小麥erf轉(zhuǎn)錄因子w17互作蛋白的酵母雙雜技術(shù)篩選及互作驗(yàn)證

各種植物疾病和其他生物生境，以及干旱和高鹽等非生物生境，嚴(yán)重影響了植物的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。研究植物對(duì)逆境信號(hào)的感知、傳遞以及適應(yīng)性響應(yīng)的分子機(jī)制,對(duì)于闡明植物適應(yīng)逆境機(jī)制,提高作物抗性有著重要的意義。植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成了一套復(fù)雜而精細(xì)的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò),能對(duì)外界脅迫信號(hào)產(chǎn)生一系列應(yīng)答響應(yīng),誘導(dǎo)抗逆相關(guān)基因的表達(dá),保護(hù)細(xì)胞正常的生命活動(dòng)。其中,轉(zhuǎn)錄因子(transcriptionfactor,TF)對(duì)信號(hào)傳遞和基因的表達(dá)調(diào)控起非常重要的作用。植物體內(nèi)存在大量的轉(zhuǎn)錄因子,擬南芥(Arabidopsisthaliana)中有5.9%的基因編碼轉(zhuǎn)錄因子,根據(jù)DNA結(jié)構(gòu)域的特點(diǎn)將轉(zhuǎn)錄因子分成若干個(gè)家族,如WRKY、AP2/EREBP、MYB和bZIP。AP2/EREBP家族是植物中分布最為廣泛且研究比較深入的一類轉(zhuǎn)錄因子,包括AP2、RAV、DREB、ERF和AL0793495個(gè)亞族。ERF轉(zhuǎn)錄因子是AP2/EREBP家族中最大的一個(gè)亞族,參與GCC-box和DRE/CRT順式元件的調(diào)控,介導(dǎo)植物生物和非生物兩條脅迫信號(hào)傳遞途徑,在脅迫相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控中起重要作用。例如,煙草的Tsi1和辣椒的CaPF1蛋白能夠結(jié)合GCC-box和DRE/CRT元件,誘導(dǎo)PR基因(PR1、PR2、PR3、osmotin、SAR8.2)和RD/COR基因(COR47、COR6.6、COR78/RD29)的表達(dá),從而提高植株的抗性。ERF基因在提高植物抗病性和非生物脅迫抗性上發(fā)揮著重要作用。據(jù)報(bào)道,煙草Tsi1基因的超表達(dá)提高了辣椒對(duì)細(xì)菌和病毒的抗性;轉(zhuǎn)大麥HvRAF基因的擬南芥植株增強(qiáng)了對(duì)青枯病的抗病力;大豆GmERF057基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)細(xì)菌、鹽和干旱的抗性;JERF1和JERF3基因提高了轉(zhuǎn)基因煙草的抗鹽、抗旱和抗寒性;將辣椒的CaPF1基因轉(zhuǎn)到弗吉尼亞松(PinusvirginianaMill.)中,提高了轉(zhuǎn)基因樹(shù)木對(duì)重金屬、高溫和病原菌等多種抗性,而且明顯增加了植株生長(zhǎng)高度;轉(zhuǎn)小麥TaERF1基因的擬南芥提高了對(duì)低溫、干旱、高鹽以及灰霉病(Botrytiscinerea)的抵抗力,轉(zhuǎn)TaERF1基因的煙草增加了植株的抗鹽性和對(duì)野火病(Pseudomonassyringae)的抗病性。解析逆境脅迫信號(hào)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)已經(jīng)成為當(dāng)前植物逆境應(yīng)答反應(yīng)分子機(jī)制研究的熱點(diǎn)。過(guò)去幾年,對(duì)ERF基因的研究主要集中在可能介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑、對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控和功能上,而對(duì)ERF蛋白的作用模式,包括與其他蛋白的互作機(jī)制研究甚少。轉(zhuǎn)錄因子的活性受許多因素的影響,如轉(zhuǎn)譯后修飾以及與其他蛋白之間的相互作用。例如,擬南芥細(xì)胞核提取物能增強(qiáng)擬南芥GBF1轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合能力。因此,研究轉(zhuǎn)錄因子的互作蛋白及其功能,對(duì)于研究轉(zhuǎn)錄因子的作用機(jī)制和抗逆相關(guān)基因的調(diào)控具有重要的意義。小麥?zhǔn)俏覈?guó)的重要糧食作物,生物和非生物脅迫嚴(yán)重影響著小麥的產(chǎn)量和品質(zhì)。