[圖片]2.1.1植物細胞工程的基本技術(shù)目錄壹植物組織培養(yǎng)技術(shù)貳植物體細胞雜交技術(shù)CONTENTS操作水平

細胞工程（cellengineering)是指應(yīng)用細胞生物學(xué)、分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué)等學(xué)科的原理和方法，通過細胞、細胞器或組織水平上的操作，有目的地獲得特定的細胞或組織、器官、個體或其產(chǎn)品的一門綜合性的生物工程。原理和方法目的動物細胞工程植物細胞工程植物組織培養(yǎng)植物體細胞雜交1902年，哈伯蘭特，提出細胞全能性的理論。1958年，斯圖爾德，發(fā)現(xiàn)胡蘿卜的體細胞可分化為胚，為細胞全能性理論提供了強有力的支持。1960年，科金，用真菌的纖維素酶分解番茄根的細胞壁，成功獲得了原生質(zhì)體。1964年，古哈，在培養(yǎng)毛曼陀羅的花藥時，首次得到了由花藥中的花粉粒發(fā)育而來的胚。1971年，卡爾森，誘導(dǎo)煙草種間原生質(zhì)體融合，獲得了第一株體細胞種間雜種植株。1974年，土壤農(nóng)桿菌的Ti質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)。之后，該質(zhì)粒應(yīng)用于植物分子生物學(xué)領(lǐng)域，促進了植物細胞工程與分子生物學(xué)技術(shù)的緊密結(jié)合。植物細胞工程的發(fā)展歷程1975年，米爾斯坦和科勒，創(chuàng)立單克隆抗體技術(shù)1890年，希普，世界上首例胚胎移植成功1907年，哈里森，首創(chuàng)了動物組織體外培養(yǎng)法1951年，張明覺，發(fā)現(xiàn)哺乳動物精子獲能現(xiàn)象1958年，格登，體細胞核移植成功1959年，試管家兔誕生1978年，胚胎分割移植工程1981年，埃文斯，分離和培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞1996年，克隆羊誕生2006年，山中伸彌，獲得誘導(dǎo)多能干細胞2014年，單細胞基因組測序進行遺傳病篩查的試管嬰兒誕生動物細胞工程的發(fā)展歷程從社會中來

“其茅葺，其葉青青，猶綠衣郎，挺節(jié)獨立，可敬可慕。迨（dài）夫開也，凝情瀼（ráng）露，萬態(tài)千妍，薰風(fēng)自來，四坐芬郁，豈非入蘭室乎！豈非有國香乎”這是我國歷史上第一部蘭譜——《金漳蘭譜》（宋·趙時庚）中對蘭花的一段描述。

