酵母雙雜交系統(tǒng)的建立與應(yīng)用

1989年，stanny字段s和kunukayu首次提出了這一系統(tǒng)，以分析葡萄酒中物質(zhì)和物質(zhì)的相互作用。他們是在利用釀酒酵母GAL4蛋白的特性來研究蛋白質(zhì)間相互作用的過程中建立的這種全新的方法。酵母雙雜交系統(tǒng)自建立已有15a年的歷史,已經(jīng)逐步發(fā)展成一個較完善的分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的系統(tǒng),并基于原初的基本原理衍生了一系列類似的系統(tǒng):酵母單雜交系統(tǒng)、反向雙雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng),還有人預(yù)測,將來還可能出現(xiàn)四雜交系統(tǒng)。自酵母雙雜交系統(tǒng)創(chuàng)建以來,已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)相互作用的重要手段,并揭示了大量未知蛋白質(zhì)之間的相互作用。如今,這一研究蛋白質(zhì)間相互作用及蛋白質(zhì)與其他大小分子間相互作用的系統(tǒng),已經(jīng)比較廣泛地運用到了諸如分子生物學(xué)基礎(chǔ)研究、蛋白質(zhì)組與功能基因組研究、疾病機理分析與藥物篩選等多個領(lǐng)域中。下面就基本原理、操作程序、系統(tǒng)衍生、應(yīng)用進展、存在問題及發(fā)展前景等方面簡要地闡述。1活轉(zhuǎn)錄的基因酵母雙雜合系統(tǒng)是在1989年由StanleyFields和Ok-kyuSong建立,利用的是GAL4蛋白的性質(zhì)。該系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的,即這些因子往往由2個或2個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。GAL4蛋白是1個基因轉(zhuǎn)錄激活子(由它激活轉(zhuǎn)錄的基因可以編碼半乳糖苷酶)。它包括2個分離的功能性結(jié)構(gòu)域:1個能結(jié)合特異DNA序列(UASG)的N末端結(jié)構(gòu)域和1個包含酸性區(qū)域的C末端結(jié)構(gòu)域,它是轉(zhuǎn)錄激活所必需的。雙雜交系統(tǒng)是這樣建立的:GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,與X蛋白質(zhì)融合;GAL4的激活結(jié)構(gòu)域,與蛋白質(zhì)Y融合;X和Y形成一個蛋白質(zhì)復(fù)合物,重新形成GAL4結(jié)構(gòu)域的鄰近效應(yīng),即實現(xiàn)了轉(zhuǎn)錄因子功能重建,導(dǎo)致UASG調(diào)控的基因(報告基因)開始轉(zhuǎn)錄。他們當(dāng)時還用2種已知的能與SNF1和SNF4互作的酵母蛋白質(zhì)檢驗了這個系統(tǒng),只有當(dāng)2個融合蛋白都出現(xiàn)在1個細胞中時才能獲得高的轉(zhuǎn)錄活性。它首先主要用于研究相互作用蛋白質(zhì)的初步鑒別,而不是各種相互作用的具體特征?，F(xiàn)在拓展或衍生出的各個相關(guān)的系統(tǒng)都是基于這個最基本的原理的。在這以前,也有許多生物化學(xué)方法用來研究蛋白質(zhì)間相互作用,但都是在體外研究,該系統(tǒng)可以在酵母這種生長迅速且易操作的體系中研究真核細胞的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,且通過cDNA文庫篩選直接找到與未知蛋白質(zhì)相互作用的蛋白基因。