我們從小麥中克隆了一個(gè)ERF基因W17,受干旱、脫落酸(ABA)和乙烯等誘導(dǎo),可顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的抗旱性和抗病性;W17蛋白具有核定位功能,可通過(guò)自身的NLS進(jìn)入核內(nèi)行使功能。為了進(jìn)一步研究W17的作用機(jī)制,本文采用酵母雙雜交技術(shù),以W17作為“誘餌”蛋白,從小麥cDNA文庫(kù)中篩選互作蛋白,為進(jìn)一步解析ERF蛋白的作用機(jī)制提供依據(jù)。1材料和方法1.1小麥葉片rna提取及pcr擴(kuò)增將普通小麥(TriticumaestivumL.)品種小白麥播種在苗床上,20~24℃生長(zhǎng)10d左右,從土壤中取出用蒸餾水沖洗干凈,放在濾紙上干旱處理2h,取葉片立即放入液氮中,并保存在–80℃條件下準(zhǔn)備提取RNA。采用Trizol法(TianGen,北京)提取小麥葉片總RNA,第一鏈cDNA合成用反轉(zhuǎn)錄酶XL(AMV)(TaKaRa,大連)。采用SMART法(BD)合成dscDNA取2μLcDNA在100μL體系中進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)為24,延伸時(shí)間為6min。擴(kuò)增結(jié)束后取PCR產(chǎn)物5μL在1.0%瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)。1.2質(zhì)粒pmg7-w17的酶切位點(diǎn)鑒定根據(jù)W17基因的序列及pGBKT7(Clontech,美國(guó))的克隆位點(diǎn),在基因的兩端分別引入EcoRI和BamHI(Promega,美國(guó))酶切位點(diǎn)。酶切、連接(T4連接酶,Promaga,美國(guó))到質(zhì)粒pGBKT7。測(cè)序驗(yàn)證融合質(zhì)粒pGBKT7-W17克隆正確。將pGBKT7-W17、空pGBKT7以及陰性對(duì)照分別與pGADT7共同轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中,SD/–Trp/–Leu(Sigma,德國(guó))和SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade(Sigma,德國(guó))平板篩選培養(yǎng),驗(yàn)證pGBKT7-W17是否具有自激活活性。1.3ah109感受態(tài)細(xì)胞的制備采用酵母雙雜交系統(tǒng)(Clontech,美國(guó)),按說(shuō)明書(shū)(MATCHMAK2ERpLexATwo-HybridUserManual和YeastProtocolsHandbook)方法制備AH109感受態(tài)細(xì)胞,將pGBKT7-W17質(zhì)粒、pGADT7和小麥文庫(kù)混合轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞AH109。1.4改性藍(lán)色克隆的構(gòu)建誘餌載體BD質(zhì)粒pGBKT7帶有Trp篩選標(biāo)記,AD質(zhì)粒pGADT7帶有Leu篩選標(biāo)記。將pGBKT7-W17、pGADT7和文庫(kù)質(zhì)?；旌限D(zhuǎn)化AH109,涂布于SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade營(yíng)養(yǎng)缺陷型平板,30℃培養(yǎng)3~5d,用牙簽挑取直徑大于2mm的陽(yáng)性克隆,然后在SD/Raf/Gal/X-gal(Sigma,德國(guó))平板上畫(huà)線培養(yǎng),篩選藍(lán)色克隆。1.5替代pgpcr檢測(cè)、序列和分析1.6酵母菌種的生長(zhǎng)按前述方法制備酵母AH109感受態(tài)細(xì)胞。采用共轉(zhuǎn)化方法將pGBKT7-W17以及連有可能互作基因的pGBKT7-W17pGADT7質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞中。將轉(zhuǎn)化后的酵母劃線于SD/–Trp/–Leu平板上。若酵母菌株在SD/–Trp/–Leu平板上生長(zhǎng)則證明誘餌載體和可能的互作質(zhì)粒載體均已轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中。挑取SD/–Trp/–Leu平板上生長(zhǎng)的單克隆菌株于1mLYPDA液體培養(yǎng)基中。在30℃下振蕩培養(yǎng)2d后,吸取1μL酵母菌液點(diǎn)到SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade/X-α-gal平板上。將平板置于30℃培養(yǎng)3~4d后長(zhǎng)出藍(lán)色菌落組合為互作陽(yáng)性結(jié)果。