心肌細(xì)胞鈣離子的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察【摘要】目的：對SD乳鼠心肌細(xì)胞Ca2+在低溫條件下進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察，為建立低溫下心肌細(xì)胞鈣離子運(yùn)動(dòng)模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用熒光技術(shù)分別于37°C,24°C環(huán)境中對分離培養(yǎng)的SD乳鼠心肌細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。結(jié)果：心肌細(xì)胞在體外呈集落生長。正常條件下，集落中無鈣波產(chǎn)生，集落細(xì)胞同步搏動(dòng)；當(dāng)在24C的低溫環(huán)境下，集落中個(gè)別細(xì)胞先發(fā)生鈣波，隨后集落細(xì)胞同步搏動(dòng)。結(jié)論：低溫下個(gè)別細(xì)胞產(chǎn)生的鈣波可能對其所在集落細(xì)胞的同步搏動(dòng)有誘導(dǎo)并維持其搏動(dòng)的作用，這為研究心肌的起搏與傳導(dǎo)提供了最簡單的模型?！娟P(guān)鍵詞】心肌細(xì)胞；鈣離子；鈣波低溫麻醉是器官移植的有效手段，但低溫麻醉產(chǎn)生的心溫降低常會(huì)導(dǎo)致心搏停止、心室纖顫和嚴(yán)重的心律失常，這給低溫麻醉和器官移植等臨床應(yīng)用帶來了局限性。據(jù)報(bào)道，人和許多非冬眠哺乳動(dòng)物心臟保持節(jié)律收縮的最低溫度為20C?28°C［1］。Ca2+對心肌細(xì)胞的搏動(dòng)具有關(guān)鍵作用，細(xì)胞搏動(dòng)的紊亂常表現(xiàn)為胞內(nèi)Ca2+流的紊亂［2?6］。因此，在適度低溫條件下對心肌細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察將具有重要意義。而目前，國內(nèi)外此方面的報(bào)道甚少。近年來，隨著高靈敏度探針flou-4/AMeater和激光掃描共焦顯微鏡(laserscanningconfocalmicroscope，LSCM)的運(yùn)用，為胞內(nèi)Ca2+的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察提供了可靠手段。本實(shí)驗(yàn)通過分離培養(yǎng)SD乳鼠心肌細(xì)胞，用Fluo-4鈣離子探針標(biāo)記后，于37°C、24C環(huán)境溫度中在LSCM下對胞內(nèi)Ca2+運(yùn)動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)觀測，為建立低溫下心肌細(xì)胞Ca2+運(yùn)動(dòng)模型提供基礎(chǔ)，從而為探討低溫下的心肌細(xì)胞起搏機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料與方法實(shí)驗(yàn)材料與儀器：SD乳鼠購自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；粗制二型膠原酶購自Gibico公司；新生小牛血清，M199培養(yǎng)基，flou-4/AMeaterCa2+探針試劑盒均購自Invitrogen公司；taurine購自上海生工。溫度用自制標(biāo)本槽控制，標(biāo)本槽由塑制培養(yǎng)皿改制，皿內(nèi)中央粘置環(huán)形玻璃管與低溫循環(huán)水浴相連，用以控制溫度。電子溫度計(jì)的探頭緊貼皿底放置，用以監(jiān)視溫度。環(huán)形玻璃管圍成容積約0.5ml的小室用于盛放溶液和細(xì)胞。圖像采集采用Leica公司TCSSP2型號(hào)LSCM，圖像分析采用Leica公司圖像分析軟件。實(shí)驗(yàn)方法121乳鼠心肌細(xì)胞的分離與培養(yǎng):取出生3d以內(nèi)SD乳鼠5只（雌雄不限）,無菌取出心臟，迅速置于冷的K-H緩沖液中［4］，去血跡，心包膜及心房組織。將心室組織剪成約1mm3大小的碎塊，再用K-H緩沖液反復(fù)洗滌3次后，用0.1%二型粗制膠原酶分3次消化心肌組織，每次約15min,再用含5%新生小牛血清的M199培養(yǎng)基終止消化。