登革病毒包膜e蛋白區(qū)denved3的結(jié)構(gòu)與功能

病毒登格病毒（denv）是黃病毒屬的一種單體正鏈rna病毒，以昆蟲為手段，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。感染可引起普遍發(fā)熱、登格熱、嚴(yán)重的登格血熱和登格斯坦病（dhf）、登格斯坦?。╯ds）和登格斯坦?。╠hf）等疾病，嚴(yán)重危及人類健康。成熟的登革病毒顆粒直徑約50nm,內(nèi)部含感染性的單股RNA分子,長約11kb,含單一的可讀框,首先翻譯出一個(gè)含約3500個(gè)氨基酸殘基的聚蛋白前體(NH2-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-COOH),而后被位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的宿主信號肽酶和病毒蛋白酶切割成3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白(C、prM/M和E)和7個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。其中,包膜糖蛋白E為病毒包膜的重要組成部分,根據(jù)包膜E蛋白的抗原性不同,登革病毒可分為4個(gè)血清型(DENV1、DENV2、DENV3和DENV4),感染其中的任何一型均可產(chǎn)生對此種血清型病毒的終身免疫,但不同型之間的交叉保護(hù)性免疫較為短暫。其中,病毒感染產(chǎn)生的非中和抗體還可介導(dǎo)抗體依賴的感染增強(qiáng)現(xiàn)象(antibodydependentenhancement,ADE),即當(dāng)初次感染某一型登革病毒產(chǎn)生相應(yīng)抗體后,再次感染其它型別的登革病毒時(shí),抗體或亞中和活性抗體非但不能起到中和病毒的作用,反而與登革病毒顆粒結(jié)合形成抗原-抗體復(fù)合物,通過與單核細(xì)胞或巨噬細(xì)胞膜上的IgG的Fc受體(FcR)結(jié)合,進(jìn)入到這些細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行繁殖,引起單核細(xì)胞系感染,隨即釋放出裂解補(bǔ)體C3的酶、血管通透因子和凝血活化酶,進(jìn)而導(dǎo)致彌漫性血管內(nèi)凝血、休克等一系列病理過程,導(dǎo)致嚴(yán)重的DHF和DSS的發(fā)生。E蛋白構(gòu)成病毒顆粒的突起,具有介導(dǎo)病毒吸附、與宿主細(xì)胞膜融合、病毒組裝、誘發(fā)中和抗體產(chǎn)生保護(hù)性免疫等多種重要的生物學(xué)功能。按照功能的差異,登革病毒E蛋白又分為I、II、III三個(gè)功能區(qū)(envelopeproteindomain,ED)(也稱ED1、ED2、ED3),其中ED3具有免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu),是登革病毒與細(xì)胞受體結(jié)合的功能區(qū)域,決定著登革病毒感染的靶細(xì)胞種類,ED3結(jié)構(gòu)的突變也將導(dǎo)致病毒毒力的減弱或使病毒逃逸于機(jī)體的免疫中和效應(yīng)。因此,對登革病毒ED3的研究也是近年來關(guān)注的熱點(diǎn),通過對ED3的結(jié)構(gòu)和功能研究,將有助于理解登革病毒與其敏感細(xì)胞間的相互作用和致病的分子機(jī)制,為在不同細(xì)胞上登革病毒病受體的篩選鑒定、特異性診斷、疫苗研究和抗病毒藥物的設(shè)計(jì)等提供理論依據(jù)。本文就近年來國內(nèi)外登革病毒包膜ED3的研究進(jìn)展綜述如下。1.denv3蛋白的結(jié)構(gòu)登革病毒包膜E蛋白由495～501個(gè)氨基酸殘基組成,分子量約為55～60kDa,現(xiàn)已獲得DENV2和DENV3E蛋白的晶體結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示,登革病毒的E蛋白刺突是由兩個(gè)單體分子以反向平行方式構(gòu)成的同源二聚體,鑲嵌于成熟的登革病毒顆粒表面,每個(gè)登革病毒成熟顆粒又由180個(gè)這樣的同源二聚體E蛋白構(gòu)成了病毒的表面突起。E蛋白可形成3個(gè)不同的結(jié)構(gòu)域,呈β桶狀的ED1,位于E蛋白單體中央,也稱中心區(qū);呈指樣結(jié)構(gòu)的ED2,參E蛋白二聚體的形成和病毒與宿主細(xì)胞的融合過程;ED3由E蛋白C端的第303-395位氨基酸殘基構(gòu)成且延伸至病毒的最表面,含有大量天冬氨酸及堿性氨基酸,它具有免疫球蛋白IgG樣結(jié)構(gòu),其β桶狀結(jié)構(gòu)的中心軸與病毒表面垂直,并以一個(gè)15個(gè)氨基酸殘基的短鏈與ED1區(qū)相連。