從古至今，我國人民都把蘭花看作高潔、典雅的象征，很多人喜歡養(yǎng)蘭花。但是，蘭花種子通常發(fā)育不全，在自然條件下萌發(fā)率極低；傳統(tǒng)分株繁殖的方法又存在繁殖周期長、繁殖率低等問題，如果靠自然繁殖，蘭花的價格可想而知了。如何能讓名貴的蘭花大量、快速地繁殖，從而走入尋常百姓家呢？植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物組織培養(yǎng)技術(shù)全能性：細胞經(jīng)過分裂和分化后，仍然具有產(chǎn)生完整生物體或分化成其他各種細胞的潛能。實例：胡蘿卜韌皮部細胞發(fā)育成完整植株受精卵發(fā)育成個體（動植物）蜜蜂受精卵發(fā)育成工蜂，卵細胞發(fā)育成雄峰用一片葉子、一片花瓣、一?；ǚ鄯敝吵鲂碌闹仓觏g皮部細胞細胞團塊根或芽幼苗胡蘿卜植株葉子花粉花瓣細胞體現(xiàn)細胞全能性的原因：生物體的每個細胞中都含有發(fā)育成為完整個體所需的全部遺傳物質(zhì)。①不體現(xiàn)全能性的實例：②不體現(xiàn)全能性的原因：基因在特定時間、空間條件下選擇性表達芽原基的細胞只能發(fā)育為芽葉原基的細胞只能發(fā)育為葉植物細胞表現(xiàn)出全能性的條件：①離體；②一定的營養(yǎng)物質(zhì)、植物激素；③適宜的溫度、pH、光照、無菌等外界條件植物組織培養(yǎng)技術(shù)生長點葉原基芽軸芽原基枝芽結(jié)構(gòu)示意圖葉原基的細胞只能發(fā)育為葉芽原基的細胞只能發(fā)育為芽在特定的時間和空間條件下，細胞中的基因會選擇性表達植物組織培養(yǎng)技術(shù)植物組織培養(yǎng)(planttissueculture)是指將離體的植物器官、組織或細胞等，培養(yǎng)在人工配制的培養(yǎng)基上，給予適宜的培養(yǎng)條件，誘導(dǎo)其形成完整植株的技術(shù)。植物組織培養(yǎng)技術(shù)接種外植體誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)生芽誘導(dǎo)生根移栽成活植物組織培養(yǎng)技術(shù)接種外植體誘導(dǎo)愈傷組織誘導(dǎo)生芽誘導(dǎo)生根移栽成活脫分化再分化再分化外植體脫分化愈傷組織再分化芽、根試管苗移栽完整植株探究·實踐--菊花的組織培養(yǎng)實驗原理外植體愈傷組織芽、根脫分化再分化生長發(fā)育植物細胞一般具有全能性脫分化再分化讓已經(jīng)分化的細胞，經(jīng)過誘導(dǎo)后，失去其特有的結(jié)構(gòu)和功能而轉(zhuǎn)變成未分化的細胞的過程。排列疏松無而無規(guī)則，是一種高度液泡化的，呈無定形狀的薄壁細胞。愈傷組織愈傷組織在培養(yǎng)過程中重新分化根或芽等器官的過程。探究·實踐--菊花的組織培養(yǎng)直接途徑間接途徑外植體胚狀體幼苗外植體胚狀體幼苗愈傷組織胡蘿卜根韌皮部的細胞愈傷組織胚狀體幼苗胡蘿卜胚狀體：離體培養(yǎng)條件下，沒有經(jīng)過受精過程，但是經(jīng)過了胚胎發(fā)育過程所形成的胚狀類似物，因而統(tǒng)稱為體細胞胚或胚狀體。胚狀體途徑探究·實踐--菊花的組織培養(yǎng)Ⅰ.用酒精擦拭雙手和超凈工作臺臺面Ⅱ.外植體的消毒①消毒流水

沖洗

→酒精消毒30s

→無菌水清洗2～3次

→次氯酸鈉溶液處理30min

→無菌水清洗2～3次探究·實踐--菊花的組織培養(yǎng)將消過毒的外植體置于無菌培養(yǎng)皿中→用無菌濾紙吸去表面的水分→用解剖刀將外植體切成0.5～1cm長的小段。②外植體的切段防止雜菌生長：①雜菌與培養(yǎng)物競爭（種間競爭）營養(yǎng)；②產(chǎn)生有害物質(zhì)危害培養(yǎng)物。在酒精燈火焰旁，將外植體的1/3～1/2插入誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中。用封口膜或瓶蓋封蓋瓶口，并在培養(yǎng)瓶上作好標(biāo)記。③接種外植體探究·實踐--菊花的組織培養(yǎng)注意：接種時注意外植體的方向，不要倒插。（形態(tài)學(xué)上端朝上，下端朝下）探究·實踐--菊花的組織培養(yǎng)④誘導(dǎo)愈傷組織將接種了外植體的錐形瓶或植物組織培養(yǎng)瓶置于18～22℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，定期觀察和記錄愈傷組織的生長情況。（脫分化）注意：該過程一般不需要光照。有光易形成維管組織，不易形成愈傷組織。探究·實踐--菊花的組織培養(yǎng)高細胞分裂素/低生長素細胞分裂素與生長素比例適宜高生長素/低細胞分裂素產(chǎn)生愈傷組織產(chǎn)生不定根產(chǎn)生不定芽探究·實踐--菊花的組織培養(yǎng)