收集消化后的細(xì)胞懸液800g離心5min。用含5%新生小牛血清的M199培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照105個(gè)/ml的細(xì)胞濃度接種于30mm培養(yǎng)皿中，置于37°C,5%CO2,95%相對濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h首次換液，以后每2d換液1次。每天用相差倒置顯微鏡對心肌細(xì)胞生長情況進(jìn)行觀察。1.2.2心肌細(xì)胞的fluo-4負(fù)載：取培養(yǎng)到第四天的細(xì)胞，用K-H緩沖液洗滌3次，然后避光加入含5“mol/Lfl40勺K-H緩沖液，37C孵育30min。然后避光下用k-H緩沖液洗滌3次，加入含5%新生小牛血清的M199培養(yǎng)液，37C培養(yǎng)約40min后，置于LSCM進(jìn)行觀察。1.2.3熒光圖像的采集及數(shù)據(jù)的處理：將負(fù)染后的心肌細(xì)胞置于LSCM下，分別于37C和24C的環(huán)境溫度下，用488nm激光激發(fā)，掃描模式為單次雙向掃描，分辨率采用256x256像素模式，掃描時(shí)間為140ms/幀。成像過程選用Leica公司出品的LSCM自帶的分析軟件進(jìn)行計(jì)算完成。結(jié)果2.1SD乳鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)：心肌細(xì)胞剛接種時(shí)，呈圓形，無明顯搏動(dòng)。培養(yǎng)24h后細(xì)胞開始貼壁，貼壁細(xì)胞呈長梭型或多邊形，少量細(xì)胞有不規(guī)則搏動(dòng)（見圖1）。隨后，心肌細(xì)胞逐漸在瓶底表面鋪展生長，成片細(xì)胞的收縮明顯而有力，搏動(dòng)頻率為55~120次/分。培養(yǎng)到第四天時(shí)，心肌細(xì)胞成集落生長，每個(gè)集落細(xì)胞約10~45個(gè)細(xì)胞，呈放射狀排列，相鄰兩個(gè)集落的細(xì)胞可能相連。一旦成片后，整個(gè)視野的細(xì)胞搏動(dòng)出現(xiàn)同步化，搏動(dòng)頻率約79次/分（見圖2）。

圖1培養(yǎng)的心肌細(xì)胸圖1培養(yǎng)的心肌細(xì)胸（200刈圖2培養(yǎng)紀(jì)后的心肌細(xì)胞（100x）Ca2+的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察2.2.1正常溫度下心肌細(xì)胞中Ca2+的動(dòng)態(tài)觀察：心肌細(xì)胞負(fù)載fluo-4后，可在LSCM下觀察到心肌細(xì)胞胞質(zhì)中Ca2+濃度變化隨心肌細(xì)胞的搏動(dòng)節(jié)律性變化（見圖3）。在37°C正常環(huán)境溫度下，心肌細(xì)胞搏動(dòng)周期約為79次/分，且整個(gè)視野的心肌細(xì)胞同步搏動(dòng)。圖3心肌細(xì)胞搏動(dòng)的鈣離子影像2.2.2低溫下心肌細(xì)胞中Ca2+的動(dòng)態(tài)觀察：在24C低溫環(huán)境下，細(xì)胞搏動(dòng)頻率逐漸降低。當(dāng)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率降為40次/分時(shí)，心肌細(xì)胞Ca2+運(yùn)動(dòng)開始出現(xiàn)鈣波，即：Ca2+濃度在細(xì)胞的一端突然的增高，呈帶狀向細(xì)胞的另一端移動(dòng)。當(dāng)一個(gè)集落中一個(gè)心肌細(xì)胞出現(xiàn)鈣波時(shí)，整個(gè)集落的其他細(xì)胞無Ca2+濃度的變化。圖3為LSCM紀(jì)錄的細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度變化的部分影像，其中1?18幀為紀(jì)錄的一個(gè)心肌細(xì)胞集落Ca2+變化的時(shí)間序列圖，采集時(shí)間為每幀140ms。圖4是圖3掃描區(qū)域的放大圖，分別選定A，B，C，D四個(gè)細(xì)胞，按照所選細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度對時(shí)間作圖進(jìn)行分析（見圖6）。