人類輔助生殖技術(shù)的新進展

輔助生殖技術(shù)（art）是指通過對卵、精子、卵和胚胎的手術(shù)治療實現(xiàn)不育治療的技術(shù)。1978年,由婦產(chǎn)科專家PatrikSteptone和胚胎學家RobetEdwards聯(lián)合應(yīng)用體外授精胚胎移植技術(shù),成功培育了首例試管嬰兒。而在過去的10年間,顯微操作儀的使用,使卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)得以在治療嚴重男性不育中成功應(yīng)用。顯微操作技術(shù)還可用于輔助孵化、胚胎活檢和核移植。輔助卵化技術(shù)可解決由透明帶硬化或增厚造成的植入率低的問題。胚胎活檢后,可用熒光原位雜交(FISH)或聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)進行植入前遺傳診斷并對胚胎進行遺傳學分析,以消除致命的基因疾病,減少由于非整倍體或染色體易位引起的流產(chǎn)。通過核移植進行卵子重建,可用于治療卵子損傷性不孕。胚胎細胞培養(yǎng)技術(shù)的改進,使胚胎體外培養(yǎng)時間延長,發(fā)育至囊胚期,從而減少移植胚胎數(shù),在保持高的移植率的同時減少多胎妊娠的發(fā)生。利用玻璃化技術(shù),卵子凍存已取得成功。人們對基因治療在生殖醫(yī)學領(lǐng)域的應(yīng)用也進行了探索,與此同時,人們也高度關(guān)注和重視輔助生育中的倫理和遺傳學問題。1體外培養(yǎng)及妊娠控制由于各種原因引起的輸卵管阻塞,使精子不能與卵子相遇,從而導(dǎo)致不孕。解決的方法是設(shè)法使精子與卵子在體外相遇并授精,這就是體外授精胚胎移植,或試管嬰兒技術(shù)。體外授精胚胎移植技術(shù)包括促排卵、取卵、體外授精和體外培養(yǎng)、胚胎移植四個環(huán)節(jié)促排卵環(huán)節(jié)經(jīng)歷自然周期、促排卵和超控促排卵的過程。自然周期中通常只有一個優(yōu)勢卵泡發(fā)育,授精后只能形成一個胚胎,移植一個胚胎后的妊娠很低,而且自然周期的時間長短因人而異,不易安排取卵時間,所以需要采用有控制的促排卵技術(shù),以達到不受自然周期限制,獲取多個健康成熟卵子的目的,并在授精后提供多個胚胎移植。體外授精和體外培養(yǎng)的關(guān)鍵是提高授精率、卵裂率及早期胚胎率等。共培養(yǎng)技術(shù)能夠提高體外授精率、胚胎質(zhì)量及妊娠率。待卵子成熟后將其取出,放入模擬人體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)液中,再加入經(jīng)過處理的精液,培養(yǎng)一段時間后,精子卵子即可結(jié)合成受精卵并發(fā)育為4~8個細胞的早期胚胎,然后挑出2~3個發(fā)育良好的胚胎,將其放回到子宮腔內(nèi)繼續(xù)生長發(fā)育而娩出。胚胎移植環(huán)節(jié)的關(guān)鍵是胚胎發(fā)育與子宮內(nèi)膜同步化及移植后黃體期支持療法等。體外授精胚胎移植技術(shù)適用于女方雙側(cè)輸卵管閉塞無法進行手術(shù)修復(fù)或手術(shù)失敗,而其子宮內(nèi)膜及其對腦垂體激素的反應(yīng)又正常者;也可用于精子過少、精子活力差或精液量少等情況。近年為提高成功率在技術(shù)方面不斷研究改進,從而使該技術(shù)的應(yīng)用范圍不斷擴大。2精子的注射卵胞漿內(nèi)單精子注射又稱第二代試管嬰兒,1992年P(guān)alermo等首次報道了卵胞漿內(nèi)單精子注射試管嬰兒誕生。