抗婦炎糜泡騰栓對實驗性大鼠支氣管炎陰道致炎作用的研究

抗癲癇藥物[1.4]由紅壤茯苓、蛇床子、苦參等七味中藥組成。主要用于治療婦科炎癥,如細(xì)菌性陰道炎、霉菌性陰道炎、滴蟲性陰道炎等,現(xiàn)已獲得國家專利證書(專利號:ZL200810300509.2)。本實驗試圖探討抗婦炎泡騰栓對實驗性大鼠陰道炎及子宮頸炎模型的治療作用,以期作為抗婦炎泡騰栓有否藥效及新藥開發(fā)價值的主要依據(jù)。1材料和方法1.1抗婦炎糜泡騰栓基質(zhì)的組成和性質(zhì)抗婦炎糜泡騰栓,規(guī)格:893mg生藥/粒(240mg浸膏/粒),貴州漢方制藥有限公司中試產(chǎn)品,批號:20111001。泡騰栓的基質(zhì),供作為空白對照組使用。為抗婦炎糜泡騰栓的泡騰栓基質(zhì),除了藥物以外,其組成材料、制用方法、形狀、重量大小,均同于抗婦炎糜泡騰栓,由貴州漢方制藥有限公司出品,批號:110929。消糜陰道泡騰片,國藥準(zhǔn)字Z20060054(外),長春海外制藥集團有限公司出品,產(chǎn)品批號:20110504。1.2實驗動物及設(shè)備大鼠,SD種,一級,體重164~194g,雌性,成都中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物由研究中心提供。動物質(zhì)量合格證:SCXK(川)2008-11。實驗動物使用許可證:四川省實驗動物管理委員會,許可證號:2003-015。實驗場地:成都中醫(yī)藥大學(xué)國家中醫(yī)藥管理局三級中藥藥理實驗室,證書登記編號:TCM-03-043,實驗室內(nèi)溫度控制在18~22℃。金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌,均為臨床分離菌株。由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院微生物檢驗室進行細(xì)菌培養(yǎng),并稀釋制成細(xì)菌懸液供用[大腸桿菌(2×108個/ml);金黃色葡萄球菌(2×108個/ml);淋球菌(2×108/ml)]。1.3實驗用培養(yǎng)基硫酸慶大霉素注射液,規(guī)格:2ml:8萬單位,江蘇瑞年前進制藥有限公司出品,產(chǎn)品批號:110725。己烯雌酚片,規(guī)格:每片0.5mg,包裝:100片/瓶,合肥久聯(lián)制藥有限公司出品,產(chǎn)品批號:20110102。實驗前將己烯雌酚片搗碎、酌加少量蒸餾水研磨溶解后,加量適蒸餾水稀釋制備成為一定濃度(0.3mg/ml)的混懸液供實驗用。氫化可的松注射液,規(guī)格:20ml:100mg,20ml×5支,天津金耀氨基酸有限公司出品,產(chǎn)品批號:110317。營養(yǎng)瓊脂(BR:生化試劑):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司出品,批號:20111018。成分(g/L):蛋白胨10g,氯化鈉5g,瓊脂20g,肉浸粉10g。稱取本品45g,加蒸餾水1000ml中,加熱煮沸溶解,分裝,常規(guī)制作營養(yǎng)培養(yǎng)基,121℃高壓滅菌15分鐘備用。1.4mpusb型光學(xué)顯微鏡AO石蠟切片機:美國AO公司制造。OlympusBX50型光學(xué)顯微鏡:日本Olympus公司制造。MIAS2000型計算機圖像工作系統(tǒng):四川大學(xué)智勝軟件股份有限公司。1.5大鼠陰道造模成功的檢測取雌性大鼠,禁食不禁水16小時,用戊巴比妥鈉35mg/kg腹腔注射麻醉。背位固定四肢,下腹部皮膚剪毛、常規(guī)消毒,正中切開腹部皮膚,鈍性分離腹肌、腹膜后進入腹腔,找到卵巢以絲線結(jié)扎后摘除。逐層縫合切口,任其自由活動。術(shù)后每日肌肉注射慶大霉素4萬U/kg(2ml:8萬U,0.1ml/100g體重),連續(xù)3天,防止感染。術(shù)后第4天開始,逐只做陰道涂片檢查,連續(xù)3天(術(shù)后第7天),未見陰道上皮角化細(xì)胞,造模大鼠均處于動情間期,證明卵巢摘除完全。