節(jié)實時熒光定量PCR2021/5/91實時熒光定量PCR儀、技術(shù)原理及應用一、實時熒光定量PCR儀二、實時熒光定量PCR的技術(shù)原理

1.定量與常規(guī)的差別2.熒光擴增曲線3.熒光閾值和CT值

4.熔解曲線5.標準曲線

2021/5/926.何為實時？7.SYBRGreenI的工作原理8.MolecularBeacons（發(fā)夾型雜交探針）的工作原理9.TaqMan（水解型雜交探針）的工作原理10.多色多通道技術(shù)應用——基因表達分析11.內(nèi)標技術(shù)介紹三、實時熒光定量PCR技術(shù)的應用介紹1.醫(yī)療方面2.研究方面

3.其它方面四、熒光定量PCR實驗室所需儀器設備清單五、實時定量PCR及應用于植物分子生物學的研究2021/5/93一、實時熒光定量PCR儀熱循環(huán)儀（PCR儀）熒光檢測系統(tǒng)計算機及軟件系統(tǒng)2021/5/94不產(chǎn)熱的光源---

發(fā)光二極管（LED）靈敏度高的檢測器---

光電倍增管（PMT）優(yōu)點：

不產(chǎn)熱---無散熱裝置，全封閉無機械轉(zhuǎn)動裝置---抗震性強無需經(jīng)常校準，耐用靈敏度高線性范圍廣2021/5/95

Opticon實時熒光定量PCR儀熒光檢測熱循環(huán)儀光色:藍色光均一性:±0.4°C染料:FAM,SYBRGreenI,MolecularbeaconsTaqManProbes

精確性:±0.3°C激發(fā)光波長：450-495nm發(fā)射光波長:515-545nm

升降溫速率:最高3°C/秒.靈敏度:<5nM的熒光素溫度梯度:有檢測范圍:100-108拷貝容量:96樣品反應管:0.2mL反應管&96孔板操作系統(tǒng):WindowsNT2021/5/962021/5/97二、實時熒光定量PCR的技術(shù)原理1.定量與常規(guī)的差別常規(guī)PCR技術(shù)：對PCR擴增反應的終產(chǎn)物進行定量及定性分析定量PCR技術(shù)：對PCR擴增反應中每一個循環(huán)的產(chǎn)物進行定量及定性分析2021/5/98

SYBRGreenI定量原理

確定初始模板的濃度:

初始DNA量越多,熒光達到某一值（域值）時所需要的循環(huán)數(shù)越少

Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系：根據(jù)樣品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)就可計算出樣品中所含的模板量

2021/5/99實時熒光定量PCR技術(shù)簡介實時熒光定量PCR技術(shù)簡介

實時熒光定量PCR技術(shù)簡介

實時熒光定量PCR技術(shù)簡介實時熒光定量PCR：其反應體系中，引入了一種熒光化學物質(zhì)，隨著PCR反應的進行，PCR反應產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強度信號，這樣我們就可以通過熒光強度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴增曲線。2021/5/9102.熒光擴增曲線熒光擴增曲線可以分三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴增階段和平臺期。熒光背景信號階段：擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。平臺期：擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段：PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進行定量分析。2021/5/9113.熒光閾值和CT值

熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。熒光閾值線的位置一般事實上位于減去本底的位置上，這時的熒光信號超過了熒光背景信號并且開始增加。對某一樣品的C（t）值就定義為熒光量與熒光閾值線交叉時的循環(huán)數(shù)。即每個反應管內(nèi)的熒光信號到達設定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為CT值（thresholdvalue）。

定量熒光擴增曲線是熒光量與循環(huán)數(shù)的圖表。2021/5/9122021/5/9134.熔解曲線在PCR結(jié)束后，我們可以根據(jù)變性過程中的熒光值變化繪出每個樣品的熔解曲線。繪制熔解曲線時，Real-TimePCR儀連續(xù)監(jiān)測每個樣品在從雙鏈完全配對到完全解鏈的升溫過程中熒光值的變化過程。不同的擴增產(chǎn)物因為其長度和GC含量不同而在不一樣的溫度下解鏈，當產(chǎn)物解鏈時，SYBRGreenⅠ的熒光值將降低并被儀器監(jiān)測到。由此繪制出熒光強度隨溫度變化的負一次倒數(shù)圖。熒光強度變化的拐點（熔點，Tm）即為熔解峰值。熔解曲線是擴增反應的質(zhì)控途徑，當圖中沒有出現(xiàn)雜峰，也未出現(xiàn)主峰的異常增寬：表明實驗中未出現(xiàn)污染、引物二聚體和非特異性擴增。2021/5/9142021/5/9152021/5/916