Volk等對DENV4的可溶性ED3蛋白晶體的X-ray研究發(fā)現(xiàn),ED3蛋白是一個(gè)由3組β片層排列成的β桶狀結(jié)構(gòu),第一組β片層頂端的外表面暴露于病毒顆粒表面,包括β1、β2、β5和β7F306-E314殘基位點(diǎn)(β1,凸起的309–312)\T320-Y326(β2),R350-I351(β5)a和V365-E370(β7),在一個(gè)E蛋白的二聚體中大約一半的這種片層結(jié)構(gòu)與ED2上相對的蛋白質(zhì)分子相結(jié)合。第二組β片層包括了β3和β6的殘基位點(diǎn)C333-K334(β3)和L357-A358(β6),這組片層的外表面與ED1相對。第三組β片層包括β4、β8和v9位點(diǎn)的氨基酸殘基F337-R340、D375-I380(β8)和L387-F392(β9),這組片層離病毒顆粒表面最遠(yuǎn)(圖1)。所有的這三組β片層也存在于DENV2和DENV3的ED3蛋白結(jié)構(gòu)上,但β5不同,DENV3(R348-L349)和DENV4(R350-I351)病毒的β5只有兩個(gè)氨基酸長,而在DENV2上扭曲的β5(V347-L351)包含了N-末端上附加的三個(gè)氨基酸殘基(圖2)。在整個(gè)黃病毒屬中,β1-9片層編碼序列均高度保守,一個(gè)β片層穿過4個(gè)β片層,β8、β9穿過全部結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象在所有的黃病毒中均存在。Wang等在比較了森林動(dòng)物登革病毒隔離株P(guān)75-215和人類登革病毒隔離株703-704后發(fā)現(xiàn),在ED3上有5個(gè)氨基酸殘基(K340R,M342V,I335T,I364V和A382V)的變異,推測這5個(gè)氨基酸殘基的保守性變異可能導(dǎo)致了登革病毒從蚊到猴子的傳播遷變?yōu)槲玫饺说膫鞑?也就是說人登革病毒的出現(xiàn),部分由于ED3上重要氨基酸的改變,進(jìn)而使病毒的受體結(jié)合性質(zhì)發(fā)生了改變而造成的。2.denv2基因回復(fù)突變體的結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特性病毒感染細(xì)胞的前提是吸附細(xì)胞,其本質(zhì)是病毒與細(xì)胞表面受體的特異性結(jié)合?，F(xiàn)普遍認(rèn)為ED3介導(dǎo)了病毒與細(xì)胞的結(jié)合,為細(xì)胞受體的結(jié)合位點(diǎn),原因如下:ED3具有許多結(jié)合細(xì)胞受體特有的免疫球蛋白樣折疊;ED3具有的loop環(huán)結(jié)構(gòu)使它比ED1和ED2要遠(yuǎn)離病毒表面;不同可溶形式的ED3蛋白已被證實(shí)可以阻斷西尼羅病毒和登革病毒對細(xì)胞的感染。運(yùn)用分子單克隆抗體、酵母表面展示和對DENV2ED3的隨機(jī)誘變等技術(shù)方法,現(xiàn)已描繪出DENV2ED3的部分中和表位K310、I312、P332、L389和W391,用相應(yīng)的單克隆抗體封閉這些表位后,可降低DENV2對其敏感細(xì)胞的感染。登革病毒在不同細(xì)胞上的受體研究一直是登革病毒研究的熱點(diǎn)之一,目前認(rèn)為DENV受體包括蛋白質(zhì)類、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)、硫酸乙酰肝素(heparansulfate,HS)和與脂多糖連接的CD14相關(guān)分子等,其均與病毒和細(xì)胞的吸附有關(guān),而由ED3參與的受體主要為GAG、HS和一些蛋白質(zhì)分子。GAG是由二糖重復(fù)單位(氨基己糖、己糖醛酸或半乳糖)組成的線性雜多糖,其重復(fù)二糖骨架的化學(xué)結(jié)構(gòu)廣泛分布于多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中,如Vero、CHO等。Rostand等發(fā)現(xiàn)DENV2的吸附與病毒和表達(dá)在基質(zhì)及細(xì)胞膜上的GAG結(jié)合有關(guān)。通過對其結(jié)合的序列分析得出:為于I區(qū)側(cè)面、III區(qū)終端的E284-310位氨基酸和位于Ⅲ區(qū)尾部的E386-411位氨基酸具有2個(gè)GAG結(jié)合區(qū),能夠與細(xì)胞表面的GAG結(jié)合。實(shí)驗(yàn)證實(shí)用GAG裂解酶除去Vero細(xì)胞上的GAG后,病毒與細(xì)胞的結(jié)合率下降;DENV2與GAG表達(dá)缺陷的CHO細(xì)胞的結(jié)合率也比野生型有大幅下降。