rp-hplc法測(cè)定護(hù)肝片中五味子甲素和五味子乙素的含量

肝保護(hù)片由五味子、豬膽脂粉等五種中藥組成。經(jīng)過加工的片劑具有平肝理氣、健脾消食、降血酶的功效。慢性肝炎和早期肝硬化患者，可被收錄在中國(guó)藥典（2000年版，一部分）。藥典中樣品經(jīng)索氏提取后,用反相高效液相色譜法測(cè)定護(hù)肝片中五味子乙素的含量,作為控制該藥質(zhì)量的指標(biāo)。但我們考慮到其主要有效成分為五味子甲素和五味子乙素,故同時(shí)測(cè)定護(hù)肝片中五味子甲素和五味子乙素2種成分的含量來控制其質(zhì)量,并且比較了各種提取方法對(duì)樣品提取率的影響,為新版中國(guó)藥典的編纂提供了有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1超聲波清洗器、藥品檢定所和藥物試劑Waters高效液相色譜儀(美國(guó)):510泵,2487紫外檢測(cè)器;浙江大學(xué)色譜工作站;TCQ-250超聲波清洗器(北京醫(yī)療設(shè)備二廠)。五味子甲素和五味子乙素對(duì)照品(購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)0764-200006和765-200104);乙腈(色譜純,美國(guó)迪馬公司);其它試劑均為分析純。護(hù)肝片(黑龍江省五?？ㄋ帢I(yè)有限公司,批號(hào)200210104)。2方法和結(jié)果2.1流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)色譜柱:迪馬公司Diam0nsilTMC18分析柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-水-冰醋酸(70:30:0.1);流速:1.0mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):254nm;靈敏度0.5AUFS。2.2樣品的提取方法本實(shí)驗(yàn)曾比較正己烷、甲醇、75%乙醇超聲以及正己烷索氏提取(2000年版藥典采用)的方法對(duì)護(hù)肝片進(jìn)行提取,發(fā)現(xiàn)護(hù)肝片中五味子甲素和五味子乙素用甲醇提取率最高,故選用甲醇超聲法來提取樣品。2.3甲醇的用量取護(hù)肝片20片除去糖衣,精密稱定,研細(xì),取0.25g,精密稱定,置50mL具塞三角瓶中,精密加入甲醇25mL,稱重,超聲20min,放冷,再稱重,用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,棄去初濾液,取續(xù)濾液5mL置10mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,即得。2.4準(zhǔn)分離主溶液的制備按護(hù)肝片的處方制備不含五味子藥材的陰性對(duì)照,照供試品溶液的制備項(xiàng)下同法操作,即得。2.5對(duì)照品溶液的制備分別取五味子甲素和五味子乙素對(duì)照品適量,加甲醇配制成五味子甲素(0.10mg·mL-1)和五味子乙素(0.16mg·mL-1)對(duì)照品混合溶液。精密量取上述溶液0.5mL,置25mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品溶液。2.7方法研究2.7.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制取五味子甲素約1mg和五味子乙素約2.4mg,精密稱定,置10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品貯備液。精密量取該貯備液1mL,置10mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度。精密吸取該溶液2,4,6,8,10,12μL,按上述色譜條件依法進(jìn)樣,測(cè)定峰面積。以相應(yīng)的峰面積Y為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量X(μg)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。