5.標準曲線CT值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的CT值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系：起始拷貝數(shù)越多，CT值越小。利用已知起始拷貝數(shù)的標準品可作出標準曲線，其中橫坐標代表CT值，縱坐標代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)（如圖3所示）。因些只要獲得未知樣品的CT值，即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。2021/5/917Thistechnologyisvery

sensitiveinthatitisabletodetectsinglecopiesofgenesandrequiresverylittlestartingmaterialacrossawidespectrumofconditions.ThesystemmonitorsPCRateachcycleofareaction,andestimatesthecyclewhenthereactionreacheslogphaseincrements(whenthemostusefulquantitativeinformationaboutthesampleisavailable)Quantitationcanbe"relative"toaninternalstandardsuchasahousekeepinggene,or"absolute"whencomparedtoastandardcurvegeneratedfromknownconcentrations.2021/5/9186.何為實時？試劑方面：如何做到相對熒光強度反應的是PCR產(chǎn)物的相對量；如何做到相對熒光強度反應的是特定PCR產(chǎn)物的相對量；儀器方面：如何測定相對熒光強度Opticon實時熒光定量實PCR儀試劑工作原理工作原理哪一步可以觀察到熒光信號？變性；復性；延伸應用2021/5/9192021/5/9202021/5/9217.SYBRGreenI的工作原理

SYBRGreenI結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部SYBRGreenI染料只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光。SYBRGreenⅠ的最大吸收波長約為497nm，發(fā)射波長最大約為520nm。在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射強熒光信號;而不摻入鏈中的SYBR染料分子僅有微弱熒光信號背景，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加同步。變性：無熒光信號，未結(jié)合SYBRGreenIDye通過產(chǎn)物的Tm值來確定產(chǎn)物2021/5/9222021/5/9232021/5/9242021/5/9252021/5/926SYBRGreenⅠ的特點由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因為模板不同而特別定制，因此通用性好，且價格相對較低。利用熒光染料可以指示雙鏈DNA熔點的性質(zhì)，通過熔點曲線分析可以識別擴增產(chǎn)物和引物二聚體，因而可以區(qū)分非特異擴增。此外，由于一個PCR產(chǎn)物可以與多個分子的染料結(jié)合，因此SYBRGreenⅠ的檢測靈敏度很高。但是，由于SYBRGreenⅠ與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。通過測量升高溫度后熒光的變化可以幫助降低非特異產(chǎn)物的影響。由熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于更準確地分析SYBRGreenI。2021/5/9272021/5/928CYBRGreenI

的應用范圍及優(yōu)缺點起始模板濃度定量融解曲線分析：可區(qū)分單一產(chǎn)物、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物和（或）引物二聚體基因型分析

使用方便：不必設計復雜的引物沒有序列特異性：可以用于不同的模板便宜靈敏與非特異性產(chǎn)物結(jié)合2021/5/929MolecularBeacons（發(fā)夾型雜交探針）的工作原理原理：熒光諧振能量傳遞（FRET）

環(huán)與目標序列完全配對

莖由互補配對的序列組成變性:產(chǎn)生非特異性的熒光延伸:沒有熒光2021/5/9302021/5/9312021/5/932分子Beacons是一種在靶DNA不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標記寡核苷酸探針。在此發(fā)夾結(jié)構(gòu)中：位于分子一端的熒光基團與分子另一端的淬滅基團緊緊靠近。在此結(jié)構(gòu)中，熒光基團被激發(fā)后不是產(chǎn)生光子，而是將能量傳遞給淬滅劑，這一過程稱為熒光諧振能量傳遞（FRET）。2021/5/933分子信標的結(jié)構(gòu)：是一個具有莖－環(huán)（loop-stem）結(jié)構(gòu)的寡核苷酸探針，通常有25～35個核苷酸，兩端分別標上一個熒光基團和淬滅基團。分子Beacons的莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，環(huán)的部分用于與靶序列雜交（與目標序列互補），通常由15～30個核苷酸組成，要求與靶序列雜交后能形成與探針－靶序列雙螺旋有關(guān)的反式構(gòu)型，并使干的部分打開，盡量得使熒光基團和淬滅基團分開足夠的距離。一般莖（干的部分）一般5-8個核苷酸長（堿基對），并相互配對形成莖的結(jié)構(gòu)。2021/5/934熒光基團連接在莖臂的一端，一般連在5’端；而淬滅基團一般連在3’端。通常用4-（4-二甲基氨基偶氮苯基）苯甲酸（DABCYL）作為淬滅基團。分子Beacons必須非常仔細的設計，以致于在復性溫度下：

