酒精性脂肪肝肝細(xì)胞色素的表達(dá)及氧化抗氧化意義

肝臟是體內(nèi)代謝乙醇的主要場所。乙醇在肝內(nèi)的代謝途徑有三條:位于胞液中的乙醇脫氫酶(ADH)、微粒體乙醇氧化系統(tǒng)(MEOS)和過氧化氫小體上的觸酶(catalase)。其中,MEOS在乙醇代謝中所起的作用受到廣泛的研究?，F(xiàn)已證實(shí),MEOS的主要成分是細(xì)胞色素P450ⅡE1(cytochromeP450ⅡE1,CYPⅡE1)。為此,我們用免疫組化的方法研究大鼠酒精性脂肪肝肝CYPⅡE1的表達(dá)情況并分析其與脂質(zhì)過氧化的關(guān)系。材料和方法一、材料表面(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康成年SD大鼠(清潔級)18只,均為雄性,體重210±10克,購自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。(二)免疫組化染色兔抗鼠CYPⅡE1多抗由瑞典Karolinsk研究所惠贈(zèng)。鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化染色試劑盒(SPKit)購自福州邁新生物技術(shù)公司。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、維生素E(VitE)試劑盒購自南京建成生物公司。FR-980生物圖像分析系統(tǒng)由上海復(fù)日生物技術(shù)研究所生產(chǎn)。二、方法(一)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)SD大鼠正常喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組,每組6～12只。Ⅰ組為酒精性脂肪肝模型組,其造模方法為:先給大鼠隨意飲用2%的蔗糖溶液3天,然后再加入5%(v/v)的乙醇,每隔4天增加5%直至15%,然后再每周增加5%直至終濃度為40%。而Ⅱ組大鼠給予與酒精等熱量的葡萄糖溶液。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)食普通飼料(脂肪占5%)。動(dòng)物飼養(yǎng)于20±2°C明暗各12小時(shí)的清潔級實(shí)驗(yàn)室內(nèi)。造模時(shí)間為20周(從飲用40%的乙醇開始)。在第4周時(shí)隨機(jī)處死2只大鼠,20周時(shí)處死剩余的大鼠,取肝活組織分別作肝勻漿和石蠟切片待檢。(二)肝勻漿肝濕組織指標(biāo)測定,未發(fā)現(xiàn)1個(gè)月內(nèi)的肝濕組織取肝右葉1克,4°C下制成10%的肝勻漿,分別測定MDA和SOD、GSH、VitE,結(jié)果以每克肝濕組織的含量表示,按試劑盒說明書操作。(三)免疫組化染色取肝左葉,10%的甲醛固定作如下觀察:常規(guī)HE染色,觀察肝組織的病理變化。CYPⅡE1免疫組化染色,采用鏈酶菌抗生物素蛋白-過氧化酶免疫組化(SP)法,DAB顯色,一抗CYPⅡE1多抗的工作濃度為1∶400,操作流程按試劑盒說明書進(jìn)行,每次試驗(yàn)均設(shè)陰性對照,以PBS替代一抗。CYPⅡE1的表達(dá)程度及范圍通過生物圖像分析系統(tǒng)換算成顯色指數(shù)進(jìn)行定量分析。(四)統(tǒng)計(jì)方法組間比較采用兩樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)。各指標(biāo)之間的相關(guān)性采用兩因素的相關(guān)分析,結(jié)果以r值表示。P<0.05為差異有顯著性。結(jié)果一、肝內(nèi)mda、sod、gsh和vit含量的變化結(jié)果顯示,酒精組與對照組相比,MDA的含量顯著升高,而SOD、GSH、VitE的含量則顯著下降(見表1)。