圖5為圖4中細(xì)胞A的放大圖，沿細(xì)胞長軸由下至上選擇E，F(xiàn)，G三個(gè)區(qū)域，按每個(gè)區(qū)域的平均熒光強(qiáng)度對時(shí)間作圖進(jìn)行分析（見圖7）。由上述圖可見，在1~12幀時(shí)段，細(xì)胞A出現(xiàn)鈣波，鈣波傳播方向由E區(qū)域經(jīng)F傳至G區(qū)域，3個(gè)區(qū)域出現(xiàn)Ca2+濃度最大值的時(shí)間分別在第四、五、六幀。此時(shí)，細(xì)胞B,C,D胞質(zhì)里無Ca2+濃度變化，細(xì)胞也無搏動(dòng)。在13?21幀時(shí)段，集落細(xì)胞同步搏動(dòng)，即A,B，C，D4個(gè)細(xì)胞在第十三幀時(shí)熒光強(qiáng)度同時(shí)增強(qiáng)，Ca2+濃度同時(shí)增高，當(dāng)?shù)谑膸瑫r(shí)，這些細(xì)胞的Ca2+濃度都達(dá)到各自的最大值。對于A細(xì)胞而言，Ca2+濃度變化與發(fā)生鈣波時(shí)明顯不一樣，E，G，F(xiàn)區(qū)域出現(xiàn)Ca2+濃度最大值的時(shí)間均在同一幀上。這說明，低溫狀態(tài)下，集落中某個(gè)心肌細(xì)胞產(chǎn)生的鈣波可能誘導(dǎo)其周圍細(xì)胞Ca2+濃度發(fā)生改變，導(dǎo)致周圍細(xì)胞跟它發(fā)生同步搏動(dòng)。討論Ca2+作為體內(nèi)重要第二信使是通過產(chǎn)生一系列Ca2+信號(hào)實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞生理活動(dòng)控制的［7?10］。Ca2+動(dòng)態(tài)運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致胞質(zhì)Ca2+濃度變化，這種濃度變化可被細(xì)胞識(shí)別并促使細(xì)胞做出應(yīng)答反應(yīng)（如收縮，吞噬，分泌等）。長久以來，研究細(xì)胞Ca2+采用的是膜片鉗技術(shù)，但膜片鉗只能探測細(xì)胞膜兩側(cè)Ca2+分布，不能得到整個(gè)細(xì)胞Ca2+的運(yùn)動(dòng)情況。本實(shí)驗(yàn)通過具有高掃描速度的LSCM與具有高度靈敏度的活細(xì)胞Ca2+探針flou-4的聯(lián)合應(yīng)用，在實(shí)時(shí)獲取心肌細(xì)胞Ca2+運(yùn)動(dòng)方面取得了良好的效果。圉4圉4圖3掃描區(qū)域的放大圖圖5圖斗中A細(xì)胞的放大團(tuán)莒逋對屯肌細(xì)迫的影響—A—3--C—DI5 9131721253333374145妁5157ul時(shí)間國電心肌橐窘細(xì)胞再動(dòng)時(shí)旳餌禺于翌優(yōu)單卒期胞丙軻藍(lán)對刪胞搏動(dòng)的騒曲—￡—單卒期胞丙軻藍(lán)對刪胞搏動(dòng)的騒曲—￡—f斗。m「5LrIII?II?IrI1II * ii?rr 丄.ut?i」ii」?rLil“1 5 131731罵冷j337忙為粘閱6?&1也PS袈聯(lián)戟皆M7單個(gè)心肌細(xì)胞搏動(dòng)的鈣議子礎(chǔ)心溫降低常會(huì)導(dǎo)致心室纖顫、心搏停止及嚴(yán)重的心律失常，這給低溫麻醉和器官移植等臨床應(yīng)用帶來了局限性。許多哺乳動(dòng)物包括人在內(nèi)心臟保持節(jié)律收縮的最低溫度為20°C?28°C。本實(shí)驗(yàn)中，通過分別在37°C正常條件下和24°C低溫條件下對心肌細(xì)胞Ca2+運(yùn)動(dòng)及細(xì)胞搏動(dòng)的觀察，我們發(fā)現(xiàn)，在24C低溫環(huán)境下，心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率逐漸降低，且Ca2+熒光強(qiáng)度也逐漸減弱，Ca2+濃度降低。當(dāng)心肌細(xì)胞搏動(dòng)頻率降為40次/分時(shí)，某些心肌細(xì)胞產(chǎn)生了鈣波，且這些鈣波與同集落其他細(xì)胞的搏動(dòng)存在一定的關(guān)聯(lián)。當(dāng)集落中某個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)鈣波時(shí)，此集落的其他細(xì)胞無Ca2+濃度變化也不產(chǎn)生搏動(dòng)，只有在細(xì)胞出現(xiàn)鈣波后，此集落的其他細(xì)胞