基于融合pcr方法的擴增登革2型病毒基因組超長cdna的構(gòu)建

傳統(tǒng)的taq酶與具有3'5racemat活性的dna聚合酶混合，以利用前者的強擴展性和后向調(diào)節(jié)功能，優(yōu)化反應溶液的組成和熱環(huán)的條件，并能特異性地延長近40kg的產(chǎn)物。但對RT-PCR而言,由于常用的逆轉(zhuǎn)錄酶如AMV,MMLV等具有較強的RNA酶H酶活性,逆轉(zhuǎn)錄合成長片段第一鏈cDNA非常困難,限制了RT-PCR擴增產(chǎn)物的長度。近年來,隨著無RNA酶H酶活性的逆轉(zhuǎn)錄酶(如SuperScriptTMⅡ,M-MLVRNA酶H-,ThermoScriptTMⅡ等)的應用,大大增加了逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA的長度,應用RT-PCR一次擴增出10kb以上cDNA分子成為可能,該技術(shù)已應用于RNA病毒基因組研究及長鏈mRNA分子突變的檢測等多個領(lǐng)域。本研究在應用長鏈RT-PCR技術(shù)擴增出登革病毒5′及3′半分子基礎上,通過優(yōu)化PCR循環(huán)條件,建立了擴增我國登革2型病毒基因組全長cDNA分子的融合PCR技術(shù),為進一步探討登革病毒致病的分子機制提供了有效的技術(shù)途徑。1材料和方法1.1鼠腦傳代培養(yǎng)方登革2型病毒D2-43株由本室于1987年自廣西登革熱患者血清中分離,經(jīng)鼠腦傳代后保存。取發(fā)病乳鼠腦,用Trizol試劑(GibcoBRL公司產(chǎn)品)提取總RNA,經(jīng)GlassMaxRNA提取試劑盒(GibcoBRL公司產(chǎn)品)純化,-70℃保存?zhèn)溆谩?.2病毒基因組檢測根據(jù)已由我室測定的D2-43病毒株基因組全序列設計引物。5′半分子逆轉(zhuǎn)錄引物:AGAACCTGTTGATTCAACAGCACCA(病毒基因組第10723~10699核苷酸);3′半分子逆轉(zhuǎn)錄引物:ATCACCCGCTCTTCACCATCTGTTAGTA(第5846~5819核苷酸)。5′半分子擴增引物:正向引物(5+),AGGGCCGAGGTCACGATTTAGGTGACACTATAGAGTTGTTAGTCTACGTGGACCGTCAAAGACAGATT(病毒基因組第1~35核苷酸,黑體為外加堿基,劃線處為SacⅠ內(nèi)切酶位點,斜體為Sp6RNA聚合酶啟動子核心序列);反向引物(5-),ATCACCCGCTCTTCACCATCTGTTAGTA(第5846~5819核苷酸)。3′半分子擴增引物:正向引物(3+),AATGACATTCCCATGACAGGACCA(第4201~4223核苷酸);反向引物(3-),AGTGTCCCGCGGAGAACCTGTTGATTCAACAGCACCATTCCATTTTC(第10723~10688核苷酸,黑體為外加堿基,劃線處為SacⅡ內(nèi)切酶位點)。引物由上海生物工程公司合成。1.3depc-pc-ms1355555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555555取總RNA15μl,加入反向引物2μl,95℃作用3min后,立即置冰浴,加入RNA酶抑制劑(GibcoBRL公司產(chǎn)品)1μl,5×第一鏈緩沖液6μl,dNTPs(Clonetech公司產(chǎn)品)2μl及SuperscriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶(GibcoBRL公司產(chǎn)品)1μl,加DEPC處理水至總體積30μl,42℃保溫3h。反應完畢,95℃滅活5min。為去除與第一鏈cDNA雜合的病毒RNA,向逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加入2URNaseH(GibcoBRL公司產(chǎn)品),37℃溫育20min后,置-20℃保存?zhèn)溆谩?.45逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的抗氧化酶系統(tǒng)分別以(5+)、(5-)及(3+)、(3-)作為登革2型病毒5′及3′半分子擴增引物。擴增采用高保真PCR系統(tǒng)(B.M.公司產(chǎn)品),取5μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物作為模板,反應液中Mg2+及dNTP濃度分別為3.75μmol/L和400μmol/L。擴增條件為:94℃變性3min(加入酶、熱啟動),94℃15s、68℃5min擴增5個循環(huán),然后94℃15s、68℃5min(每個循環(huán)遞增10s)擴增20個循環(huán),最后于72℃延伸10min。