從此,為不孕不育尤其是男性不育的治療開辟了廣闊前景。將近一半的不孕夫婦的不孕原因是由于男性因素造成的,表現(xiàn)為精液檢查的異常,包括精液中精子的數(shù)量少,精子的活動能力低或正常形態(tài)的精子數(shù)量少等,嚴重的少精癥或無精癥患者可以通過單精子卵胞漿注射進行治療。精液中只有極少量的存活的精子,或只能通過睪丸及附睪中穿刺得到少量的活精子的患者,都有可能通過這種技術(shù)得以生育。具體的操作方法是將卵子從女性體內(nèi)取出后,選擇活力好、形態(tài)正常的單個精子用顯微注射器將其直接注射到卵細胞內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)并確定卵細胞已受精并分裂后,將胚胎移植到子宮腔內(nèi)使其繼續(xù)生長發(fā)育成胎兒。這項技術(shù)為過去視為不治之癥的男性不育患者帶來了希望。單精子卵胞漿注射技術(shù)中促排卵,胚胎培養(yǎng),胚胎移植等步驟與常規(guī)體外受精胚胎移植技術(shù)相同。卵胞漿內(nèi)單精子注射配以簡單、有效的精子優(yōu)選技術(shù)是嚴重男性不育治療的發(fā)展趨勢。值得注意的是“卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)的嬰兒”和“試管嬰兒”出生缺陷率并無差別。但理論上卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)有可能將一些影響男性生育的異常染色體、變異基因或其他遺傳缺陷傳給下一代,其中最常見的Y染色體微缺失所致的不育可代代相傳。所以在治療前,應(yīng)對不孕夫婦雙方的染色體核型進行檢查和必要的分子生物學分析,以免導(dǎo)致胎兒染色體異常。3供精人工授精體內(nèi)人工授精是將精子直接注入處于排卵期婦女生殖道的不同部位,讓精子和卵子自然結(jié)合以達到妊娠的目的。按所用精液來源的不同,可分為丈夫精液或供者精液兩種。前者適用于因性功能障礙、子宮位置不良或子宮頸問題而造成不育者,可把排出的精子直接注入。精液質(zhì)量不佳者,可通過體外處理提高質(zhì)量后再注入。供精人工授精適用于精液中沒有精子,精子全部不活動,或男方有嚴重的遺傳性疾病。按精液使用方法的不同,可分為新鮮精液和凍貯精液兩種;按精液注入的部位不同,又可分為陰道內(nèi)、宮頸管內(nèi)、宮腔內(nèi)、輸卵管內(nèi)、腹腔內(nèi)人工授精等多種,這要求根據(jù)不同的病因、各醫(yī)院的的條件及醫(yī)生的經(jīng)驗來選擇,應(yīng)用最多的是宮頸管內(nèi)及陰道內(nèi)授精同時進行這種方法較為簡單且并發(fā)癥少,成功的關(guān)鍵是精液的質(zhì)量、女方的生育能力、授精時間與排卵時間的契合等因素,所以在施術(shù)前都需進行周密的檢查和方案設(shè)計將精液經(jīng)洗滌處理,去除精液中的死精子、白細胞、抗體等成分,使質(zhì)量好的精子在女方排卵期內(nèi)通過導(dǎo)管注入宮腔內(nèi),可達到優(yōu)選精子的目的。目前體內(nèi)人工授精的主要適應(yīng)癥為丈夫雖然精液正常,但有難以矯正的性交障礙,或男女性功能正常而女方陰道或陰道口畸形等,使精子不能正常上行達宮腔內(nèi)的患者。4玻璃化冷凍保護劑在冷凍中的應(yīng)用冷凍技術(shù)是生殖醫(yī)學領(lǐng)域一項重要技術(shù),凍存胚胎和精子用于輔助生殖已取得了較為滿意的結(jié)果。隨著體外授精胚胎移植及其衍生技術(shù)的不斷發(fā)展,胚胎冷凍技術(shù)已常規(guī)應(yīng)用于人類輔助生殖領(lǐng)域。