模板不存在時形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)；

模板存在時則與模板配對。自由狀態(tài)時，分子信標呈發(fā)夾型結(jié)構(gòu)，熒光基團和淬滅基團靠得很近，二者之間發(fā)生能量轉(zhuǎn)移（FRET和直接能量轉(zhuǎn)移），熒光基團的能量被淬滅基團吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被猝滅。。2021/5/935當有靶序列存在的時候，靶序列和分子信標的探針序列雜交形成有一定剛性的雙螺旋結(jié)構(gòu)，導致分子信標的構(gòu)象改變，干的部分打開，熒光基團與猝滅基團分開，二者之間的能量轉(zhuǎn)移終止；在有相應的單色光激活時，熒光基團發(fā)出熒光。熒光強度與溶液中靶序列的多少成正比，通過檢測熒光的強度就可以計算出靶序列的量。Beacons與模板配對后：分子Beacons的構(gòu)象改變使得熒光基團與淬滅劑分開；當熒光基團被激發(fā)時，它發(fā)出自身波長的光子。2021/5/936分子Beacons不同于SYBRGreen的一個優(yōu)點就是它特異性地檢測感興趣的目標DNA。通過精心設計分子Beacons和優(yōu)化反應條件（溫度和緩沖液）后，其靈敏度非常高，可用于單核苷酸多態(tài)性（SNPs）的檢測。但是，為檢測某一特定的目標DNA，每一個探針都必須單獨仔細地設計。

分子Beacons是美國紐約公共健康研究學會的技術(shù)專利。2021/5/9372021/5/9382021/5/9392021/5/940MolecularBeacons

的應用范圍及優(yōu)缺點

定量起始模板濃度基因型分析鑒定產(chǎn)物單核苷酸多態(tài)性（SNP）檢測對目標序列有很高的特異性，用于SNP檢測的最靈敏的試劑之一熒光背景低設計困難無終點分析功能只能用于一個特定的目標價格較高2021/5/9419.

TaqMan（水解型雜交探針）的工作原理

目標特異性探針5’為熒光素，3’為淬滅劑模板和探針雜交

延伸:聚合反應，Taq酶切下5’端熒光素出現(xiàn)熒光2021/5/9422021/5/9432021/5/9442021/5/9452021/5/9462021/5/9472021/5/948TaqMan(水解型雜交探針)的應用范圍及優(yōu)缺點

定量起始模板濃度基因型分析產(chǎn)物鑒定

SNP分析對目標序列有很高的特異性,特別適合于SNP檢測與MolecularBeacons相比，設計相對簡單價格較高只適合于一個特定的目標

不能進行融解曲線分析2021/5/949QuantitativeReal-TimePolymeraseChainReactionfortheCoreFacilityUsingTaqManandthePerkin-Elmer/AppliedBiosystemsDivision7700SequenceDetector

DeborahS.Grove

NucleicAcidFacility,LifeScienceConsortium,ThePennsylvaniaStateUniversity,UniversityPark,PA16802

2021/5/950Probe

Aprobe(ie,TaqMan)isdesignedtoannealtothetargetsequencebetweenthetraditionalforward

andreverseprimers.Theprobeislabeledatthe5‘endwithareporterfluorochrome(usually6-carboxyfluorescein[6-FAM]，6-羧基熒光素)andaquencherfluorochrome(6-carboxy-tetramethyl-rhodamine

[TAMRA],6-羧基-四甲基-若丹明)addedatanyTpositionoratthe3'end.TheprobeisdesignedtohaveahigherTm

thantheprimers,andduringtheextensionphase,theprobemustbe100%hybridized

forsuccessoftheassay.2021/5/951PrincipleAslongasbothfluorochromesareontheprobe,thequenchermoleculestopsallfluorescencebythereporter.However,asTaqpolymeraseextendstheprimer,theintrinsic（內(nèi)在的，固有的）5'to3'nucleaseactivityofTaqdegradestheprobe,releasingthereporterfluorochrome.Theamountoffluorescencereleasedduringtheamplificationcycleisproportionaltotheamountofproductgeneratedineachcycle.