二、cypl1表達(dá)在肝組織的表達(dá)光鏡下HE染色顯示,酒精組大鼠肝組織在第4周時(shí)未出現(xiàn)明顯的病理變化,而在20周時(shí)出現(xiàn)了中度的肝細(xì)胞脂肪變性,胞漿內(nèi)的脂滴為以大泡型為主的混合脂滴,并伴有輕度炎性細(xì)胞的浸潤和點(diǎn)狀壞死,脂肪變在腺泡Ⅲ區(qū)為重。對照組大鼠肝組織的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)正常。光鏡下觀察CYPⅡE1的免疫組化染色顯示,酒精組大鼠的肝CYPⅡE1在第4周時(shí)已在腺泡Ⅲ區(qū)中央靜脈周圍的肝細(xì)胞內(nèi)開始表達(dá),而在第20周時(shí)CYPⅡE1的陽性表達(dá)更加強(qiáng)烈,在腺泡Ⅲ區(qū)呈彌散性分布,并向Ⅱ區(qū)擴(kuò)散。對照組大鼠的肝CYPⅡE1的表達(dá)局限在中央靜脈周圍的少數(shù)幾個(gè)肝細(xì)胞內(nèi)。陰性對照未見著色。CYPⅡE1的表達(dá)程度及范圍通過圖像分析系統(tǒng)換算成顯色指數(shù)后,Ⅰ組的顯色指數(shù)為0.39±0.05,Ⅱ組的顯色指數(shù)為0,二者相比差異有非常顯著性(P<0.01)。三、sod、gsh、vite含量的關(guān)節(jié)作用相關(guān)分析表明,CYPⅡE1顯色指數(shù)與MDA的含量呈正相關(guān)(r=0.9873,P<0.01),而與SOD、GSH、VitE的含量呈負(fù)相關(guān)(r值分別為-0.9190、-0.9270、-0.9151,P值均小于0.01)。cypl1表達(dá)對酒精性肝損傷的細(xì)胞作用目前的研究認(rèn)為,當(dāng)血和肝組織乙醇濃度較低時(shí),大部分乙醇由ADH氧化代謝,但長期酗酒而使肝組織乙醇濃度超過10mmol/L(50mg/dl)時(shí),MEOS被激活并對乙醇代謝起主要作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明,當(dāng)大鼠飲用40%的乙醇4周時(shí),雖然肝組織未出現(xiàn)明顯的病變,但其CYPⅡE1已開始表達(dá),以后隨著大鼠飲酒時(shí)間的延長和量的增加,其肝CYPⅡE1在腺泡Ⅲ區(qū)的表達(dá)逐漸增強(qiáng),并向Ⅱ區(qū)彌散,這與國外的文獻(xiàn)報(bào)道相一致。該現(xiàn)象與酒精性肝病在中央靜脈周圍病變較重這一現(xiàn)象相吻合。這除了與CYPⅡE1分布有關(guān)外,也與該區(qū)相對遠(yuǎn)離血液和營養(yǎng)物質(zhì)的供應(yīng),對有害因素的抵抗力和細(xì)胞的再生力較差有關(guān)。已有的實(shí)驗(yàn)證實(shí),不但大鼠微粒體氧類(O??22-?,H2O2)的生成與CYPⅡE1有量效關(guān)系,而且用電子自旋捕集技術(shù)(ESR)證實(shí),乙醇氧化時(shí)產(chǎn)生的羥自由基(·OH)也與CYPⅡE1的表達(dá)相關(guān)。我們的相關(guān)分析也表明,隨著CYPⅡE1的表達(dá)增強(qiáng),脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物MDA的含量隨之也升高。在正常情況下,細(xì)胞內(nèi)存在著自由基清除劑即抗氧化劑,如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、維生素E等,它們均是細(xì)胞內(nèi)重要的自由基清除劑,可以隨時(shí)清除不斷生成的有害自由基,阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒糯蠓磻?yīng)。從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。但是,一旦氧化抗氧化機(jī)制失去平衡,則對機(jī)體產(chǎn)生不利的影響。我們的相關(guān)分析表明,隨著CYPⅡE1表達(dá)的增強(qiáng),SOD、GSH、VitE的含量均顯著下降。而對酗酒者的研究也證實(shí),其體內(nèi)抗氧