五味子甲素和五味子乙素的回歸方程(n=6)分別為:五味子甲素和五味子乙素進(jìn)樣量分別在0.02～0.12μg和0.048～0.288μg范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系.2.7.2檢測(cè)最低限額在信噪比S/N≥3時(shí),五味子甲素和五味子乙素的最低檢測(cè)限分別為0.291ng和0.806ng。2.7.3藥液法測(cè)定配方取同一護(hù)肝片樣品5份,按照供試品溶液的制備項(xiàng)下同法操作制備溶液,注入液相色譜儀,依法測(cè)定,五味子甲素和五味子乙素峰面積積分值的RSD分別為0.71%和1.8%。由此可見該法重復(fù)性良好。2.7.4味子甲素和藥代動(dòng)力學(xué)取護(hù)肝片,按“2.3”項(xiàng)下同法操作制備供試品溶液,取該溶液,重復(fù)進(jìn)樣5次,測(cè)定峰面積,五味子甲素和五味子乙素峰面積的RSD分別為1.7%和0.87%。2.7.5溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)取護(hù)肝片約0.25g,按“2.3”項(xiàng)下同法操作制備供試品溶液,分別于0,1,2,3,4,5,6,7,8h進(jìn)樣,測(cè)定峰面積,結(jié)果顯示供試品溶液在8h內(nèi)穩(wěn)定。2.7.6藥料的回收率和精密度分別取已知含量的護(hù)肝片細(xì)粉5份,每份約0.125g,精密稱定,分別加入五味子甲素40.54μg、,五味子乙素92.54μg,使與0.25g樣品所含五味子甲素和五味子乙素的量相當(dāng),依法制備所需溶液,進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果五味子甲素、五味子乙素平均回收率分別為97.25%,97.07%;RSD分別為2.6%,1.9%。結(jié)果表明,方法的準(zhǔn)確度高,精密度好,方法可行。2.8護(hù)肝片中藥代動(dòng)力學(xué)含量的測(cè)定分別取護(hù)肝片各3份,每份約0.25g,精密稱定,分別按本文方法和中國(guó)藥典(2000年版)方法制備供試品溶液,注入液相色譜儀,然后計(jì)算含量。按本法測(cè)得護(hù)肝片中五味子甲素和五味子乙素的平均含量分別為326.3μg·g-1和741.5μg·g-1。按中國(guó)藥典方法測(cè)得護(hù)肝片中五味子甲素和五味子乙素的平均含量分別為237.2μg·g-1和521.5μg·g-1。由此可見,用甲醇直接超聲對(duì)樣品進(jìn)行提取,更能反映藥品的質(zhì)量。3藥品含量測(cè)定3.1五味子中主要化學(xué)成分為含多種木質(zhì)素類化合物,其中五味子甲素和五味子乙素為主要有效成分,因此同時(shí)測(cè)定護(hù)肝片中五味子甲素和五味子乙素的含量,對(duì)更好地控制護(hù)肝片的內(nèi)在質(zhì)量具有重要意義。3.2經(jīng)過多次試驗(yàn)比較,發(fā)現(xiàn)采用甲醇超聲的方法來提取同一批樣品測(cè)得的含量(五味子甲素和五味子乙素的平均含量分別為326.3μg·g-1和741.5μg·-1)均大于中國(guó)藥典(2000年版)的索氏提取法(五g味子甲素和五味子乙素的平均含量分別為237.2μg·g-1和521.5μg·g-1),加之索氏提取操作費(fèi)時(shí)、費(fèi)溶劑、步驟比較煩瑣,故選擇甲醇直接超聲的辦法來處理樣品,能更好的反映藥品本身的質(zhì)量。3.3在流動(dòng)相的選擇上,我們?cè)捎盟幍渲械牧鲃?dòng)相即甲醇-水(72:28),發(fā)現(xiàn)五味子乙素與其前面的雜質(zhì)峰不能得到良好分離,參考有關(guān)文獻(xiàn)我們選用了乙腈-水(70:30)為流動(dòng)相,五味子甲素和五味子乙素均能與其它雜質(zhì)峰分離良好,當(dāng)在流動(dòng)相中加入0.1%的冰醋酸后又能很好地改善峰形,故最后選擇乙腈-水-冰醋酸(70:30:0.1)。3.4本文無論是在含量指標(biāo)的控制,還是在有效成分的提取和流動(dòng)相的選擇上,均可為新版藥典收載護(hù)肝片的含量測(cè)定方法提供有利的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液,注入液相色譜儀,記錄色譜圖,結(jié)果見圖1。從圖中可見,五味子甲素和五