抗人活化血小板p-選擇素單克隆抗體pr2片段sz51的設(shè)計(jì)和應(yīng)用

許多肺血栓形成是由下肢深靜脈血栓形成的。與血栓形成表面的血小板或蛋白質(zhì)相比，具有高親和力的放射性血栓形成顯示明確的血液。同時(shí)，可以快速成像肺和下肢的深靜脈血栓形成（肺血栓形成的原因是導(dǎo)管），對(duì)可疑肺血栓形成的診斷具有重要價(jià)值。筆者曾以2-亞氨基噻吩鹽酸鹽(IT)修飾法標(biāo)記抗人活化血小板P-選擇素單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)SZ51,并成功檢測(cè)到犬體內(nèi)的肺栓塞栓子。每個(gè)血小板表面約有80000個(gè)糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體(GPⅡb/Ⅲa),為血栓顯像劑提供了高容量的結(jié)合位點(diǎn)。為研究以抗GpⅡb/Ⅲa的單抗作為顯像劑,同時(shí)進(jìn)行肺動(dòng)脈血栓部位和下肢深靜脈血栓部位顯像的可行性,筆者選用人源化抗人血小板膜GPⅢa單抗F(ab)2片段SZ21F(ab)2,經(jīng)99Tcm標(biāo)記后進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn),通過(guò)動(dòng)物血栓栓塞模型顯像,評(píng)估該顯像劑的應(yīng)用價(jià)值,現(xiàn)報(bào)道如下。材料和方法一、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與儀器人源化抗人血小板膜GPⅢa單抗F(ab)2片段SZ21F(ab)2由江蘇省血液研究所提供;2-IT和5,5-雙二硝苯甲酸均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;葡庚糖酸鈉(GH)藥盒(每瓶含GH8mg,SnCl20.08mg)為江原制藥廠產(chǎn)品;其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。比格犬8條,由北京瑪斯生物技術(shù)公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)為SCXK:(京)2002-2007。MPG-3E型多能血液凝聚儀(上海斯隆醫(yī)電設(shè)備有限公司產(chǎn)品);紫外分光光度計(jì)(日本HITACHIU3010型);γ計(jì)數(shù)儀(C5002,美國(guó)Parkard公司);96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板(丹麥Nunc公司產(chǎn)品);Anthos2010全自動(dòng)酶標(biāo)儀和Anthosfluido洗板機(jī)(奧地利Anthos公司產(chǎn)品);分子成像儀(美國(guó)Rio-RadModel250型);SPECT儀(日本ToshibaGCA7100A型)。二、血小板聚集檢測(cè)從犬后肢靜脈順利采血10ml,以V(質(zhì)量分?jǐn)?shù)3.8%枸櫞酸鈉):V(全血)=1:9抗凝,上下緩慢顛倒幾次,在20℃以200×g,800r/min離心10min,取上層血漿,即為富含血小板血漿(PRP);剩余部分繼續(xù)以3000r/min離心10min,取上層血漿,即為貧血小板血漿(PPP)。以PPP將PRP中血小板調(diào)整為3×1011/L左右備用。用生理鹽水將SZ21F(ab)2分別稀釋至200,100,50,25μg/ml。取0.18mlPRP加入血小板聚集檢測(cè)杯,分別加上述不同稀釋度的SZ21F(ab)2溶液各0.01ml,放入磁力攪拌棒,37℃保溫15min,以PPP調(diào)基線后,加人終濃度為20μmol/L的ADP誘導(dǎo)劑0.01ml,測(cè)定透光度的改變,即為血小板聚集率。在該反應(yīng)體系中,0.01ml抗體加入0.2ml的反應(yīng)體系,抗體的終質(zhì)量濃度分別為10,5,2.5和1.25μg/ml。