2誘導(dǎo)蛋白構(gòu)建酵母雙雜交系統(tǒng)與其衍生系統(tǒng)的操作程序是類似的,其基本操作程序大體包括以下幾個步驟:①選擇合適酵母作為篩選未知蛋白的受體菌;②誘餌蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定;③誘餌蛋白自身轉(zhuǎn)錄活性分析;④獵物蛋白cDNA文庫的構(gòu)建;⑤酵母雙雜交篩選與陽性克隆鑒定。這是篩選相互作用蛋白的基本步驟,如果需要利用雙雜交進行其他方面的研究,可根據(jù)不同試驗?zāi)康倪M行相應(yīng)地調(diào)整。3酵母雙雜交系統(tǒng)和細胞系統(tǒng)1989年由StanleyFields和Ok-kyuSong等提出并首次建立酵母雙雜合系統(tǒng),該系統(tǒng)是在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中研究蛋白質(zhì)間相互作用的一種非常有效的分子生物學(xué)方法。1992年,Fearon等在CHO細胞中作了雙雜交分析,他們選擇的報告基因是編碼細胞表面的抗原基因和抗藥性基因。其原理與酵母雙雜交系統(tǒng)相似,但技術(shù)要求更高。1993年,發(fā)展出一種研究蛋白質(zhì)和DNA相互作用的實驗體系,稱為酵母單雜交系統(tǒng)(one-hybridsystem)。與雙雜交系統(tǒng)不同之處在于轉(zhuǎn)錄激活域AD相融合的待篩選蛋白質(zhì)Y直接與DNA結(jié)合位點相結(jié)合,使AD直接激活啟動子下游報告基因的表達。這一過程無需BD-X的參與,因而通過對AD-Y文庫的篩選可分離出與靶DNA序列直接作用的蛋白質(zhì)Y。該系統(tǒng)為轉(zhuǎn)錄因子的分離鑒定提供了有效的實驗手段。1995年,LeDouarin等又構(gòu)建了一套新的雙雜交系統(tǒng),用URA3基因作為報告基因,通過在培養(yǎng)基中添加6-氮尿嘧啶(URA3基因產(chǎn)物的抑制劑),可以定量測定產(chǎn)物乳清酸-5-單磷酸脫羧酶的活性,比LacZ基因表達在含X-gal的培養(yǎng)基上生長的顏色反應(yīng)更為精確。1996年,Vidal等建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng),為這一領(lǐng)域的研究提供了有效的途徑:這是一項鑒定阻斷蛋白間相互作用的技術(shù)。其關(guān)鍵是報道基因的表達產(chǎn)物對細胞生長有抑制作用。這樣當(dāng)DNA的BD和AD的融合蛋白相互作用時,表達出有毒性的報道蛋白,細胞不能生長。Vidal等建立的酵母細胞株中,其Ura3的表達由含GAL4結(jié)合位點的啟動子嚴(yán)密控制,此細胞株在缺乏尿嘧啶的培養(yǎng)基中需GAL4的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的融合蛋白相互作用,使URA3表達。其產(chǎn)物為合成尿嘧啶所必需,因此細胞能夠存活。但此產(chǎn)物同時能催化5-氟乳清酸轉(zhuǎn)化為5-氟尿嘧啶,所以在含5-氟乳清酸的完全培養(yǎng)基中則受GAD和GBD融合蛋白相互作用的抑制。Vidal等還設(shè)計了反向單雜交系統(tǒng),他們將野生型p53與其結(jié)合位點結(jié)合,激活Ura3,產(chǎn)生毒性物質(zhì),使細胞死亡;當(dāng)p53基因突變時,諸如R175H和R249S,則不能與其結(jié)合位點結(jié)合,使報告細胞株存活。1996年,美國威斯康辛大學(xué)SenGupta等為了研究蛋白質(zhì)與RNA的相互作用設(shè)計了三雜交系統(tǒng)?；驹頌闃?gòu)建3個雜交體:其中1個雜交體是BD與1個位點特異的RNA結(jié)合蛋白融合,可結(jié)合到報告基因上;第2個雜交體是RNA(Y),含有“誘餌”順序,且可結(jié)合到BD融合的蛋白質(zhì)上;第3個雜交體是與AD融合的X蛋白。若X蛋白能與RNA結(jié)合,則AD靠近報告基因,使其激活。1997年,Aronheim等建立的SOS招募系統(tǒng)(SOSrecruitmentsystem,SRS)就是一個典型的代表。