透析和超濾

(DialysisandUltrafiltration)

1．透析是利用蛋白質(zhì)等生物大分子不能透過半透膜而進(jìn)行純化的一種方法。有以下幾種方法：脫鹽透析：將含鹽的生物大分子溶液裝入透析袋內(nèi)。并將袋口扎好放入裝有蒸餾水的大容器中，用攪拌方法使蒸餾水不斷流動經(jīng)過一段時(shí)間后，透析袋內(nèi)除大分子外，小分子鹽類透過半透膜進(jìn)入蒸餾水中，使膜內(nèi)外鹽濃度達(dá)到平衡。如在透析過程中更換幾次大容器中的液體，可以使透析袋內(nèi)的溶液達(dá)到脫鹽的目的。脫鹽透析是應(yīng)用最廣泛的一種透析方法。透析平衡透析：也是常用的透析方法之一。方法是將裝有生物大分子的透析袋裝入盛有一定濃度的鹽溶液或緩沖液的大容器中，經(jīng)過透析，袋內(nèi)外的鹽濃度（或緩沖液pH）一致，從而有控制地改變被透析溶液的鹽濃度（或pH）。反透析：將透析袋放入高濃度吸水性強(qiáng)的多聚物溶液中，透析袋內(nèi)溶液中的水便迅速被袋外多聚物所吸收，從而達(dá)到袋內(nèi)液體濃縮的目的。這種方法稱為“反透析”?？捎米龇赐肝龅亩嗑畚镉芯垡叶迹≒olyethyleneglycol,PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PolyvinylPyrrolidone,PVP）、右旋糖、蔗糖等。透析用的半透膜很多，玻璃紙、棉膠、動物膜、皮紙等都可用來制作半透膜。2．透析膜的種類：可用動物膜和玻璃紙等，但用的最多的還是用纖維素制成的透析膜，截留分子量MwCO（即留在透析袋內(nèi)的生物大分子的最小分子量，縮寫為MwCO）通常為1萬左右。商品透析袋制成管狀，為防干裂，出廠時(shí)都用10％的甘油處理過，并含有極微量的硫化物(0.1%)、重金屬和一些具有紫外吸收的雜質(zhì)，用前必須除去。3．透析袋的處理：方法一：可先用50％乙醇煮沸1小時(shí)，再依次用50％乙醇、0.01mol/L碳酸氫鈉和0.001mol/LEDTA溶液洗滌，最后用蒸餾水沖洗即可使用。（50％乙醇處理對除去具有紫外吸收的雜質(zhì)特別有效。）方法二：也可用蒸餾水將透析袋煮沸15分鐘，用蒸餾水徹底清洗后即可使用。從此時(shí)起取用透析袋必須戴手套（或洗干凈手）。使用后的透析袋洗凈后可存于4℃蒸餾水中，確保透析袋始終浸沒在溶液內(nèi)。用時(shí)必須仔細(xì)檢查，不漏時(shí)方可重復(fù)使用。若長時(shí)間不用，可加少量NaN3，以防長菌。4透析方法：使用時(shí)，先檢查透析袋是否完好無損？裝量：通常要留三分之一至一半的空間，以防透析過程中，透析的小分子量較大時(shí)，袋外的水和緩沖液過量進(jìn)入袋內(nèi)將袋漲破。為了加快透析速度，除多次更換透析液外，還可使用磁子攪拌。透析的容器要大一些，可以使用大燒杯、大量筒和塑料桶。檢查透析效果的方法是：用1％BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％AgNO3檢查NaCl、KCl等。超過濾1.超濾法是利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜，對生物大分子溶液進(jìn)行過濾（常壓、加壓或減壓），使大分子保留在超濾膜上面的溶液中，小分子物質(zhì)及水過濾出去，從而達(dá)到脫鹽、更換緩沖液或濃縮的目的。這種利用超濾膜過濾分離大分子和小分子物質(zhì)的方法叫做超濾法離子交換柱層析法分離蛋白質(zhì)層析技術(shù)常用。層析系統(tǒng)包括兩個(gè)相，一為固定相，一為流動相。當(dāng)以流動相流過加有樣品的固定相時(shí)，由于樣品各組分的理化性質(zhì)（吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等）的差異，受固定相的阻力與流動相的推力的影響不同，因而各組分在固定相與流動相之間的分配也不同，從而使各組分以不同的速度移動而達(dá)到分離的目的。1．按固定相和流動相所處的狀態(tài)分類：可以分為液相層析和氣相層析。2．按層析原理分類：(1)吸附層析(AdsorptionChromatography)(2)分配層析(PartitionChromatography)(3)離子交換層析(IonExchangerChromatography)(4)凝膠層析(GelChromatography)(5)親和層析(AffinityChromatography)3．按操作方式不同分類(1)紙層析(PaperChromatography)(2)薄層層析(ThinLayerChromatography)。(3)柱層析(colunmChromatography)4離子交換柱層析是利用離子交換劑對各種離子有不同的親和力，來分離混合物中各種離子的層析技術(shù)。離子交換劑是由不溶于水的基質(zhì)和共價(jià)結(jié)合在基質(zhì)（母體）上的帶電功能基團(tuán)組成。帶電功能基團(tuán)上還結(jié)合有可以移動的、與功能基團(tuán)帶相反電荷的反離子。反離子可以被帶同種電荷的其他離子取代而發(fā)生可逆的離子交換，這個(gè)過程中基質(zhì)的性質(zhì)不發(fā)生改變。可分幾類：離子交換纖維素：在纖維素分子結(jié)構(gòu)上，連接一定的離子交換基團(tuán)生成的離子交換纖維素。如DEAE-纖維素(二乙基氨乙基纖維素，-OCH2CH2N+H（C2H5）2)、羧甲基(CM)纖維素離子交換樹脂：以不溶性的人工合成高分子為母體的離子交換樹脂，如聚苯乙烯樹脂等。離子交換凝膠：以凝膠為母體，如葡聚糖，結(jié)合一定的離子基團(tuán)生成的離子交換葡聚糖凝膠；瓊脂糖等。如DEAE-SephadexA25、A50，CM--SephadexC25。離子交換劑的作用原理如下：陽離子交換劑分子中具有酸性基團(tuán)，能和流動相中的陽離子進(jìn)行交換。R—S03-H++Na+==R—S03-Na++H+陰離子交換劑分子中具有堿性基團(tuán)，能和流動相中的陰離子進(jìn)行交換。R—N+(CH3)30H-+Cl-==R—N+(CH3)3C1-+OH-離子交換劑的選擇操作要點(diǎn)1．交換劑的預(yù)處理、再生和轉(zhuǎn)型酸