但其它GAG的細(xì)胞系仍容易被黃病毒感染,說明黃病毒與GAG的結(jié)合并不是病毒進(jìn)入這些細(xì)胞所必需的,但它們的結(jié)合仍有助于病毒的聚集,從而促進(jìn)病毒與宿主細(xì)胞表面更特異的受體結(jié)合。硫酸乙酰肝素(HS)是一類廣泛存在于細(xì)胞表面及基質(zhì)中的高度硫酸化的氨基葡聚糖,表面具有大量負(fù)電荷,具有介導(dǎo)病原體吸附等多種生物學(xué)功能。研究發(fā)現(xiàn)ED3的284-310位和386-411位可能為HS的結(jié)合區(qū)。HS的硫酸化對E蛋白與受體的結(jié)合是必需的,如用含硫酸化抑制劑的培養(yǎng)基培養(yǎng)Vero細(xì)胞,細(xì)胞存活并不受影響,但在很大程度上抑制了其與E蛋白的結(jié)合。但Martinez-Barragan等發(fā)現(xiàn),Vero細(xì)胞上另一種糖蛋白也與DENV的吸附相關(guān),并且不受HS影響,提示還有其他高親和的受體存在,病毒與受體的結(jié)合并非單一分子,且不同細(xì)胞發(fā)揮受體作用的分子也不盡相同。近年來,運(yùn)用VOPBA和質(zhì)譜等技術(shù)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些DENV易感細(xì)胞上與DENV吸附有關(guān)的蛋白質(zhì)分子,推測為DENV的受體分子,如白紋伊蚊細(xì)胞上的40kDa、45kDa、67kDa、80kDa蛋白質(zhì),人巨噬細(xì)胞上的HSP70/HSP90等。最近,Kuadkitkan等利用2D-VOPBA和質(zhì)譜技術(shù)在DENV2感染的C6/36細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了抗增殖蛋白(prohibitin,PHB)受體,PHB基因是一種有效的腫瘤抑制基因,廣泛分布于不同種屬的各種生物細(xì)胞中,對細(xì)胞代謝、生長、分化、衰老以及凋亡等諸多方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。通過抗體感染抑制實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),PHB的單克隆抗體可抑制DENV對C6/36細(xì)胞的感染,推測是PHB的單克隆抗體封閉了PHB受體,從而抑制了病毒的吸附;進(jìn)一步的CO-IP實(shí)驗(yàn)表明,PHB可與DENV2E蛋白發(fā)生特異性的結(jié)合,證實(shí)了PHB為DENV2在C6/36細(xì)胞上特異性受體。運(yùn)用同樣的方法,Jindadamrongwech等在DENV2感染的HepG2細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了90kDa的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78[glucoseregulatedprotein78,GRP78(Bip)],它是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白,能在多種細(xì)胞表面表達(dá),可結(jié)合DENV2ED3介導(dǎo)病毒的入侵;Thepparit等在相同的細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了37/67kDa的層黏連蛋白受體,37kDa是蛋白前體,二聚體?；癁?7kDa的成熟蛋白受體,它作為一種非整聯(lián)蛋白性質(zhì)的蛋白受體分子,介導(dǎo)細(xì)胞與層黏連蛋白的相互作用,運(yùn)用該受體的單克隆抗體或重組表達(dá)的蛋白質(zhì)處理的HepG2細(xì)胞可抑制DENV1的感染,證實(shí)其為DENV1的特異性受體。3.denv1與質(zhì)膜融合的機(jī)制病毒的感染過程包括病毒的吸附-穿入-脫殼-基因組復(fù)制-病毒顆粒的組裝和釋放。登革病毒與細(xì)胞表面受體結(jié)合后,必須完成病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合過程,才能將核衣殼釋放到細(xì)胞質(zhì)中,啟動(dòng)病毒的復(fù)制與增殖過程。不同于其它通過融合蛋白與細(xì)胞受體或共受體結(jié)合引發(fā)的病毒融合過程,登革病毒的膜融合過程是由E蛋白介導(dǎo)的病毒被內(nèi)吞到內(nèi)含體中,由內(nèi)吞體中的酸性pH條件所觸發(fā)的病毒包膜與細(xì)胞質(zhì)膜的融合過程。包膜ED3在介導(dǎo)病毒與宿主受體的融合中具有重要的功能。在中性和微堿性的條件下,成熟病毒體表面的E蛋白以反向平行構(gòu)成的同源二聚體的形式存在,ED2的融合肽被ED1的糖側(cè)鏈所封閉。