將剩余胚胎或因各種原因不在刺激周期移植的胚胎進行凍存,最大限度地使用胚胎,減少了多胎妊娠不良結(jié)果的發(fā)生。配對和胚胎的冷凍流程包括將配子或胚胎置于保護劑低溫冷凍保存,需要時復(fù)溫并去除冷凍保護劑、使其回復(fù)到生理環(huán)境進一步發(fā)育等一系列技術(shù)。由于卵子易受損的特性,人們進行了多種嘗試來改善凍融技術(shù),減少冷凍對卵子的損傷。近年來由于玻璃化冷凍技術(shù)應(yīng)用于卵子凍存,凍融存活率、受精率、妊娠率有較大提高。玻璃化冷凍技術(shù)是一種無需降溫儀精密控制降溫速度即可進行的冷凍技術(shù)。利用這種技術(shù)可將配子或胚胎直接置于高濃度保護劑中,迅速投入液氮保存,操作簡便,冷凍損傷小,已成為研究熱點。迄今為止,已有采用玻璃化冷凍方法對人的未成熟卵細胞、成熟細胞、卵裂期胚胎及囊胚進行冷凍的成功報道。一般而言,冷凍液的濃度和組成、胚胎在溶液中的平衡過程、冷凍和復(fù)蘇速率、復(fù)蘇過程等是影響玻璃化冷凍胚胎存活率的重要因素。玻璃化冷凍過程中,高濃度冷凍保護劑在冷凍過程中固化,形成無結(jié)構(gòu)的玻璃態(tài),由于其質(zhì)點不規(guī)則排列,能始終保持溶液的水分子和離子分布,使跨膜物質(zhì)的濃度和滲透壓差別不大,從而避免了細胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶而導(dǎo)致的對細胞的機械性損傷,也消除了細胞外冰晶形成引起的理化損傷。雖然玻璃化冷凍不產(chǎn)生冰晶,對胚胎和卵細胞的影響比常規(guī)冷凍方法小得多,但高濃度的保護劑和冷凍過程不可避免會對胚胎和卵細胞造成透明帶、細胞骨架、膜完整性等損傷。所以,玻璃化冷凍成熟應(yīng)用于人類輔助生殖技術(shù),仍有待進一步研究和探索。5贈與卵的復(fù)產(chǎn)自1984首例先天性卵巢發(fā)育不良患者通過供卵成功妊娠分娩以來,贈卵技術(shù)迅速地在世界范圍內(nèi)普及,適應(yīng)范圍從僅用于先天性卵巢發(fā)育不良和卵巢早衰患者到目前用于各種卵巢功能減退、遺傳疾病和反復(fù)體外授精胚胎移植失敗患者,贈卵是解決卵巢功能衰竭、減退和遺傳病患者妊娠的有效方法。女方由于遺傳因素或過早絕經(jīng),無法產(chǎn)生卵子,可借用他人卵子,與丈夫精子在體外授精,然后將胚胎植入宮腔內(nèi)。另外,代孕母親也可滿足子宮功切除或?qū)m腔粘連無法妊娠婦女有自己孩子的希望。贈卵助孕技術(shù)過程包括受者的激素替代治療,供者促超排卵、取卵,與受者丈夫的精子進行體外授精以及受者胚胎移植等技術(shù)步驟。為提高妊娠成功率,進入治療周期前受者要用避孕藥或調(diào)節(jié)人工周期藥物使供卵者和受卵者月經(jīng)周期同步,使子宮內(nèi)膜與胚胎發(fā)育同步以利于著床。卵子來源有卵子捐贈者的供卵、冷凍卵子、未成熟卵體外培養(yǎng)等。供卵者的年齡是影響贈卵成功率的首要因素,有文獻報道,隨著供卵者的年齡增長,受卵者的成功率明顯下降,供卵者年齡大于29歲,受卵者的妊娠率可下降10%以上,供卵者必須已婚,且育有健康子女,其生理特征盡可能與受者相似,血型與受者相符合,無家族遺傳病史。隨著ART的發(fā)展,出現(xiàn)了冷凍未成熟卵子以及不同發(fā)育階段的卵泡和卵巢組織技術(shù),通過未成熟卵的體外成熟方法,可使醫(yī)生獲得更多的卵母細胞,建立起卵子庫,有希望從根本上解決卵子的來源。6預(yù)防并發(fā)癥風險胚胎移植前基因診斷主要是指在顯微操作下從體外授精發(fā)育至6~8個細胞期的胚胎中,活檢1~2個卵裂球細胞或直接獲取受精前后的極體,通過聚合酶鏈式反應(yīng)或熒光原位雜交,進行快速遺傳學診斷,選擇正常胚胎植入宮內(nèi),從而獲得健康胎兒,即所謂第三代試管嬰兒技術(shù)。