將雙側(cè)卵巢切除成功的雌性大鼠按體重分層隨機搭配分成5組,每組10只,分別作為:(1)基質(zhì)對照組(模型對照組):450mg基質(zhì)/kg;(2)~(4)抗婦炎糜泡騰栓高、中、低三種劑量組:223.2、111.6、55.8mg生藥/kg(450、225、112.5mg栓重/kg,分別為臨床成年人每日擬用平均劑量的10倍、5倍、2.5倍);(5)消糜陰道泡騰片(陽性對照藥物)400mg/kg(為臨床成年人每日劑量的10倍)。給藥方法:將受試藥物抗婦炎糜泡騰栓、栓劑基質(zhì)(空白對照物)或消糜陰道泡騰片(陽性對照藥物)于給藥前用小刀將栓劑切成細(xì)條狀,根據(jù)大鼠體重的所需用栓劑重量,稱量出適合重量的細(xì)條狀栓劑,略捏成圓柱狀,塞入大鼠陰道內(nèi)給藥治療。感染后4天開始給藥治療,每天1次,連續(xù)10天。造成免疫功能低下:大鼠術(shù)后第7天開始灌胃給予己烯雌酚片的溶液3mg/kg(0.3mg/ml,1ml/100g體重),每天1次,連續(xù)4天(術(shù)后第7~10天),進行陰道涂片檢查,出現(xiàn)大量角化上皮細(xì)胞,證明已出現(xiàn)假動情期。即日開始除注射己烯雌酚外,加用皮下注射氫化可的松注射液50mg/kg(注射液20ml:100mg,1ml/100g體重),每天1次,連續(xù)3天(術(shù)后第9~11天),造成動物全身免疫功能低下。術(shù)后第11天,用滅菌0.5ml注射器接小鼠灌胃針頭,依次抽取細(xì)菌懸液:(1)抽取白色念球菌懸液(2×108個/ml)0.2ml/只,陰道內(nèi)灌注;(2)隔4小時后再抽取大腸桿菌懸液(2×108個/ml)0.2ml/只,陰道內(nèi)灌注;(3)再隔4小時后又抽取金黃色葡萄球菌(2×108個/ml)0.2ml/只,陰道內(nèi)灌注。大鼠陰道內(nèi)灌注細(xì)菌液時,將大鼠取頭朝下位,注入陰道內(nèi),于陰道口塞入消毒棉球,防止細(xì)菌液溢出。24小時后同樣方法再各感染1次。感染后造模動物隔日交替灌胃給予己烯雌酚或皮下注射氫化可的松注射液各2次,劑量同前,以保持假動情期和全身免疫功能低下狀態(tài),增加細(xì)菌(尤其是白色念球菌)在陰道內(nèi)的易感性。感染后4天,可見造模大鼠外陰紅腫,伴少量白色分泌物,用無菌棉簽蘸取分泌物,涂于沙氏培養(yǎng)基表面,25℃培養(yǎng)48小時,肉眼觀察可見大小不等的細(xì)菌菌落;分泌物鏡檢可見假菌絲和成群孢子,大鼠全呈陽性,表明大鼠陰道炎造模成功。然后行大鼠陰道內(nèi)給予藥物治療,每天給藥1次,連續(xù)給藥治療10天。2結(jié)果2.1菌落數(shù)觀察對混合細(xì)菌感染性大鼠陰道炎及子宮頸炎模型治療前及治療結(jié)束后,用消毒棉簽蘸取陰道分泌物,涂抹面積應(yīng)盡量一致,25℃培養(yǎng)48小時,肉眼觀察菌落數(shù)生長情況。試驗結(jié)果表明,受試藥物抗婦炎糜泡騰栓3種劑量組及陽性對照藥物消糜陰道泡騰片組治療后對細(xì)菌生長均有明顯抑制作用,其細(xì)菌菌落數(shù)較基質(zhì)對照組(模型對照組)非常顯著性地減少,顯示受試藥物抗婦炎糜泡騰栓3種劑量及陽性對照藥物消糜陰道泡騰片對混合細(xì)菌感染性大鼠陰道炎及子宮頸炎模型均具有顯著的治療作用。2.2實驗大鼠陰道黏膜及子宮頸炎模型的建立對混合細(xì)菌感染性大鼠陰道炎及子宮頸炎模型治療結(jié)束,放血處死大鼠,立即剖取大鼠陰道壁黏膜(及子宮頸)組織塊標(biāo)本,放入FAA液內(nèi)浸泡固定。由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科進行組織塊標(biāo)逐級酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟、石蠟包埋,常規(guī)切片4μm,H.E染色。用顯微鏡低倍(100×)下觀察HE染色混合細(xì)菌感染性大鼠陰道炎各組每只大鼠陰道黏膜,尋找炎細(xì)胞最多處3個區(qū)域,然后在中倍(200×)下選擇上述區(qū)域3個視野,用圖像分析系統(tǒng)(Mias2000)進行半定量檢測,將3個視野所得的檢測值表示該只大鼠的炎細(xì)胞數(shù)量。實驗資料中選擇炎細(xì)胞總數(shù)、炎細(xì)胞面積總和、炎細(xì)胞面積均值、炎細(xì)胞周長總和、炎細(xì)胞周長均值、炎細(xì)胞等效圓直徑、炎細(xì)胞最大直徑、炎細(xì)胞最小直徑、炎細(xì)胞平均光密總和、炎細(xì)胞積分光密總和、炎細(xì)胞平均黑度總和共11項指標(biāo)的數(shù)值做統(tǒng)計學(xué)處理分析,結(jié)果見表1、表2和表3。