該系統(tǒng)中蛋白的相互作用發(fā)生在膜上。它通過待測蛋白的相互作用,將SOS蛋白帶到細胞膜上,激活附近的RAS蛋白。從而打通RAS信號途徑,使RAS途徑不通的菌株得以生存。1998年,Karimova等設(shè)計了細菌雙雜交系統(tǒng)。它利用了cAMP的正調(diào)控信號傳導(dǎo)途徑重建的原理,將2個蛋白質(zhì)分別與2個功能互補片段T25和T18融合(T25和T18互補構(gòu)成腺苷酸環(huán)化酶的催化功能域),2個雜交質(zhì)粒在腺苷酸環(huán)化酶缺陷的大腸桿菌中可相容,若2個雜交蛋白相互作用,使T25和T18相互靠近,功能互補,導(dǎo)致cAMP的合成,而cAMP可觸發(fā)一些cAMP/CAP依賴的啟動子的活化,使報告基因轉(zhuǎn)錄。該系統(tǒng)的優(yōu)點是細菌有更高的轉(zhuǎn)化效率,可以分析更為復(fù)雜的文庫,也可以對更大的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)作綜合性分析。近年來酵母雙雜交系統(tǒng)也有所發(fā)展,主要朝著精確化自動化規(guī)?；较虬l(fā)展,其應(yīng)用領(lǐng)域也在不斷拓展。4蛋白—主要應(yīng)用研究進展酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)平臺,隨著該系統(tǒng)的不斷完善和拓展,其應(yīng)用范圍已擴展到蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與DNA、蛋白質(zhì)與RNA以及蛋白與其他小分子間相互作用的研究,如今也開始運用該系統(tǒng)進行高通量篩選相互作用蛋白及其他相關(guān)分子。其應(yīng)用進展主要表現(xiàn)在以下幾個方面。4.1酵母共聚體對ipac為抑制劑的微生物耐藥該系統(tǒng)自建立以來已經(jīng)用來研究了許多種重要蛋白質(zhì)間的相互作用,包括:檢測蛋白質(zhì)間的相互作用,確定相互作用位點,確定與已知蛋白相互作用的未知蛋白等。閻曉宇等利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選到與痢疾桿菌侵襲素IpaC相互作用的真核細胞蛋白質(zhì),得到的陽性克隆中有2個編碼人膠原酶蛋白片段,提示IpaC可能在膠原酶參與的生物學(xué)過程中發(fā)揮作用。PeterUetz等運用2個大規(guī)模酵母雙雜交系統(tǒng),鑒別從釀酒酵母基因序列中預(yù)測到的全長開放閱讀框編碼的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用。他們運用了文庫篩選和列陣篩選2種方法,前者效果較好,而后者具有高通量的特點。4.2種功能已經(jīng)成功的的分子中,增加了釀酒酵母的擴增培養(yǎng),篩選n該系統(tǒng)在蛋白質(zhì)組研究上的應(yīng)用可以說尚處于初級階段,嘗試較多。但已顯示其在分析鑒定細胞內(nèi)復(fù)雜的蛋白質(zhì)相互作用方面的潛力。Fromont-Racine等在研究剪接因子與其他因子的相互作用的過程中以10種功能已知的與mRNA前體剪接有關(guān)的蛋白質(zhì)作“誘餌”蛋白,從含有約5×106個克隆的釀酒酵母基因組文庫中進行篩選(這些基因組DNA與AD的基因融合構(gòu)成“獵物”表達載體)。根據(jù)分析把從中得到的靶蛋白做成新的“誘餌”蛋白再進行篩選。經(jīng)過3輪篩選后,他們從中得到約700個陽性克隆。這些篩選到的靶蛋白中,有9種是已知的mRNA前體剪接因子,5種是新發(fā)現(xiàn)的剪接因子,8種是與RNA其他加工過程有關(guān)的因子。