臨床免疫學(xué)檢查1精選課件實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：乙型肝炎病毒(HBV)血清學(xué)標(biāo)志物檢查HBsAg-乙型肝炎病毒表面抗原HBsAb-乙型肝炎病毒表面抗體HBeAg-乙型肝炎病毒e抗原HBeAb-乙型肝炎病毒e抗體HBcAb-乙型肝炎病毒核心抗體2精選課件實(shí)驗(yàn)要求：掌握酶聯(lián)免疫的檢測原理了解試劑盒的使用掌握乙型肝炎病毒標(biāo)志物檢測結(jié)果的臨床意義3精選課件實(shí)驗(yàn)原理：酶聯(lián)免疫檢測（ELISA）ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay)的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)自70年代初問世以來，發(fā)展十分迅速，目前已被廣泛用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)科學(xué)的許多領(lǐng)域。4精選課件ELISA是以免疫學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，抗原、抗體的反應(yīng)在固相載體──聚苯乙烯微量滴定板的孔中進(jìn)行，微孔對蛋白有很好的吸附作用，（試劑盒已經(jīng)包埋好相應(yīng)的抗原、抗體蛋白成分）每加入一種試劑孵育反應(yīng)后，多余的游離反應(yīng)物可洗滌除去，從而保證試驗(yàn)結(jié)果的特異性與穩(wěn)定性。5精選課件反應(yīng)過程：包被：將已知抗體或抗原通過物理吸附結(jié)合到固相載體表面使其固相化抗原抗體反應(yīng)：加入被檢標(biāo)本和酶標(biāo)記物，使之與固相抗體或抗原發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定，經(jīng)洗滌除去游離的酶標(biāo)記物酶促反應(yīng)：加入酶底物，使之發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色。6精選課件ELISA反應(yīng)材料：固相載體：聚苯乙烯或聚氯乙烯有較強(qiáng)的蛋白吸附性能酶標(biāo)記物：標(biāo)記抗原或抗體的酶常選擇辣根過氧化物酶（HRP）酶底物：四甲基聯(lián)苯胺（TMB）受酶作用后呈藍(lán)色7精選課件ELISA法一方面是建立在抗原與抗體免疫學(xué)反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因而，具有特異性。而另一方面又由于酶標(biāo)記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子的結(jié)合物，它可以催化底物分子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，使本法具有很高的敏感性。8精選課件反應(yīng)類型夾心法間接法競爭法捕獲法應(yīng)用生物素-親和素系統(tǒng)的ELISA包被抗原抗體酶標(biāo)記抗體9精選課件一)雙抗體夾心法1.將已知抗體包被微量反應(yīng)板，和待檢抗原反應(yīng)，再加酶標(biāo)抗體和底物，根據(jù)顯色反應(yīng)對抗原進(jìn)行定性或定量。2.是檢測抗原最常用的方法。10精選課件11精選課件二）間接法標(biāo)本中的待檢抗體與固相抗原結(jié)合后，利用酶標(biāo)記抗抗體（抗人Ig）進(jìn)行檢測。是檢測抗體的最常用方法12精選課件13精選課件三）競爭法將待檢抗原和酶標(biāo)抗原與相應(yīng)固相抗體競爭結(jié)合，標(biāo)本中抗原越多，與固相抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原越少，與底物反應(yīng)生成的顏色越淺，根據(jù)顏色深淺可定性或定量測定?？