǎng),上述方法建立模型,按術(shù)后第1、2、4、8、12周隨機(jī)安樂處死2只動(dòng)物并完成預(yù)計(jì)各項(xiàng)檢查和研究。1.4觀察指標(biāo)和測試方法1.4.1一般觀點(diǎn)1.4.2光顯微鏡下組織碎片的染色定期取出目標(biāo)位置組織塊標(biāo)本予固定、脫鈣、包埋、切片、HE染色后,光鏡下觀察珊瑚石人工骨外層和中心結(jié)構(gòu)中新生組織及血管的生長情況。2期愈合所有動(dòng)物均成活,無發(fā)熱,切口無感染,一期愈合。動(dòng)物活動(dòng)正常,處死前植入物固定良好,無明顯移植排斥反應(yīng),手術(shù)肢體無缺血壞死、活動(dòng)受限及其他相關(guān)障礙。2.1一般觀點(diǎn)珊瑚石人工骨植入后逐步出現(xiàn)纖維組織包繞、長方體邊緣圓滑、表面淺彈坑樣吸收,中心隧道管腔擴(kuò)大等形態(tài)改變提示骨吸收。2.1.1第一個(gè)模型植入后除上述改變外可見新生肉芽組織生成,第4至12周植入物體積無明顯變化,中心性隧道管腔進(jìn)一步增寬。2.1.2植入物基本被吸收至第12周,B、D組植入物均已基本消失,提示B、D組植入物基本被吸收。與既往報(bào)道基本相似。比較第2、4、8周的結(jié)果來看,B組吸收速度較D組更快一些。2.1.3第三模型隨時(shí)間推移,A組植入塊邊緣較B吸收更多,提示A組植入塊邊緣吸收速度更快,中心隧道管腔未見明顯區(qū)別。2.2光顯微鏡下組織碎片的染色術(shù)后1周即出現(xiàn)周圍毛細(xì)血管芽生長,隨時(shí)間推移,新生血管延長增多,管壁逐步發(fā)展為多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)。2.2.1多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)的巖組織發(fā)生A、C組植入物周圍均有毛細(xì)血管芽生長,毛細(xì)血管內(nèi)皮向人工骨內(nèi)爬行,A組中心性血管有毛細(xì)血管肉芽向外生長。第2~4周,A組植入物內(nèi)可見成簇散布單層有空毛細(xì)血管新生及成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞出現(xiàn),第4~8周新生毛細(xì)血管基本充滿全層,珊瑚結(jié)構(gòu)較松散,C組植入物僅周邊部有毛細(xì)血管伸入。第8~12周,A組植入物內(nèi)始出現(xiàn)多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)毛細(xì)血管壁,部分可見管腔,中央側(cè)居多。珊瑚結(jié)構(gòu)松散,有新生骨組織形成(圖3)。第12周,A組植入物內(nèi)毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)已基本構(gòu)成(圖4),珊瑚結(jié)構(gòu)未見。對比來看,A組珊瑚吸收速度及成骨速度均較C組快。2.2.2多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)的中央側(cè)問題B組可見中心性血管及周圍的雙向毛細(xì)血管芽生長。第2~4周,B組植入物內(nèi)成簇散布有單層有孔毛細(xì)血管新生,第4~8周新生毛細(xì)血管基本充滿全層,D組毛細(xì)血管僅存在周邊部。第8周,B組植入物內(nèi)始出現(xiàn)多層復(fù)雜結(jié)構(gòu)毛細(xì)血管壁,管腔可見,中央側(cè)居多。第12周,B組植入物內(nèi)毛細(xì)血管網(wǎng)結(jié)構(gòu)基本構(gòu)成。2.2.3a、b組的組成結(jié)構(gòu)A、B組植入物均有中央及周邊毛細(xì)血管內(nèi)皮爬入,且埋入的中心性血管結(jié)構(gòu)無退化(圖5)。周邊部,A組較B組血管長入稍多,有成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞爬行。第8周,A組珊瑚人工骨基本吸收,新生骨組織形成,而B組則僅成纖維細(xì)胞存在。另外,A組骨膜側(cè)珊瑚吸收速度較B組稍快。C組與D組的比較:二者毛細(xì)血管生長無明顯區(qū)別,但C組可見植入物周邊部(骨膜側(cè))少量新生骨組織,D組內(nèi)未見,其血管化和珊瑚石人工骨吸收情況與既往報(bào)道基本相似。