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)生理鹽水為陰性對(duì)照。抑制率(%)=(陰性最大聚集率-樣品最大聚集率)/陰性最大聚集率×100%。共取14份比格犬靜脈血樣進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn),分別計(jì)算SZ21F(ab)2對(duì)14份血樣各自的抑制50%ADP誘導(dǎo)血小板聚集的質(zhì)量濃度,即IC50。以14份標(biāo)本的統(tǒng)計(jì)結(jié)果作為IC50,結(jié)果以表示。三、l-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及放化純的制備SZ21F(ab)2(2g/L),2-IT用二甲基亞砜(DMSO)配成20g/L的溶液。將上述2種溶液以n(2-IT):n.[SZ21F(ab)2]=1000:1混勻,充入N2,室溫下反應(yīng)15min。產(chǎn)物經(jīng)SephadexG-25柱(瑞典Pharmacia公司),0.1mol/LPBS淋洗,紫外分光光度計(jì)測(cè)各收集管樣品在280nm處的吸光度(A)值,合并峰管以Lowry法計(jì)算蛋白質(zhì)含量,凍干后備用。參考Ellmans法,即50μl樣品加入50μl0.01mol/L5,5-雙二硝苯甲酸,再用0.1mol/LpH值8.0的PB稀釋至1ml,室溫反應(yīng)15min,測(cè)紫外光412nm處A412值。以L-半胱氨酸溶液(0.0125～0.1mmol/L)為標(biāo)準(zhǔn)品,L-半胱氨酸濃度為橫坐標(biāo),A412值為縱坐標(biāo),用直線回歸法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。按照每分子L-半胱氨酸含1個(gè)巰基,將IT-SZ21F(ab)2及SZ21F(ab)2的A412值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算巰基數(shù)。采用上行性快速紙層析法,以雙層析快速薄層層析-硅膠紙(ITLC-SG,7mm×90mm)為支持物,V(PBS):V(丙酮):V[質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基磺酸鈉(SDS)]=3:1:1為展開(kāi)劑,點(diǎn)樣[(1～5)×104計(jì)數(shù)/min]后上行展開(kāi)一定距離,再用分子成像儀放射自顯影確定各成分的Rf值,99Tcm-SZ21F(ab)2的Rf值為0.8～1.0;的Rf值為0.4;還原锝及膠體Rf值為0。根據(jù)層析紙放射性分布計(jì)算99TcmSZ21F(ab)2的放化純。將約740MBq99Tcm洗脫液加入GH藥盒中,室溫反應(yīng)15min制備成99TcmGH,再將其等體積地加入純化后的IT-SZ21F(ab)2溶液中,充N2室溫反應(yīng)5,10,15,30,45min和1h,以紙層析法測(cè)定放化純,據(jù)此確定最佳標(biāo)記時(shí)間,并以此條件制備99Tcm-SZ21F(ab)2。將純化后的99Tcm-SZ21F(ab)2單獨(dú)與10倍體積的生理鹽水混合,分別在37℃和室溫下放置0.5,1,2,4和6h,取樣以快速紙層析法測(cè)定放化純。標(biāo)記后的99Tcm-SZ21F(ab)2放置2d(約8個(gè)半衰期),以紫外吸收法測(cè)定其質(zhì)量濃度,與同質(zhì)量濃度的未標(biāo)記SZ21F(ab)2進(jìn)行相同的稀釋,加入以人血小板GPⅡb/Ⅲa(0.1μg/孔)包被的酶標(biāo)板,37℃水浴1h后,加入辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-抗蛋白質(zhì)輕鏈抗體(proteinL),37℃水浴1h后,加入鄰苯二胺/雙氧水顯色,在酶標(biāo)儀上492nm處讀取A492值,作劑量反應(yīng)曲線。