培養(yǎng)15～20d后，將生長良好的愈傷組織轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生芽的培養(yǎng)基上。長出芽后，再將其轉(zhuǎn)接到誘導(dǎo)生根的培養(yǎng)基上，進一步誘導(dǎo)形成試管苗。

（再分化）⑤誘導(dǎo)生芽生根注意：每日需要給予適當(dāng)時間和強度的光照。（光照培養(yǎng)，促進葉綠素合成）探究·實踐--菊花的組織培養(yǎng)

移栽前先打開封口膜或瓶蓋，讓試管苗在培養(yǎng)箱內(nèi)生長幾日。用流水清洗掉根部的培養(yǎng)基后，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境中，待其長壯后再移栽入土。每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花。⑥移栽探究·實踐--菊花的組織培養(yǎng)根、芽植物體再分化培養(yǎng)條件：①無菌②營養(yǎng)物質(zhì)③適宜條件（溫度、PH、光等）④植物激素：遮光光照芽發(fā)育成葉，葉肉細胞中葉綠素的合成需要光照脫分化愈傷組織離體的植物器官、組織或細胞（外植體）愈傷組織重新分化為芽、根等器官失去特有結(jié)構(gòu)和功能轉(zhuǎn)變成未分化的細胞生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵。生長素和細胞分裂素的比例和濃度會影響植物細胞的發(fā)育方向。如：胡蘿卜的形成層、菊花幼莖段、月季的花藥…排列不規(guī)則，高度液泡化，呈不定型狀態(tài)的薄壁細胞植物體細胞雜交技術(shù)欲培育地上長番茄和地下結(jié)馬鈴薯的“超級作物”。你有什么好妙招？利用傳統(tǒng)有性雜交方法能實現(xiàn)嗎？為什么？不能。因為不同種生物之間存在著生殖隔離植物體細胞雜交技術(shù)酶解法原理：植物細胞的細胞壁主要由纖維素和果膠構(gòu)成；酶具有專一性（1）去除細胞壁去壁原因：細胞壁阻礙著細胞間的雜交（阻礙了原生質(zhì)體間的融合）方法：酶解法原生質(zhì)體植物體細胞雜交技術(shù)②方法：物理法：電融合法、離心法等化學(xué)法：聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法等①原理：細胞膜具有一定的的流動性

（2）原生質(zhì)體間的融合注意：去除細胞壁和誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合時，不能在低滲溶液中進行。將細胞放在等滲或略大于的溶液中，防止原生質(zhì)體吸水而漲破，保持原生質(zhì)體正常。植物體細胞雜交技術(shù)A細胞B細胞去壁B原生質(zhì)體A原生質(zhì)體正在融合的原生質(zhì)體原生質(zhì)體融合脫分化雜種細胞AB愈傷組織再生壁再分化再生出小植株雜種植株AB植物細胞融合技術(shù)植物組織培養(yǎng)技術(shù)去壁體現(xiàn)了細胞膜的流動性體現(xiàn)了植物細胞的全能性融合完成的標(biāo)志植物體細胞雜交技術(shù)在此基礎(chǔ)上，科學(xué)家們利用植物體細胞雜交技術(shù)，又相繼培育出了白菜—甘藍、普通小麥—長穗偃麥草等雜種。我國科學(xué)家還在木本植物的體細胞雜交方面培育出了多種柑橘屬不同種間的雜種植株。白菜甘藍白菜—甘藍植物組織培養(yǎng)和植物體細胞雜交的異同點植物組織培養(yǎng)植物體細胞雜交技術(shù)生殖方式原理步驟意義聯(lián)系植物體細胞雜交技術(shù)包括

