在實(shí)驗(yàn)開始，首先對(duì)實(shí)驗(yàn)的某些必須環(huán)節(jié)（（一）1%1g100mL1×TAE緩沖液，在微波（二）60℃左右的瓊脂糖凝膠緩慢倒入膠板中，注意不要產(chǎn)憤怒泡。3-5mm之間。1×TAE（三）10×1×（四）（DNA片段是從負(fù)極向正極移動(dòng)5V/cm2/3（五）將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液中（帶手套操作（六）實(shí)驗(yàn) 大腸桿菌基因組提DNADNA,真核生物的DNA動(dòng)物組織）DNADNADNA是將分散好的組織細(xì)胞在含十二烷基硫酸鈉（SDS）KDNADNASDSKSDSEDTA（乙二胺四乙酸二鈉）存在的狀況下保持很高的活性。DNASDSDNAKDNA它能與核酸形成復(fù)合物，在高鹽溶液中（（0.7mol/LNaCl）是可溶的，當(dāng)減少溶液鹽濃度到一定程度（0.3mol/LNaCl）時(shí)，從溶液中沉淀，通過離心就可將CTABDH5α微量移液器，低溫離心機(jī)，水浴鍋，eppendorf2mLDH5α5000rpm190μLTE10μL10%SDS，1μL20mg/mLK，混勻，37℃1h；30μL5mol/LNaCl，30μLCTAB/NaCl，65℃300μL酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）5000rpm300μL（24：1）300μL10min，（85000rpm10minDNA5000rpm 如圖所示，8maker,第一條帶為正常大腸桿菌基因組，中間能夠看見含糊的兩條帶，可能為斷裂的基因組片段，下面最亮的為其它組不整潔的帶可能是電泳技術(shù)問題。RNA實(shí)驗(yàn) 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備及驗(yàn)大腸桿菌的轉(zhuǎn)化慣用化學(xué)法（CaCl2）0℃，CaCl2DNADNase（DNA）42℃短時(shí)間熱沖擊解決，促使細(xì)胞LB，0.1mol/Lcacl21ml100mlLB，37℃1.5-2h10min。4℃、4000rpm10min0.1mol/Lcacl230min0.1mol/Lcacl2分裝保存（40%1：120%）（一）Amp100μg/mL，混勻，倒入培養(yǎng)皿中。40μL20mg/mLX-Gal4μL2003h（二）200μL1μL粒（DNA>50ng30min。陰性對(duì)照：200μLDNA陽性對(duì)照：200μLDNA42℃90sec（注意：不要晃動(dòng)2min在轉(zhuǎn)化子中加入600μL不含Amp的LB液體培養(yǎng)基37℃1h（慢搖4000rpm5min，600μL待菌液完全被吸取后，37℃12-16h最佳從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌4℃5×107OD600TG1OD600055×107個(gè)/ml（OD600）DNADNADNA普通地，DNA5%，1ngcccDNA50ulDNA存于4℃。DNADNADNADNA實(shí)驗(yàn) 重組子的制備和轉(zhuǎn)PCR，聚合酶鏈反映（polymerasechainreaction，PCR）DNAPCRDNADNADNAPCRDNADNAdNTPDNA聚合酶、酶反映緩沖體系及必須的離子等所構(gòu)成。PCRDNADNA從引物3ˊ端開始按5ˊ→3ˊ方向合成DNADNAPCR100%,n2nPCR30-40DNA95℃失活30。（二）DNADNA(RecombinantDNA)技術(shù)是遺傳工程的核心技術(shù)，也是人類在基因和DNA分子水平進(jìn)行操作的技術(shù)。它涉及下列幾個(gè)環(huán)節(jié)：PCR過程中使用的熱穩(wěn)定聚合酶(Taq酶)在所復(fù)制的雙鏈分子末端加上單一DNA分子。PCREppendorfDNA（0.1μg/μl）：50μl（裂解液1%TritonX-10020mmol/lTris-HClPH8.2,2mmol/lEDTA）95℃溫浴10分鐘,10000rpm52μl50μlPCR（5U/μl，10×引物（100pmol/L）：DNAT4DNA（6）10（6）50%一、PCR技術(shù)體外擴(kuò)增DNA片Premix溶 12.5引物 引物 模板 雙蒸 PCR94℃1min94℃30sec→50℃1min72℃3min72℃5min→4℃保存,302%PCR二、DNA片段的回DNADNANaAc（pH5.2B1.5mL3mol/LNaAcC60mL70mLD6mLTEDNA300mgA）A；μLB，500μLC10000rpm30s，棄重復(fù)環(huán)節(jié)（4）（6）1rpm1min，10min，使20μLD（50℃水浴（9）15000rpm1min，（10）DNA20℃三、DNA的重0.5mLT4DNA連接 110×連接反映緩沖液 2μLPUCm-T載 9純化后的PCR產(chǎn)物 8μL20μL10μLPCR回收成 DNA實(shí)驗(yàn) 重組子轉(zhuǎn)化及篩DNA1DNADNA（TA克隆載體分子）含有對(duì)應(yīng)抗生素的抗性基DNA的細(xì)菌。DNA片段的大量拷貝。胞所編碼的N-末端發(fā)生基因內(nèi)互補(bǔ)，形成有活性的β-半乳糖苷酶，分解底物X-galDNAα不能形成α200μL甘油保存的感受態(tài)細(xì)胞，低溫融化后，加入重組質(zhì)粒，混勻30min；4290sec（2600μLAmpLB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培1h（慢搖；4000rpm5min600待菌液完全被吸取后，37片段插入多克隆位點(diǎn)后,使其編碼的α肽鏈?zhǔn)セ钚?使其不能形成α-互補(bǔ),實(shí)驗(yàn) DNA實(shí)驗(yàn)采用-70℃DNA。50 25 Tris·HCl（三羥甲基氨基甲烷）pH10 EDTA（乙二胺四乙酸）0.4 5mol/L乙酸 60冰乙 11.5 28.5DH5α菌液，RNA（一）（二）100μLΙ200μL53-5min