從表1、表2及表3可見,采用混合細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌)感染造成大鼠陰道炎及子宮頸炎模型,由于模型對照組動物未經(jīng)藥物治療,所以,模型對照組動物陰道黏膜(及子宮頸黏膜)的病理切片檢查發(fā)現(xiàn)有明顯的炎癥表現(xiàn)。模型對照組動物陰道黏膜病理切片的炎癥經(jīng)計算機圖像分析,表現(xiàn)出炎細(xì)胞總數(shù)、炎細(xì)胞面積總和、炎細(xì)胞面積均值、炎細(xì)胞周長總和、炎細(xì)胞周長均值、炎細(xì)胞最大直徑、炎細(xì)胞最小直徑、炎細(xì)胞等效圓直徑、炎細(xì)胞平均光密總和、炎細(xì)胞積分光密總和、炎細(xì)胞平均黑度總和的數(shù)值較大,說明制備的大鼠陰道炎(及子宮頸炎)模型制備成功。2.3大鼠精子宮頸炎模型對混合細(xì)菌感染性大鼠陰道炎及子宮頸炎模型治療結(jié)束,放血處死大鼠,立即剖取大鼠(陰道壁黏膜及)子宮頸組織塊標(biāo)本,放入FAA液內(nèi)浸泡固定。由成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院病理科進行組織塊標(biāo)逐級酒精脫水,二甲苯透明,浸蠟、石蠟包埋,常規(guī)切片4μm,H.E染色。用顯微鏡低倍(100×)下觀察HE染色混合細(xì)菌感染性大鼠陰道炎各組每只大鼠子宮頸黏膜,尋找炎細(xì)胞最多處3個區(qū)域,然后在中倍(200×)下選擇上述區(qū)域3個視野,用圖像分析系統(tǒng)(Mias2000)進行半定量檢測,將3個視野所得的檢測值表示該只大鼠子宮頸黏膜的炎細(xì)胞數(shù)量。實驗資料中選擇炎細(xì)胞總數(shù)、炎細(xì)胞面積總和、炎細(xì)胞面積均值、炎細(xì)胞周長總和、炎細(xì)胞周長均值、炎細(xì)胞等效圓直徑、炎細(xì)胞最大直徑、炎細(xì)胞最小直徑、炎細(xì)胞平均光密總和、炎細(xì)胞積分光密總和、炎細(xì)胞平均黑度總和共11項指標(biāo)的數(shù)值做統(tǒng)計學(xué)處理分析。結(jié)果見表4、表5及表6。從表4、表5及表6可見,采用混合細(xì)菌(金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌)感染造成大鼠(陰道炎及)子宮頸炎模型,由于模型對照組動物未經(jīng)藥物治療,所以,模型對照組動物(陰道黏膜及)子宮頸黏膜的病理切片檢查發(fā)現(xiàn)有明顯的炎癥表現(xiàn)。模型對照組動物子宮頸黏膜病理切片的炎癥經(jīng)計算機圖像分析,表現(xiàn)出炎細(xì)胞總數(shù)、炎細(xì)胞面積總和、炎細(xì)胞面積均值、炎細(xì)胞周長總和、炎細(xì)胞周長均值、炎細(xì)胞等效圓直徑、炎細(xì)胞最大直徑、炎細(xì)胞最小直徑、炎細(xì)胞平均光密總和、炎細(xì)胞積分光密總和、炎細(xì)胞平均黑度總和的數(shù)值較大,說明制備的大鼠(陰道炎及)子宮頸炎模型制備成功。3抗婦炎糜泡騰栓不同劑量對混合細(xì)菌宮頸炎模型療效的影響抗婦炎糜泡騰栓高、中、低三種劑量及陽性對照藥物消糜陰道泡騰片對混合細(xì)菌性大鼠陰道炎及宮頸炎模型治療2周后,均有不同的治療作用。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),抗婦炎糜泡騰栓高、中、低三種劑量對混合細(xì)菌感染性大鼠陰道炎(及子宮頸炎)模型的陰道璧黏膜炎癥病理形態(tài)11項檢測指標(biāo)均有顯著的治療作用,三種劑量的療效無明顯量效關(guān)系變化。抗婦炎糜泡騰栓的高劑量對某些指標(biāo)的療效優(yōu)于等臨床用劑量的陽性對照藥物消糜陰道泡騰片(高劑量)(兩藥高劑量組均為臨床用劑量的10倍)。例如抗婦炎糜泡騰栓對大鼠陰道黏膜的炎細(xì)胞面積總和、炎細(xì)胞面積均值、炎細(xì)胞周長均值的抑制率分別為81.9%、33.8%和26.5%,均大于陽性對照藥物消糜陰道泡騰片,其抑制率僅分別為63.3%、21.7%和14.