2021/5/952Fluorogenic5'nucleasechemistry.(1)ForwardandreverseprimersareextendedwithTaqpolymeraseasinatraditionalPCRreaction.Aprobewithtwofluorescentdyesattachedannealstothegenesequencebetweenthetwoprimers.(2)Asthepolymeraseextendstheprimer,theprobeisdisplaced.(3)Aninherentnucleaseactivityinthepolymerasecleavesthereporterdyefromtheprobe.(4)Afterreleaseofthereporterdyefromthequencher,afluorescentsignalisgenerated.2021/5/953ThesensitivityofdetectionallowsacquisitionofdatawhenPCRamplificationisstillintheexponentialphase.Thisisdeterminedbyidentifyingthecyclenumberatwhichthereporterdyeemissionintensitiesrisesabovebackgroundnoise;thiscyclenumberiscalledthethresholdcycle(Ct).TheCtisdeterminedatthemostexponentialphaseofthereactionandismorereliable.TheCt

isinverselyproportionaltothecopynumberofthetargettemplate;thehigherthetemplateconcentration,thelowerthethresholdcyclemeasured.

2021/5/954Oneoftheviewsavailableaftercompletionoftherunisanamplificationwindow.Thiswindowshowstheamountoffluorescenceobtainedineachamplificationcycleforeachreaction.Thethresholdcycle(Ct)isshownbythedarkerhorizontalline.2021/5/955AdvantageProvidesanaccuratemethodfordeterminationoflevelsofspecificDNAandRNAsequencesintissuesamples.BasedondetectionofafluorescentsignalproducedproportionallyduringamplificationofaPCRproduct.

Turn-aroundtimefordataacquisitionandanalysisisshort,ResultsaremorereliablethanbytraditionalPCRmethods.SybrgreenIdetectionislessexpensiveandnosequence

specificprobeisrequired.Userswillalsoneedtopurchaseflat-top,opticalcapsor0.2mm

thermalmicroseal

filmfortheirplates.Allotherplatesandcapswillnotworkwiththenewmachines.2021/5/956ApplicationsTheapplicationsforquantitativereal-timePCRareinnumerable（數(shù)不清的）.

DetectionofgenomicorviralDNAintissuescanbeavaluablediagnostictool.

GeneexpressioncanbemeasuredafterextractionoftotalRNAandpreparationofcDNAbyareversetranscription(RT)step.Setupandanalysisaresimpleandcanmoreeasilybeextendedtotheclinicalenvironment

thantraditionalPCRtechniques.Anallelicdiscriminationassaythatcandetectsingle-basenucleotidemutationsandpolymorphisms.2021/5/957Allelic(等位基因的)discriminationassayTheseassaysrequiretwoseparateprobesthatdifferonlybyonebasemismatch.Oneprobelabeledwith6-FAM(6-羧基熒光素)representsoneallele（等位基因）,andtheotherprobelabeledwiththefluorochromeVICrepresentstheotherallele.Amismatchleadsto

alessefficientamplification.Fluorescencespectraarecollectedaftertherun,andusingmulticomponentanalysis,thesoftwareextractsthecontributionofeachcomponentdyetotheobservedspectrum.2021/5/958HomozygotesforFAMshowanincreaseintheFAMsignalbutnoincreaseintheVICsignal,andhomozygotesfortheVICprobeshowanincreaseinthatsignal.Heterozygotes（雜合子）showintermediateincreasesofFAMandVICsignals.Allthreegroupsareclearlydistinguishable,andthesensitivityissimilartothatforthequantitativePCRapplication2021/5/959

10.多色多通道技術(shù)應用

——基因表達分析2021/5/9602021/5/9612021/5/9622021/5/963PRIMERANDPROBEDESIGN

Primersandprobesmustbecarefullydesignedbecauseofthecostsassociatedwithproducingprobeswithdifferentdyesat5'and3'ends.