捎糜跍y抗原，也可用于測抗體14精選課件15精選課件ELISA法是免疫診斷中的一項(xiàng)新技術(shù)，現(xiàn)已成功地應(yīng)用于多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據(jù)已經(jīng)使用的結(jié)果，ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定及易于自動化操作等特點(diǎn)。16精選課件實(shí)驗(yàn)材料：乙型肝炎病毒檢測試劑盒17精選課件試劑盒:微孔反應(yīng)板（48人份）酶結(jié)合物（6.2mL*1瓶）陽性對照（1.0mL*1瓶）陰性對照（1.0mL*1瓶）洗滌液（40mL*1瓶）顯色劑A（8.0mL*1瓶）顯色劑B（8.0mL*1瓶）終止液（7.0mL*1瓶）封片（2張）說明書（1份）18精選課件定量加樣器微量吸頭濾紙37℃恒溫水浴箱洗板機(jī)酶標(biāo)儀器材：19精選課件實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：取出試劑盒，室溫平衡30分鐘配制洗滌液（1：25倍稀釋）樣本血清制備：用真空采血管抽取空腹靜脈血5mL，靜置15分鐘后，以3500轉(zhuǎn)/分,離心5分鐘,分離血清備用。20精選課件實(shí)驗(yàn)第一步：每盒試驗(yàn)需設(shè)陽性對照2孔，陰性對照2孔，空白對照1孔每孔中加入待測標(biāo)本50微升除空白孔外每孔加入酶結(jié)合物50微升封板置37℃恒溫孵育30分鐘21精選課件實(shí)驗(yàn)第二步：洗板手工洗板：首先棄去孔內(nèi)液體，分別各孔注滿洗滌液，靜置2分鐘，甩干，重復(fù)5次后拍干。每次洗板要甩干微孔里的殘液，避免殘余游離酶標(biāo)記物顯色干擾讀數(shù)。22精選課件實(shí)驗(yàn)第三步：每孔先加入顯色劑A液1滴（50微升），再加入B液1滴（50微升），充分混勻封板，置37℃水浴箱孵育15分鐘。23精選課件實(shí)驗(yàn)第四步：每孔加入終止液1滴（50微升），混勻。終止液為強(qiáng)酸溶液，使酶蛋白變性，終止酶促反應(yīng)，故加樣時應(yīng)注意。目視讀數(shù)。24精選課件目視讀數(shù)：TMB在酶的作用下呈藍(lán)色，加入終止液（稀硫酸）后變黃，反應(yīng)孔顏色深淺同陽性對照孔顏色比較顏色相同或接近判定為陽性，顏色相差區(qū)別大判定為陰性。25精選課件顯色系統(tǒng)：在450nm波長有最高吸收峰，通過顏色變化及呈色深淺來推斷檢測對象的有（無）或含量（定量）。26精選課件光源透光板接收器27精選課件儀器讀數(shù)：酶標(biāo)儀讀數(shù)：先用空白孔校零，再用波長450nm（建議使用雙波長的酶標(biāo)儀比色，參考波長630nm）讀取各孔OD值。28精選課件酶標(biāo)儀參數(shù)：OD值：樣本的吸光度Cutoff值：廠家設(shè)定的此批試劑盒判定陽性結(jié)果的最低OD值COV：計算出的Cutoff值S/CO：樣本吸光度/COV儀器讀數(shù)：29精選課件Cutoff值計算：COV=陰性對照平均OD值×2.1標(biāo)本OD值≥COV為陽性；標(biāo)本OD值＜COV為陰性；陰性對照OD值低于0.05作0.05計算，高于0.05按實(shí)際OD值計算

30精選課件31精選課件HBV標(biāo)志物聯(lián)合檢測的臨床意義：常見模式HBsAgHBsAbHBeAgHBeAb抗HBc臨床意義1+-+-+急性或慢性乙型肝炎，高傳染性2+---+急性、慢性乙型肝炎或慢性HBsAg攜帶者3+--++急性乙肝趨向恢復(fù)或慢性乙肝，弱傳染性4-+--+急性HBV感染康復(fù)期或有既往感染史32精選課件常見模式HBsAgHBsAbHBeAgHBeAb抗HBc臨床意義5----+急性HBV感染“窗口期”或既往曾感染過乙肝，有流行病學(xué)意義6-+---疫苗接種后或HBV感染后康復(fù)7-+-++急性乙肝康復(fù)期，開始產(chǎn)生免疫力8---++乙肝恢復(fù)期，弱傳染性33精選