2結(jié)果與分析2.1ssna擴(kuò)增所提取的小麥總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)分析,A260/A280=1.85。1%瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)28S和18S的清晰RNA條帶,而且28SRNA是18SRNA的2倍左右(圖1),表明獲得的總RNA純度及濃度較高,可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。用3μL總RNA為模板合成cDNA,取2μLcDNA進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增dscDNA。合成的dscDNA質(zhì)量較好,主要集中在250~2000bp之間(圖2),可以用于cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。2.2營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株的篩選將W17基因全長(zhǎng)克隆到誘餌載體pGBKT7中得到重組質(zhì)粒pGBKT7-W17。經(jīng)酶切(圖3)并測(cè)序鑒定,W17基因已成功插入質(zhì)粒pGBKT7中。為檢測(cè)重組質(zhì)粒是否具有自激活活性,將pGBKT7-W17、空pGBKT7以及陰性對(duì)照分別與pGADT7共同轉(zhuǎn)入酵母菌株AH109中,SD/–Trp/–Leu和SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade平板篩選培養(yǎng)2~3d(圖4),除陰性對(duì)照外在SD/–Trp/–Leu平板上都能長(zhǎng)出菌落,在SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade平板上都沒(méi)有長(zhǎng)出菌落,說(shuō)明pGBKT7-W17沒(méi)有自激活活性,可以在營(yíng)養(yǎng)缺陷型SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade平板篩選培養(yǎng)上用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選小麥cDNA文庫(kù)。2.3營(yíng)養(yǎng)缺陷型sd/–trp/–ade平板的篩選結(jié)果將“誘餌”質(zhì)粒pGBK-W17、文庫(kù)質(zhì)粒pGADT7混合轉(zhuǎn)化AH109,涂布于營(yíng)養(yǎng)缺陷型SD/–Trp–Leu/–His/–Ade平板,30℃培養(yǎng)3~5d,選擇直徑大于2mm的菌落,共得到160個(gè)候選克隆(圖5-A)。牙簽挑取候選克隆,在SD/Raf/Gal/X-gal平板上畫(huà)線培養(yǎng),大約1/5的陽(yáng)性克隆顯藍(lán)色(圖5-B)。2.4酵母質(zhì)粒pcr和dh5檢測(cè)將顯藍(lán)的克隆進(jìn)行PCR檢測(cè),檢測(cè)結(jié)果顯示插入片段多數(shù)大小不一,但是大多數(shù)集中在500~2000bp(圖6),說(shuō)明cDNA文庫(kù)的質(zhì)量較好。克隆10和克隆11有2條PCR擴(kuò)增帶,可能有2個(gè)質(zhì)粒被轉(zhuǎn)到酵母細(xì)胞,需要進(jìn)一步鑒定。將擴(kuò)增帶大于500bp的酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序結(jié)果提交到GenBank進(jìn)行BLAST分析。結(jié)果表明,克隆到的基因主要分為脅迫相關(guān)功能基因、翻譯后修飾蛋白、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)大亞基/小亞基以及功能未知蛋白4類。部分測(cè)序結(jié)果及其可能的功能見(jiàn)表1。2.5營(yíng)養(yǎng)缺陷型sd/–trp/–his/—蛋白的互作驗(yàn)證將誘餌和候選蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞,在營(yíng)養(yǎng)缺陷型SD/–Trp/–Leu平板上劃線培養(yǎng),挑取單菌落搖菌,吸取1μL點(diǎn)至SD/–Trp/–Leu平板上。酵母在SD/–Trp/–Leu平板上生長(zhǎng)證明互作組合蛋白均轉(zhuǎn)化入酵母細(xì)胞中。再吸取1μL菌液點(diǎn)在營(yíng)養(yǎng)缺陷型SD/–Trp/–Leu/–His/–Ade/X-α-gal平板上培養(yǎng),結(jié)果顯示HSP90和PPR的菌落能正常生長(zhǎng)且菌落顯藍(lán)色(圖7)。