PE/ABDPrimerExpresssoftware,

whichisspecificallydesignedtoselecttheprimersandprobes.Therequiredparametersforwell-designedprimersandprobehavebeenwellbuiltintotheprogram.TheseparametersincludeaTmfortheprobethatis10°Chigherthantheprimers,primerTmisbetween58°Cand60°C,ampliconsizebetween50and150bases,absenceof5'Gs.2021/5/964Primerandprobedesignisdifferentfortheallelicdiscriminationassays.Theprobesdesignedforeachalleleshouldbecenteredoverthemismatchedbase,andtheprobesonly

havetodifferbythatbase.AnothermajordifferenceisthattheprobefortheseassayshasalowerTmrequirementthantheTaqManPCRassays.

2021/5/965

PrescreeningassaySYBRGreencanbeusedasa"probeless"alternativetotheTaqMansystem.Becauseitbindstoalldouble-strandedDNA,itisimperativetoensurethatthePCRproductbeingquantifiedisaclean,singleproduct,becauseanyprimer-dimersorbackgroundsmearsaredetected.Itcanbeusedasaprescreeningassaybeforeorderingaprobe.Iftheresultsaresatisfactory,theprobecanbeorderedandTaqManreactionsrunwithhigherspecificity.2021/5/966

11.內(nèi)標技術(shù)介紹2021/5/9672021/5/9682021/5/969三、實時熒光定量PCR技術(shù)的應用介紹2021/5/970熒光定量PCR技術(shù)的應用對DNA、RNA樣品進行定量和定性分析定量分析包括絕對定量分析和相對定量分析。前者可以得到某個樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度；后者可以對不同方式處理的兩個樣本中的基因表達水平進行比較?？梢圆欢ㄆ趯CR產(chǎn)物或樣品進行定性分析如：利用熔解曲線分析識別擴增產(chǎn)物和引物二聚體，以區(qū)分非特異擴增；利用特異性探針進行基因型分析及SNP檢測等。2021/5/971目前實時熒光PCR技術(shù)已經(jīng)被廣泛應用于基礎科學研究、臨床診斷、疾病研究及藥物研發(fā)等領(lǐng)域。其中最主要的應用集中在以下幾個方面：比較經(jīng)過不同處理樣本之間特定基因的表達差異（如藥物處理、物理處理、化學處理等），及特定基因在不同相的表達差異；比較正常組織與病理組織中各種mRNA表達量差異；驗證基因芯片實驗結(jié)果；驗證RNA干擾實驗結(jié)果。2021/5/9722021/5/9732021/5/9742021/5/9752021/5/9762021/5/977四、熒光定量PCR實驗室所需儀器設備清單專用工作服和工作鞋專用辦公用品一次性手套、一次性吸水紙微量加樣器一套（覆蓋1~1000ul）

以上物品各一套。2~8℃和-20℃或-80℃冰箱混勻器耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭(帶濾心）高速臺式冷凍離心機2021/5/978五、實時定量PCR及應用于植物分子生物學的研究Microarray最強大的功能是平行分析，在單次實驗中同時觀察上萬種RNA的相對量變，也因為平行處理之故，無法對每一個probe做最佳化、標準化，所以目前大部份結(jié)果都會再以

NorthernblotorReal-timequantitativePCR再做確認。雖然Northernblot在過去曾扮演十分稱職的角色，但有時microarray篩選出來的基因常有上千個譜，以傳統(tǒng)方法來驗證，仍是耗費人力物力的苦差事。

Real-timequantitativePCR

在近年來迅速普及，原因在其高靈敏度、快速及精確，樣品需求量少也是很重要的優(yōu)勢，是最適合承接microarray驗證的工具。2021/5/979

LaserCapturedMicrodissection(LCM)

RealTimeQuantitativePCR：量化組織中特定基因之表現(xiàn)共聚焦顯微影像系統(tǒng)(ConfocalImagingSystem)流速細胞篩選分析系統(tǒng)(FlowCytometry)以上技術(shù)就基因表現(xiàn)之各個面相作系統(tǒng)探討。