四、動(dòng)靜血藥栓塞roi的檢測(cè)比格犬8條,體重7～8kg,以氯胺酮和安定混合麻醉后,仰臥位固定,心電監(jiān)測(cè)。經(jīng)8F造影導(dǎo)管將自制雙股螺旋金屬絲(直徑0.5cm,長(zhǎng)約1.5cm)送入后肢深靜脈遠(yuǎn)端。其中3條實(shí)驗(yàn)犬(對(duì)照組),將另一雙股螺旋金屬絲經(jīng)后肢深靜脈送入左下肺動(dòng)脈,經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%泛影葡胺造影證實(shí)肺動(dòng)脈及后肢靜脈血栓栓塞形成。將(1.11～1.85)×108Bq99Tcm-SZ21F(ab)2經(jīng)后肢靜脈(手術(shù)側(cè)對(duì)側(cè))注入犬體內(nèi),對(duì)照組注入相同劑量的99Tcm標(biāo)記鼠IgGF(ab)2。分別于注射后1,2及3h取前位、左前斜位和右前斜位3個(gè)體位進(jìn)行肺栓塞平面顯像。前位進(jìn)行后肢深靜脈血栓栓塞顯像。平面采集1×107計(jì)數(shù),矩陣256×256。在各時(shí)相顯像圖上勾畫(huà)肺栓塞部位和同側(cè)及對(duì)側(cè)肺、心、肝等部位的等面積感興趣區(qū)(ROI),計(jì)算血栓部位與各相應(yīng)部位的放射性計(jì)數(shù)比值。同法計(jì)算深靜脈血栓的ROI放射性計(jì)數(shù)比值。顯像完畢后立即處死犬,取血栓、心、肺、肝、腎及血液等組織,測(cè)放射性計(jì)數(shù)并稱重,計(jì)算單位質(zhì)量離體血栓與各組織的放射性計(jì)數(shù)比值,并計(jì)算肺動(dòng)脈血栓和后肢深靜脈血栓的每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。對(duì)血栓性質(zhì)行病理檢查。itlc法測(cè)定細(xì)胞密度自由基的表達(dá)不同質(zhì)量濃度SZ21F(ab)2抑制ADP誘導(dǎo)血小板聚集結(jié)果見(jiàn)圖1。將各質(zhì)量濃度抑制率的平均值擬合為對(duì)數(shù)方程,SZ21F(ab)2方程為y=0.2302In(x)+0.3077,r2=0.9577,可見(jiàn)SZ21F(ab)2在體外可與GPⅡb/Ⅲa高親和性和高特異性結(jié)合,與ADP誘導(dǎo)血小板聚集的抑制作用存在良好的劑量相關(guān)性,抑制作用隨著質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)。分別計(jì)算SZ21F(ab)2對(duì)14份血樣各自的IC50,SZ21F(ab)2抑制ADP誘導(dǎo)犬PRP聚集實(shí)驗(yàn)的IC50為(2.49±1.88)μg/ml。L-半胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程為y=90.635x+0.0204,r=0.998。每個(gè)L-半胱氨酸分子含1個(gè)硫基,將A412值代入方程計(jì)算樣品所含硫基濃度,并根據(jù)體積和抗體濃度計(jì)算每個(gè)抗體上的硫基數(shù)。當(dāng)n(2-IT):n(SZ21)=1000:1時(shí),每分子抗體上的游離巰基數(shù)為7,修飾效果最佳。ITLC法測(cè)得純化后99Tcm-SZ21F(ab)2放化純?yōu)?5%以上,室溫及37℃條件下,99Tcm-SZ21F(ab)2可在生理鹽水中穩(wěn)定4h以上,放化純可穩(wěn)定在90%～95%,滿足顯像要求。ELISA結(jié)果示99Tcm-SZ21F(ab)2和未標(biāo)記的SZ21F(ab)2劑量反應(yīng)曲線基本重合,SZ21F(ab)2經(jīng)99Tcm標(biāo)記后并未影響其活性。顯像劑注入犬體內(nèi)后,心臟部位即刻顯示心室影,肝、腎隨即顯影。1h后,新鮮血栓顯影,放射性逐漸濃聚,濃聚部位與血管造影位置基本一致(圖2)。注射后3h,肺動(dòng)脈血栓形成部位與正常肺組織的放射性比值為3.03±1.18。