病毒感染宿主細(xì)胞,包膜ED3蛋白與宿主細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合,發(fā)生受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,病毒進(jìn)入細(xì)胞的內(nèi)含體,酸性的內(nèi)含體環(huán)境觸發(fā)E蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生重排,由二聚體解聚重排成呈發(fā)卡結(jié)構(gòu)的三聚體,ED3從E蛋白的末端回折深入到ED1與ED2形成的狹縫處,ED2暴露出疏水的融合肽,并以融合肽插入質(zhì)膜的方式將E蛋白錨定于質(zhì)膜上,這種變構(gòu)傳遞給病毒包膜結(jié)合宿主細(xì)胞膜時(shí)所需的能量。然后,E蛋白自身回折拉近與其N端融合肽相連的質(zhì)膜和與跨膜區(qū)相連的病毒包膜的距離,最終完成膜的融合(圖3)。Nayak等在對DENV1與質(zhì)膜融合過程的研究中發(fā)現(xiàn),其E蛋白結(jié)構(gòu)域ED1和結(jié)構(gòu)域ED3之間的界面上存在一個(gè)由4個(gè)極性氨基酸殘基組成的束狀結(jié)構(gòu),其中兩個(gè)殘基His-282和His-317是DENV1所獨(dú)有的,能在內(nèi)含體低pH條件下觸發(fā)E蛋白構(gòu)象改變。其中,His-317是關(guān)鍵部分,可在低pH時(shí)破壞結(jié)構(gòu)域ED1和結(jié)構(gòu)域ED3之間的界面并加固融合后E蛋白三聚體在對內(nèi)含體pH降低時(shí)作出反應(yīng),觸發(fā)融合構(gòu)象的改變。結(jié)構(gòu)域ED1和結(jié)構(gòu)域ED3之間的界面出現(xiàn)的這種極化束狀結(jié)構(gòu)說明,DENV1E蛋白三聚體比DENV2E蛋白三聚體更加穩(wěn)固,也就是說如果要使DENV1發(fā)生融合,需要更低的pH值。4.fgloop基因病毒的毒力是指病毒的侵襲力和誘發(fā)細(xì)胞病變引起炎癥的能力,其影響因素很多,凡能影響病毒生活周期的因素均可影響病毒的毒力。有研究者通過感染性cDNA克隆定點(diǎn)突變、中和逃逸突變株和由感染性cDNA克隆構(gòu)建的病毒嵌合體等方法,確定了E蛋白上不同的病毒毒力決定簇,并按區(qū)域進(jìn)行了劃分,如連接ED1和ED2區(qū)的極性鉸鏈區(qū)、prM與E蛋白的交界處、融合肽、E蛋白的糖基化位點(diǎn)和ED3區(qū)等。由于包膜ED3主要參與病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合,它的改變將影響病毒對靶細(xì)胞的識(shí)別,因此作為一個(gè)重要的毒力決定簇而引起人們關(guān)注。登革病毒包膜ED3區(qū)外側(cè)F和Gβ-片層之間有個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu),稱FGloop,它含有保守的Arg-GlyAsp(RGD)模體,是公認(rèn)的結(jié)合素類受體,如纖連蛋白III型受體,它的突變將影響病毒與細(xì)胞表面糖胺聚糖類分子的結(jié)合,導(dǎo)致E蛋白發(fā)生錯(cuò)誤折疊,未折疊的E蛋白停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi),延遲病毒顆粒的組裝,從而降低了病毒滴度,減弱了病毒的侵襲力。Erb等利用DENV2感染性cDNA克隆定點(diǎn)突變的方法,研究了FGloopAAS381-386序列突變、缺失株對C6/36、Vero、HepG2細(xì)胞及伊蚊的感染影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)FGloopAAS381-386序列突變、缺失株仍可在C6/36細(xì)胞中進(jìn)行感染和穩(wěn)定復(fù)制,而在伊蚊和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中只能進(jìn)行初步感染,復(fù)制的子代病毒序列會(huì)發(fā)生突變,不能穩(wěn)定復(fù)制,也就是說FGloop是登革病毒在伊蚊和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中增殖所必需的,進(jìn)一步的抗體阻斷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),運(yùn)用特異性3H5單克隆抗體阻斷FGloop位點(diǎn)后,登革病毒感染細(xì)胞的能力下降,證實(shí)FGloop是登革病毒抗體特異的結(jié)合位點(diǎn),它的突變將大大影響病毒對其敏感細(xì)胞的毒性。在對