2021/5/9802021/5/981

實驗程序（舉例）RNA的定量：RNA的測量儀上，以NonoDrop軟件進行RNA的定量(ng/μl)。如濃度過高必須稀釋后再定量，以便定量盡可能地準確。同時，可從260/280的比值看出RNA的純度(一般在1.9-2.1之間)是否在要求的范圍內(nèi)。RNA的反轉(zhuǎn)錄及cDNA模板的稀釋：用作RNA反轉(zhuǎn)錄的RNA量，在鹽芥和擬南芥兩種材料、各200mMNaCl處理2小時及對照的4種RNA之間必須完全準確一致，即Ara200、Ara0、Th200、Th0的RNA量均為2000ng。以下的反轉(zhuǎn)錄體系中RNA和RNase-freeH2O的總體積為8.5μl

。2021/5/982RNA+RNase-freeH2O：8.5μl(2000ngRNA)Oligo-dT18(500ng/μl)：0.5μldNTP(2.5mM/each)：4μl計

：13μl該體系于65-70℃，5min；置于冰上冷卻后，加下面反應體系：5×

RTBuffer：4μl0.1MDTT：2μlSuperScriptIIIRT：1μl總計：20μl混勻，50℃保持6小時或過夜，即得到20μlcDNA；該cDNA稀釋20倍，即為400μl稀釋的cDNA，此用于實時定量PCR作為反應模板。

2021/5/983DTT即Dithiothreitol，中文名為二硫蘇糖醇。分子式為C4H10O2S2。

是一種常用d的小分子有機還原劑，有抗氧化作用。二硫蘇糖醇的名字衍生自蘇糖（一種四碳單糖）。DTT的異構(gòu)體為Dithioerythritol（DTE），即DTT的氧化結(jié)構(gòu)。

2021/5/984實時定量PCR(Real-timePCR)

SYBR?GreenPCRMasterMix：12.5μl稀釋的cDNA模板：2μlPrimer-F：1μlPrimer-R：1μl總計：25μl

2021/5/9852-ΔΔCT方法與相對基因表達差異的分析使用內(nèi)標基因的目的是為了對加入到反轉(zhuǎn)錄反應中的RNA進行均一化處理，標準的看家基因一般都可被用作內(nèi)標基因。適合于實時PCR反應的內(nèi)標基因包括GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase），β-actin(細胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin)、β2-microglobulin(微球蛋白)以及rRNA；當然，其它的看家基因也同樣能被用作內(nèi)標。我們在應用某一基因作為內(nèi)標之前首先確證該基因的表達不會受實驗處理的影響。

2021/5/986相對定量的方法分析基因表達差異(i)選擇一個內(nèi)標基因；(ii)確定內(nèi)標的有效性，確保它不會受到實驗處理的影響；(iii)通過PCR擴增目標基因和內(nèi)標基因RNA或cDNA的一系列梯度稀釋模板，確保它們的

擴增效率相同。(iv)最后通過2-ΔΔCT計算將統(tǒng)計數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化成線性形式而不是原始CT值。ΔΔCT表示目標基因和內(nèi)標基因CT值的差異;

2-ΔΔCT方法是實時定量PCR實驗中分析基因表達相對變化的一種簡便方法。2021/5/987Giovanna(2002)提出“相對CT”或“δ-δCT”的方法，這個方法的優(yōu)點是不需要為每次實驗制作標準曲線，只需要一個優(yōu)化步驟證明外源基因與內(nèi)源基因有相同的、至少是相似的反應效率即可。比較CT方法的優(yōu)點是無需標準曲線、適合多個樣品，當然它也消除了創(chuàng)造標準曲線時任何稀釋錯誤的不利影響。

2021/5/988相比于標準子(normalizer)，比較CT法(ΔΔCT)在對模板進行相對定量、監(jiān)測基因的表達水平時，不需標準曲線并增加了樣品的通量；為了使這個方法成功應用，目標序列和內(nèi)參序列的擴增效率必須相等。只要靶基因和標準者具有相似的動力學范圍，比較CT(ΔΔCT)方法就是最具有實際應用價值的方法。2021/5/9892-ΔΔCT方法中參照因子的選擇決定于基因表達定量實驗的類型；本實驗中參照因子是未經(jīng)NaCl處理的對照樣品；內(nèi)標基因為標準的看家基因Actin。根據(jù)實驗獲得的經(jīng)驗值，使用公式：