這一結(jié)果初步證實(shí)HSP90和PPR蛋白與W17發(fā)生了相互作用。3hsp29基因家族在信號(hào)傳遞中的作用酵母雙雜交系統(tǒng)(yeasttwo-hybridsystem)快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用及分離新的與已知蛋白作用的配體及其編碼基因。酵母雙雜交系統(tǒng)雖然仍有一定的局限性,如要求蛋白間的相互作用定位于細(xì)胞核內(nèi);同時(shí)該系統(tǒng)不適用某些需經(jīng)過(guò)翻譯后加工才能相互作用的蛋白,但仍然是從cDNA文庫(kù)中尋找新的互作蛋白的一種快捷有效的方法。本研究構(gòu)建了小麥cDNA文庫(kù),用酵母雙雜交技術(shù)篩選到4類與ERF轉(zhuǎn)錄因子W17相互作用的候選蛋白,為深入研究W17的抗逆機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。早期研究表明,ERF基因家族介入了乙烯信號(hào)調(diào)控途徑,但近幾年的研究發(fā)現(xiàn)乙烯、茉莉酸、水楊酸和ABA等幾種重要的信號(hào)分子傳遞途徑都參與了對(duì)ERF基因家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)控[18,19,20,21,22,23,24]。因此,ERF轉(zhuǎn)錄因子家族可能在乙烯、茉莉酸、水楊酸和ABA信號(hào)傳遞途徑中處于核心位置,參與對(duì)不同信號(hào)的傳遞和對(duì)下游基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。目前,對(duì)ERF基因家族在不同信號(hào)傳遞中的作用以及信號(hào)傳遞涉及到的蛋白尚不清楚。許多ERF蛋白功能的發(fā)揮需要轉(zhuǎn)錄后修飾或參與蛋白間的互作,包括轉(zhuǎn)錄因子、腈水解酶和泛素連接酶等。因此,篩選W17互作蛋白、構(gòu)筑互作圖譜、分析互作機(jī)制對(duì)揭示W(wǎng)17基因在不同信號(hào)傳遞中的作用及其轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控具有的重要意義。本研究獲得的W17互作蛋白的大部分都與植物的抗逆、基因表達(dá)調(diào)控有關(guān)。HSP90是一類大量存在且高度保守的分子伴侶在細(xì)胞的生長(zhǎng)進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。葉綠體特異性的HSP90-5突變導(dǎo)致擬南芥對(duì)紅光應(yīng)答、氯酸鹽抗性的改變和cr88突變體中組成型的葉綠體發(fā)育的延遲;敲除HSP90基因能導(dǎo)致植物形態(tài)學(xué)的改變。最近發(fā)現(xiàn),HSP90介導(dǎo)了對(duì)植物的抗逆響應(yīng)。胞質(zhì)HSP90與R蛋白之間互作而具有抗病性;在擬南芥和煙草中,多個(gè)證據(jù)表明HSP90、SGT1及RAR1之間存在相互作用,這種互作對(duì)R蛋白的活性起重要作用。在逆境條件下分子伴侶HSP90產(chǎn)物急劇增加,幫助靶蛋白正確折疊、或清除損傷的靶蛋白,從而幫助細(xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)并提高生存能力。因此,我們推測(cè)HSP90可能參與了小麥ERF轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)。PPR基因家族在線粒體和葉綠體基因表達(dá)調(diào)控中具有重要作用。玉米PPR蛋白CRP1定位在葉綠體的基質(zhì)上,參與葉綠體基因petD和petA轉(zhuǎn)錄本的翻譯以及對(duì)petD初始轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行加工。擬南芥PPR蛋白HCF152是葉綠體RNA加工和剪接因子,參與psbB-psbT-psbH-petB-petD轉(zhuǎn)錄本的正確加工過(guò)程。此外,PPR蛋白在線粒體RNA的加工過(guò)程中也具有重要的作用。酵母PPR蛋白PET309定位在線粒體上,對(duì)保持含有內(nèi)含子線粒體基因COX1初始轉(zhuǎn)錄物的穩(wěn)定性和成熟mRNA翻譯起重要作用。PPR基因不僅對(duì)細(xì)胞器基因進(jìn)行調(diào)節(jié),而且對(duì)細(xì)胞器外一些基因的表達(dá)也起作用。例如,果蠅PPR蛋白BSF對(duì)果蠅早期胚胎發(fā)育模式的形成起作用,它特異地結(jié)合在bicoidmRNA3′端非翻譯區(qū),提高mRNA的穩(wěn)定性。本研