胚胎移植前基因診斷是輔助生殖技術(shù)與遺傳學診斷技術(shù)相結(jié)合而成的一種孕前診斷技術(shù),它既為遺傳病高危婦女提供了盡可能大的選擇范圍,又把遺傳性疾病發(fā)現(xiàn)在胚胎發(fā)育的最早階段,避免了早期或中期妊娠后再行產(chǎn)前診斷,使孕婦面臨治療性流產(chǎn)所帶來的巨大身心創(chuàng)傷,還可避免絨毛取樣、羊膜腔穿刺、胎兒臍帶穿刺等手術(shù)操作所帶來的出血、流產(chǎn)、宮腔感染等并發(fā)癥風險。胚胎移植前基因診斷可使許多遺傳性疾病在胚胎植入前得以診斷,由于僅植入沒有攜帶遺傳性疾病的胚胎,可使有致命遺傳缺陷的夫婦生育健康的后代。胚胎移植前基因診斷主要適用于單基因的遺傳疾病包括常染色體顯性遺傳病、常染色體隱性遺傳病和X性染色體連鎖疾病等。用于胚胎移植前基因診斷分析的DNA來源有:①極體活檢,第一極體是卵子第一次減數(shù)分裂的結(jié)果,因未涉及到胚胎,這種方法從倫理角度更容易被接受。②卵裂球活檢,在胚胎發(fā)育到6~8個細胞時,取卵裂球進行活檢分析,無異常的胚胎在第3天未移植于子宮內(nèi)。因大多數(shù)胚胎體外培養(yǎng)能達到此階段,而且卵裂球是全能的,取出1~2個卵裂球不影響胚胎發(fā)育,所以這種方法最常用。③囊胚活檢,從受精后5~6天的胚胎中取出10個滋養(yǎng)外胚層細胞。胚胎移植前基因診斷的分析技術(shù)可分為兩類,一類是基于對DNA的直接分析,如核型分析和聚合酶鏈式反應(yīng)分析及熒光原位雜交等;另一類是通過基因產(chǎn)物的間接分析,包括用生化法在不同發(fā)育階段進行酶活性分析。但由于胚胎基因組活性發(fā)生相對較晚,所以至今無標準化的檢測法。雖然現(xiàn)已有胚胎移植前基因診斷后分娩正常嬰兒的報道,但該技術(shù)仍處于研究階段。7人類輔助生殖技術(shù)人類輔助生殖技術(shù)雖然有了迅猛發(fā)展,但其帶來的遺傳學及倫理學問題不容忽視。一些影響男性生育異常的染色體或突變基因有可能通過卵胞漿內(nèi)單精子注射而將遺傳缺陷傳給下一代。絕大多數(shù)的生育力低下,無精子,嚴重少精子或少、弱、畸形精子綜合征患者是由于染色體數(shù)量和結(jié)構(gòu)異常或各種基因突變所致。由這些因素導(dǎo)致的男性不育統(tǒng)稱為人類精子發(fā)生的遺傳性疾病。正是這類不育病人是求助于卵胞漿內(nèi)精子注射的大多數(shù)。如果將攜帶染色體畸變或基因突變的精子通過卵胞漿內(nèi)單精子注射注入胞漿內(nèi)就可使卵子受精,從而可能將上述各種人類精子發(fā)生的遺傳性疾病傳給下一代。國家衛(wèi)生部修訂了人類輔助生殖技術(shù)與人類精子庫相關(guān)技術(shù)規(guī)范、基本標準和倫理原則,在原有的基礎(chǔ)上提高了應(yīng)用相關(guān)技術(shù)的機構(gòu)設(shè)置標準、人員的資質(zhì)要求和操作的技術(shù)規(guī)范,并進一步明確和細化了技術(shù)實施中的倫理原則。輔助生殖技術(shù)要遵守有利于患者、知情同意、保護后代、社會公益、保密、嚴防商業(yè)化、倫理監(jiān)督7大原則。多胎妊娠必須減胎,避免雙胎,嚴禁三胎和三胎以上的妊娠分娩。單身婦女不得實施人類輔助生殖技術(shù),禁止無醫(yī)學指征的性別選擇;禁止實施代孕技術(shù);禁止實施胚胎贈送;禁止實施以治療不育為目的對人卵胞漿移植及核移植技術(shù);禁止以生殖為目的的人類配子、合子和胚胎進行基因操作;禁