1.9-ΔΔCT進行統(tǒng)計分析。每個基因在兩種處理情況下的表達水平均來自3次實時定量PCR的平均值。2021/5/990Ct-ActinCt(control)Ct-ActinCt(200mMNaCl處理)deltaCtFolddifferenceAveFoldChangeStDev2021/5/991ThePyruvatedecarboxylase1GeneofArabidopsisIsRequiredduringAnoxia(缺氧癥）ButNotOtherEnvironmentalStressesOliverKursteiner,IsabelleDupuis,andCrisKuhlemeier*InstituteofPlantSciences,Altenbergrain21,CH–3013Berne,SwitzerlandPlantPhysiology,June2003,Vol.132,pp.968–978,?2003AmericanSocietyofPlantBiologists2021/5/992Fermentationhasimportantfunctionsinthepresenceofoxygen,mainlyingerminatingpollenandduringabioticstress.

Pyruvatedecarboxylase

(PDC,丙酮酸鹽(或酯)脫羧酶),whichcatalyzesthefirststepinthispathway,isthoughttobethemainregulatoryenzyme.PDCis

encodedbyfourcloselyrelatedgenes

inArabidopsis.

Usingreal-timequantitativepolymerasechainreaction,wedeterminedtheexpressionlevelsofeachindividualgene

indifferenttissues,undernormalgrowthconditions,andwhentheplantsweresubjectedto

anoxiaorotherenvironmentalstressconditions.2021/5/993

PDC1istheonlygeneinducedunderoxygenlimitationamongthePDC1genefamilyandthatapdc1nullmutantiscomprisedinanoxiatolerancebutnototherenvironmentalstresses.Characterizetheexpressionofthealdehydedehydrogenase(ALDH)genefamily.Noneofthethreegenesisinducedbyanoxia，butALDH2B7

reactsstronglyto

ABAapplicationand

dehydration,suggestingthatALDHmayplayaroleinaerobicdetoxificationofacetaldehyde.Discussthepossibleroleofethanolicfermentationasarobustback-upenergyproductionpathwayunderadverseconditionswhenmitochondrialfunctionisdisturbed.2021/5/994Estimatingthecopynumberoftransgenesintransformedricebyreal-timequantitativePCR.

YangL,DingJ,ZhangC,JiaJ,WengH,LiuW,ZhangD.

SchooloflifeScienceandBiotechnology,ShanghaiJiaoTongUniversity,800DongchuanRoad,Shanghai,200240,People'sRepublicofChina.

PlantCellRep.2005Mar;23(10-11):759-63.Epub2004Oct1.

2021/5/995Intransgenicplants,transgenecopynumbercangreatlyinfluencetheexpressionlevelandgeneticstabilityofthetargetgene,makingestimationoftransgenecopynumberanimportantareaofgeneticallymodified(GM)cropresearch.TransgenecopynumbersarecurrentlyestimatedbySouthernanalysis,whichislaboriousandtime-consuming,requiresrelativelylargeamountsofplantmaterialsandmayinvolvehazardousradioisotopes.

2021/5/996Reportherethedevelopmentofasensitive,high-throughputreal-time(RT)-PCRtechniqueforestimatingtransgenecopynumberinGMrice.UseTaqManquantitativeRT-PCRandcomparisontoanovelriceendogenousreferencegenecodingforsucrosephosphatesynthase(SPS)todeterminethecopynumbersoftheexogenousbeta-glucuronidase(GUS)andhygromycinphosphotransferase(HPT)genesintransgenicrice.2021/5/997Thecopynumbers

oftheGUSandHPTin

primaryricetransformants(T0)werecalculatedbycomparingquantitativePCRresultsoftheGUSandHPTgeneswiththoseoftheinternalstandard,SPS.

WithoptimizedPCRconditions,achievedsignificantlyaccurateestimatesofone,two,threeandfourtransgenecopiesintheT0transformants.CopynumberestimationsofboththeGUSreporter

geneandtheHPTselectivemarkergeneshowedthatrearrangementsof