反應產(chǎn)物分別用DNA凝膠純化試劑盒(Qiagen公司產(chǎn)品)回收。1.5抗混合反應及pcr擴增各取約200ng5′及3′半分子RT-PCR產(chǎn)物作為模板,以(5+)及(3-)為引物采用長模板PCR系統(tǒng)(B.M.公司產(chǎn)品)進行融合PCR。反應液中Mg2+和dNTP濃度分別為3.75mmol/L和400μmol/L。首先進行一個循環(huán)的融合反應,然后加入長鏈擴增引物進行全長cDNA的擴增。擴增條件為:94℃3min(加入酶,熱啟動),94℃15s,68℃6min1個循環(huán),94℃15s(加入引物),68℃9min25個循環(huán)(后15個循環(huán)每循環(huán)遞增10s),最后于72℃延伸10min。反應結(jié)束后,取2μl反應液進行1%瓊脂糖凝膠電泳。1.6擴增條件優(yōu)化取約10ng制備的全長cDNA作為模板,用高保真PCR系統(tǒng)(B.M.公司產(chǎn)品)對全長cDNA5′端第1~2550核苷酸序列進行擴增。擴增條件:94℃3min(加入酶,熱啟動),94℃30s、60℃30s、68℃2min5個循環(huán),94℃30s、65℃30s、72℃2min25個循環(huán),最后于72℃延伸10min。反應產(chǎn)物用DNA凝膠純化試劑盒(Qiagen公司)回收后克隆于pGEM-T載體(Promega公司產(chǎn)品),分別用菌落PCR及酶切鑒定陽性克隆,并在377A型自動測序儀進行序列測定。2預期大小構(gòu)造2.1以SuperⅡ逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈,應用高保真PCR系統(tǒng)擴增出登革2型病毒D2-43株5′及3′半分子cDNA,長度約5kb,與預期大小是一致的(圖1)。2.2以5′及3′半分子cDNA為模板,應用長模板PCR系統(tǒng)以融合PCR方法實現(xiàn)了登革病毒全長cDNA分子的擴增,長度約為11kb(圖1)。2.3為進一步驗證用融合PCR方法制備的登革2型病毒全長cDNA的特異性,對含復雜二級結(jié)構(gòu)的5′非編碼區(qū)進行序列測定,結(jié)果顯示擴增產(chǎn)物序列與登革2型病毒D2-43株完全一致(測序圖略)。3融合pcr方法反向遺傳學技術(shù)由病毒的全長cDNA克隆體外轉(zhuǎn)錄來獲取RNA病毒,通過對cDNA克隆的操作而實現(xiàn)了對RNA病毒的基因操作,在深入闡明病毒基因組的結(jié)構(gòu)和功能、構(gòu)建新型病毒載體以及篩選疫苗候選株等方面顯示出廣闊的應用前景。近年來長鏈RT-PCR技術(shù)的迅猛發(fā)展為簡化構(gòu)建全長克隆的繁瑣操作提供了可能,應用該技術(shù)已經(jīng)成功獲得如HAV(7.5kb)、HIV(9kb)、PototavirusY(10kb)等病毒的全基因組序列。盡管如此,有些病毒的二級結(jié)構(gòu)過于復雜或不易分離培養(yǎng)而難以得到較高的滴度,逆轉(zhuǎn)錄合成完整的第一鏈cDNA有時仍較困難。對制備這些病毒全長cDNA來說,融合PCR技術(shù)具有其獨特性:將分段擴增、相互部分重疊、覆蓋整個基因組的兩段或幾段RT-PCR產(chǎn)物進行融合反應,以形成基因組全長cDNA,再以此為模板進行長鏈PCR,可以成功實現(xiàn)基因組全長cDNA分子的擴增。已有報道HIV病毒cDNA分4段擴增后再用此方法成功獲得了近11kb的cDNA;TBE病毒基因組半分子RT-PCR擴增產(chǎn)物利用該技術(shù)實現(xiàn)了全基因組的擴增。我們在實現(xiàn)半分子擴增的基礎上,應用融合PCR方法也成功擴增出登革2型病毒基因組全長cDNA分子。我們在半分子擴增中采用高保真PCR系統(tǒng),擴增產(chǎn)物首先經(jīng)試劑盒純化,再取等量的半分子產(chǎn)物作為模板進行融合反應。在Gritsun等所建立的系統(tǒng)中,融合反應模板的擴增選用pfu聚合酶,該酶具有很強的3′~5′外切酶活性,保真性更高,但同時也限制了擴增產(chǎn)物的長度(一般很難超過5kb),需要進行多步的融合反應以形成基因組全長cDNA。我們所選用的高保真PCR系統(tǒng)具有部分3′~5′外切酶的活性,其擴增產(chǎn)物的長度可以達5kb以上,只需要進行一步融合反應即可實現(xiàn)基因組全長cDNA分子的擴增,但該系統(tǒng)聚合酶的保真性要略低于pfu。因此本研究對反應條件進行了優(yōu)化,以最大限度降低錯配率。Mg2+及dNTP對聚合酶保真性有很大影響,因此在能夠?qū)崿F(xiàn)長鏈擴增的Mg2+及dNTP濃度范圍內(nèi),我們均選擇盡量低的濃度;以低數(shù)量模板起始的PCR反應,初期的錯配模板會在后期反應中呈幾何指數(shù)級放大,在半分子擴增及融合反應時我們均采用盡量多的模板和盡可能少的循環(huán)次數(shù)。為進一步