A、B兩組中心性血管化珊瑚石人工骨模型,其新生血管化效率較單純血管上皮組織自周圍長入快。新生血管可見內(nèi)膜、中膜、外膜等一般小血管結(jié)構(gòu),周圍結(jié)締組織成分支持,血管外時(shí)可見成骨細(xì)胞襯覆(圖5),與骨折愈合時(shí)新生骨組織內(nèi)血管結(jié)構(gòu)相似,與正常骨組織中央管及穿通管內(nèi)的小血管結(jié)構(gòu)也基本相似。3建構(gòu)治療人工骨中的血管束分布特點(diǎn),積極推進(jìn)人本研究選用的珊瑚石為中國海南島周圍海域采集的天然濱珊瑚石。比較植入前,觀察珊瑚石人工骨吸收情況。3.1珊瑚石人工骨是一種利用天然珊瑚石的三維多孔結(jié)構(gòu)制成的人工骨替代材料,具有良好的生物降解性和生物相容性。其同時(shí)具有的良好的骨引導(dǎo)作用,能促進(jìn)成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞爬行長入;其生物降解性又能確保及時(shí)被吸收保證新骨組織良好生長。自1985年Souyris等首先報(bào)道了兩種天然珊瑚石人工骨的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床應(yīng)用及1988年Roux報(bào)道珊瑚石人工骨在顱頜面外科中的初步應(yīng)用以來,已有許多學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)的探索和研究,認(rèn)為珊瑚石人工骨是一個(gè)極有發(fā)展?jié)摿Φ墓侨睋p替代材料。珊瑚石的主要成分是碳酸鈣,99%以文石的形式存在,其余1%為有機(jī)成分,主要為氨基酸。近年來,珊瑚石臨床應(yīng)用存在的主要問題是其降解速度過快,可導(dǎo)致局部的骨不連接。針對這個(gè)問題,學(xué)者主要采用以下幾個(gè)方向來解決:其一是尋找合適品種珊瑚石或改變天然珊瑚石/珊瑚羥基磷灰石比例來控制珊瑚石人工骨的降解速度,使其和成骨相符合;另一思路在于通過加快新骨組織生成來避免骨不連接情況發(fā)生的可能。3.2單純珊瑚石人工骨植入后靠周圍血液、組織液滲入和毛細(xì)血管爬入,僅能達(dá)支架內(nèi)100~300μm。如能在珊瑚石人工骨替代支架上實(shí)現(xiàn)更大程度的血管化,則能使成骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞更快長入,具有更好的營養(yǎng)供應(yīng),而形成多點(diǎn)生長的情況,使新骨組織生長速度加快,盡可能與珊瑚石人工骨降解速度相符,更快達(dá)到自身骨組織替代。Cassell總結(jié)生理和病理情況下的機(jī)體血管生長,提出了內(nèi)生性血管化的概念,用于臨床軟組織修復(fù)。毛天球等實(shí)驗(yàn)以環(huán)繞珊瑚石人工骨的血管束法應(yīng)用于組織工程人工骨促進(jìn)了骨組織再生修復(fù)。其目的在于引入機(jī)體血管,提高人工骨內(nèi)局部血管化水平,進(jìn)一步誘導(dǎo)血管新生,以期達(dá)到多點(diǎn)新生肉芽血管生長。3.3就骨替代材料而言,無論是單純的支架植入,還是組織工程骨,其新骨生成速度主要取決于種子細(xì)胞、生長養(yǎng)分、生長空間等因素的影響。這其中,人工骨組織血供情況是重要影響指標(biāo)之一。雖然更大程度的血管化可能出現(xiàn)機(jī)體體液對骨替代支架的侵蝕吸收更加明顯,但同時(shí)其亦可創(chuàng)造更加快速的血管肉芽組織新生,引導(dǎo)更加豐富的成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞生長。是實(shí)現(xiàn)大塊人工骨替代支架植入的關(guān)鍵問題。3.4本實(shí)驗(yàn)為珊瑚石人工骨中心性血管化的預(yù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,中心性血管化珊瑚石人工骨在生理和結(jié)構(gòu)上具有更好的血供和成骨效果,基本上達(dá)到了多點(diǎn)新生的要求,植入后的血管未見明顯的退化,且新生的血管與正常骨組織新生及創(chuàng)傷后新生的血管無明顯差異,證明中央性血管束引入珊瑚石人工