對(duì)照組注入相同劑量的99Tcm標(biāo)記鼠IgGF(ab)2后迅速分布于全身,3h后仍未見(jiàn)栓塞部位放射性濃聚。注射顯像劑后1h深靜脈血栓部位出現(xiàn)放射性,并逐漸濃聚,濃聚部位與血管栓塞位置基本一致(圖3)。注射1,2和3h后肢深靜脈血栓與其對(duì)側(cè)的放射性計(jì)數(shù)比值分別為1.72±0.58,2.13±0.59和3.51±0.62。離體顯像所示99TcmSZ21F(ab)2濃聚部位與X線檢查證實(shí)的金屬絲放置部位完全一致。肺動(dòng)脈血栓和深靜脈血栓的放射性攝取分別為0.083%ID/g和0.076%ID/g。體外檢測(cè)示肺動(dòng)脈血栓與周圍肺組織單位質(zhì)量放射性比值平均為12.8;深靜脈血栓與血液的放射性比值平均為5.2,深靜脈血栓與肌肉的放射性比值平均為127.0。病理檢查證實(shí)形成1d后的血栓標(biāo)本為以血小板為主的混合血栓。標(biāo)記采用高效小分子多肽顯像技術(shù)的可行性血小板黏附于損傷血管內(nèi)皮是血栓形成的起始環(huán)節(jié),隨后纖維蛋白、紅細(xì)胞、血小板不斷沉積,造成血栓繼續(xù)形成,參與止血。參與血栓形成的血小板均為活化狀態(tài)的血小板。血小板活化后,其表面的GPⅡb/Ⅲa表達(dá)增高,與纖維蛋白原交聯(lián),使血小板聚集,參與血栓形成。所以血小板表面的GPⅡb/Ⅲa高表達(dá)是血栓形成的重要標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,SZ21單抗經(jīng)人源化改造后,制備成F(ab)2片段,保留了親本抗體的抗原結(jié)合能力,且與靶分子具有很強(qiáng)的結(jié)合能力,可同時(shí)進(jìn)行犬肺和后肢深靜脈血栓快速顯像,也為該單抗進(jìn)一步改造成適應(yīng)臨床顯像需要的小分子多肽提供了依據(jù)。同時(shí)SZ21F(ab)2經(jīng)99Tcm標(biāo)記后,可特異地在血栓部位濃聚,證實(shí)該分子在體內(nèi)可與血小板表面的GPⅡb/Ⅲa特異結(jié)合。本研究利用了前期工作所建立的動(dòng)物模型、標(biāo)記及檢測(cè)方法,但選擇的單抗SZ21F(ab)2片段是針對(duì)在新鮮血栓表面高表達(dá)的GPⅡb/Ⅲa位點(diǎn),因此更加適合同時(shí)進(jìn)行肺和下肢深靜脈血栓快速顯像。標(biāo)記的人源化單抗片段理論上可進(jìn)一步減少鼠源性單抗可能引起的人抗鼠免疫反應(yīng)。用2-IT法預(yù)處理抗體,通過(guò)2-IT與蛋白質(zhì)賴氨酸殘基反應(yīng),可達(dá)到在抗體分子上外接巰基的目的,而不必打開(kāi)抗體蛋白內(nèi)的二硫鍵,通過(guò)與99Tcm標(biāo)記的GH配體交換,可有效地進(jìn)行99Tcm標(biāo)記,并能保留抗體的免疫活性。用該方法制備SZ21F(ab)2體內(nèi)血栓顯像劑,標(biāo)記方法更加簡(jiǎn)便,并可獲得較好的標(biāo)記率,經(jīng)99Tcm標(biāo)記后并未影響其免疫活性。本研究的主要不足是血液中本底較高,考慮為SZ21F(ab)2與血小板表面GPⅡb/Ⅲa結(jié)合牢固,不易解離所致。肝臟亦有較高的放射性攝取。體內(nèi)顯像心室影較明顯,而離體心肌放射性攝取卻不高。以上現(xiàn)象表明顯像劑的血液清除相對(duì)較慢,因此心室影與肝影同時(shí)長(zhǎng)時(shí)間存在,在一定程度上影響了圖像質(zhì)量。筆者希望通過(guò)進(jìn)一步改進(jìn)方法,制備保留親本抗體的免疫活性,且相對(duì)分子質(zhì)量小,結(jié)合、解離迅速,血液清除快的小分子多肽顯像劑,使其成為高特異性的血栓顯像劑,應(yīng)用于肺栓塞的診斷。1.試劑和動(dòng)物2.這些機(jī)器1.血小板懸液的制備2.血小板聚集實(shí)驗(yàn)3.計(jì)算有效半夏ic501.2、sz21fab。改變兩次。使用2-t法2.測(cè)定了it-sz21f