由此可見,該系統(tǒng)不但可用來在體內(nèi)檢驗蛋白質(zhì)間的相互作用,而且還能用來發(fā)現(xiàn)新的作用蛋白質(zhì),從而認識蛋白質(zhì)組中特定代謝途徑內(nèi)的蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò),為建立生物體的蛋白質(zhì)圖譜提供條件。4.3酵母細胞內(nèi)信號蛋白的調(diào)節(jié)在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中,蛋白質(zhì)間或蛋白質(zhì)與其他分子間的相互作用是重要的信號傳遞形式。酵母雙雜交系統(tǒng)在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)研究中能較全面真實地反映細胞內(nèi)信號蛋白的網(wǎng)絡(luò)性聯(lián)系與調(diào)節(jié),故有重要的應(yīng)用價值。選擇不同的細胞代謝或信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑為出發(fā)點,通過類似的雙雜交實驗也有可能建立酵母細胞完整的蛋白質(zhì)聯(lián)系圖譜。BryanCBarnhart等研究認為,死亡效應(yīng)器結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)家族可以用來作為癌癥治療的靶標(biāo),因為這個蛋白質(zhì)家族能通過與其他分子(包括蛋白質(zhì))的相互作用對細胞存亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進行調(diào)控。4.4hcv與ns5a自酵母雙雜交系統(tǒng)建立以來,其在病毒學(xué)研究中的應(yīng)用越來越廣泛和重要。通過酵母雙雜交等技術(shù),很多病毒蛋白與宿主蛋白間的相互作用已被確定。丙型肝炎病毒HCV至今沒有有效的病毒培養(yǎng)系統(tǒng),還必須應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)克隆來進行相關(guān)研究。ShiS.T.等通過對HepG2和人肝cDNA文庫的酵母雙雜交篩選到apoAl—一個高密度脂蛋白成分,與NS5A相互作用,提示NS5A參與脂代謝紊亂的病理過程,可以解釋HCV感染后普遍存在的肝臟脂肪變性。植物病毒學(xué)中研究的對象多是單鏈正義RNA病毒。宿主蛋白與病毒編碼的蛋白間的互作,影響植物的生長發(fā)育。聯(lián)體病毒居成員蛋白AL1起始病毒DNA復(fù)制,調(diào)節(jié)自身表達和誘導(dǎo)植物基因轉(zhuǎn)錄。用YTHS篩選和1個桿狀病毒居成員蛋白互作的系統(tǒng)鑒定與AL1互作的植物宿主蛋白,結(jié)果顯示與AL1互作的蛋白有1個絲氨酸和蘇氨酸激酶,1個驅(qū)動蛋白,1個組蛋白H3,從而證明AL1也參與了植物細胞分裂和發(fā)育。4.5酵母雙雜交隨機肽庫酵母雙雜交技術(shù)突出的優(yōu)點是可以用“X”蛋白作為“誘餌”,從基因文庫中去篩選所有能與“X”蛋白質(zhì)結(jié)合的任何“Y”蛋白質(zhì)及其基因。可以利用此種技術(shù),尋找與病毒或細菌蛋白相結(jié)合的肽段,從而設(shè)計并產(chǎn)生新的抗菌肽或抗毒肽。胡承香等通過將隨機DNA片段與GAL4的AD融合構(gòu)建酵母表達載體,而成功構(gòu)建了一個可篩選、擴增的酵母雙雜交隨機肽庫,可用于篩選和設(shè)計靶蛋白相互作用多肽(主要用于藥物篩選設(shè)計)。酵母雙雜交系統(tǒng)的篩選發(fā)生于酵母細胞內(nèi),對胞內(nèi)蛋白而言,應(yīng)用此系統(tǒng)更能保持靶蛋白的天然構(gòu)象和功能,如此篩選獲得的多肽具有生物活性的可能性更大。此技術(shù)已逐漸被應(yīng)用于篩選新型的具有生物活性的肽類藥物、診斷試劑和其他功能性多肽?，F(xiàn)在,能抑制SrcSH2結(jié)構(gòu)域并能和配體相互作用的小分子已經(jīng)開發(fā)并用來治療骨質(zhì)疏松癥,特別是抑制破骨細胞再吸收。但在設(shè)計這些小分子抑制劑和調(diào)節(jié)劑的過程中遇到了一個歷史性挑戰(zhàn):這些組件式的結(jié)構(gòu)域在各自家族內(nèi)高度同源,難以開發(fā)一種針對一個特定相互作用的高度特異性抑制劑。FrankBecker等利用三雜交方法在蛋白質(zhì)組中篩選出小分子激酶抑制劑,因為各種已知的CDK抑制劑,包括嘌呤和茚并吡唑類似物,都以基于甲氨蝶呤的雜交配體的形式在cDNA文庫或基于酵母細胞列陣的篩選中展示,可以使細胞循環(huán)中的激酶的靶標(biāo)被鑒別出。證明這種三雜交系統(tǒng)可以用來尋找藥物靶標(biāo)。4.6hbxag和tbp1的相互作用許多疾病的發(fā)生都與分子間的相互作用有很大關(guān)系。用酵母雙雜交系統(tǒng)研究這些分子間的相互作用有助于闡明許多疾病發(fā)生的機理,進而為疾病治療提供理論依據(jù)。Barak等研究了HBxAg和人免疫缺陷病毒(HIV)的Tat結(jié)合蛋白1(Tbp1)的相互作用,應(yīng)用基于胞質(zhì)的酵母雙雜交篩選鑒定出Tbpl,一個新的與HBxAg相互作用蛋白。Tbpl在酵母和動物細胞內(nèi)均和HBxAg有相互作用。HBxAg和Tbpl相互作用具有功能性意義調(diào)節(jié)HBV轉(zhuǎn)錄。Tbpl同源物如Sugl,是蛋白酶19S調(diào)節(jié)帽顆粒的已知成員,涉及轉(zhuǎn)錄共激活。Tbpl和Sugl與多重病毒效應(yīng)蛋白包括HIVTat、SV40大T抗原和腺病毒E1A作用,而這些蛋白是病毒癌基因的重要表位。4.7ssc113對dna的復(fù)制特性的分析分子生物學(xué)發(fā)展非常迅速,但仍有許多基礎(chǔ)性理論和應(yīng)用問題還沒有研究清楚,有關(guān)于各個相關(guān)生物大小分子間的相互作用的問題可以用酵母雙雜交系統(tǒng)來研究。RahulSharma等研究認為,大腸桿菌宿主編碼的DnaA起始因子蛋白的N末端結(jié)構(gòu)域I和C末端結(jié)構(gòu)域IV都與pSC101的質(zhì)粒編碼的RepA起始因子相互作用。在體外與DnaA相互作用的是RepA的N末端區(qū)域不是C末端區(qū)域。這些相互作用對復(fù)制起始的前兩步即起始點解鏈和解旋酶的產(chǎn)生起關(guān)鍵作用。RepA的結(jié)構(gòu)域I和IV都不能獨自啟動pSC101復(fù)制。然而當(dāng)這兩個結(jié)構(gòu)域在一個共同的細胞環(huán)境中共表達并且能通過一對亮氨酸拉鏈非共價互作時,質(zhì)粒才能在體內(nèi)復(fù)制。研究結(jié)果顯示:DnaA的結(jié)構(gòu)域I和IV的共價或非共價物理連接和它們與RepA的相互作用,都對復(fù)制起始起關(guān)鍵作用。這個結(jié)果可以用來建立一個新的細菌雙雜交系統(tǒng)。Fraldi等通過雙雜交及三雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)了CycT1與CDK9及Tat/TAR特異的結(jié)合位點,這些發(fā)現(xiàn)提示可設(shè)計一個正確的位點缺失的P-TEFb復(fù)合物干擾Tat的功能。5蛋白質(zhì)間相互作用引起的檢測酵母雙雜交系統(tǒng)由于具有敏感性、簡潔性、真實性和廣泛性等優(yōu)點而被應(yīng)用到許多方面的研究,但該系統(tǒng)還是有它自身的局限性的。首先,它不能用于任何蛋白質(zhì)間相互作用的分析,對于篩選對象和范圍,必須有一個選擇,各種雙雜交系統(tǒng)和衍生的雜交系統(tǒng)都有一定的適用范圍。其次,假陽性的存在,即通過雙雜交觀察到的蛋白質(zhì)的相互作用在真實情況下不一定發(fā)生,必須考慮到假陽性因素(沒有發(fā)生相互作用就能引起陽性反應(yīng))的排除。再次,假陰性也是存在的,主要原因是某些蛋白不