和

兩個過程，植物組織培養(yǎng)是植物體細胞雜交的一個環(huán)節(jié)，融合的體細胞只有通過植物組織培養(yǎng)才能發(fā)育成完整的個體。無性繁殖細胞全能性①脫分化②再分化保持優(yōu)良性狀，繁殖速度快打破生殖隔離，實現(xiàn)遠緣雜交育種①去除細胞壁②融合形成雜種細胞③組織培養(yǎng)（脫分化、再分化）細胞膜具有一定的流動性、植物細胞的全能性無性繁殖植物細胞融合植物組織培養(yǎng)課堂小結(jié)脫分化再分化原理過程花藥離體培養(yǎng)細胞全能性操作步驟外植體根、芽、胚狀體愈傷組織外植體消毒接種切塊形成愈傷組織誘導(dǎo)生芽生根植物組織培養(yǎng)植物細胞工程植物體細胞雜交變異類型原理育種類型概念植物細胞融合原生質(zhì)體制備過程植物組織培養(yǎng)原生質(zhì)體融合優(yōu)缺點1.植物組織培養(yǎng)技術(shù)常用于商業(yè)化生產(chǎn)，其過程一般為：無菌培養(yǎng)物的建立→培養(yǎng)物增殖→生根培養(yǎng)→試管苗移栽及鑒定。下列相關(guān)敘述錯誤的是()A.為獲得無菌培養(yǎng)物，外植體要消毒處理后才可接種培養(yǎng)B.組織培養(yǎng)過程中也可無明顯愈傷組織形成，直接形成胚狀體等結(jié)構(gòu)C.提高培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素的比值，有利于誘導(dǎo)生根D.用同一植株體細胞離體培養(yǎng)獲得的再生苗不會出現(xiàn)變異隨堂檢測1.植物組織培養(yǎng)技術(shù)常用于商業(yè)化生產(chǎn)，其過程一般為：無菌培養(yǎng)物的建立→培養(yǎng)物增殖→生根培養(yǎng)→試管苗移栽及鑒定。下列相關(guān)敘述錯誤的是()A.為獲得無菌培養(yǎng)物，外植體要消毒處理后才可接種培養(yǎng)B.組織培養(yǎng)過程中也可無明顯愈傷組織形成，直接形成胚狀體等結(jié)構(gòu)C.提高培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素的比值，有利于誘導(dǎo)生根D.用同一植株體細胞離體培養(yǎng)獲得的再生苗不會出現(xiàn)變異答案：D解析：植物組織培養(yǎng)過程中應(yīng)注意無菌操作，為獲得無菌培養(yǎng)物，外植體要經(jīng)過表面消毒處理后，才能進行培養(yǎng)，所用的培養(yǎng)基必須徹底滅菌；組織培養(yǎng)過程中也可無明顯愈傷組織形成，直接形成胚狀體等結(jié)構(gòu)，胚狀體若包裹上人工種皮，可制作成人工種子；生長素和細胞分裂素的比值高時，有利于根的分化、抑制芽的形成，因此提高培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素的比值，有利于誘導(dǎo)生根；用同一植株體細胞離體培養(yǎng)獲得的再生苗會出現(xiàn)變異，如在愈傷組織的培養(yǎng)過程中可能發(fā)生基因突變等變異；故選D。1.植物組織培養(yǎng)技術(shù)常用于商業(yè)化生產(chǎn)，其過程一般為：無菌培養(yǎng)物的建立→培養(yǎng)物增殖→生根培養(yǎng)→試管苗移栽及鑒定。下列相關(guān)敘述錯誤的是()A.為獲得無菌培養(yǎng)物，外植體要消毒處理后才可接種培養(yǎng)B.組織培養(yǎng)過程中也可無明顯愈傷組織形成，直接形成胚狀體等結(jié)構(gòu)C.提高培養(yǎng)基中生長素和細胞分裂素的比值，有利于誘導(dǎo)生根D.用同一植株體細胞離體培養(yǎng)獲得的再生苗不會出現(xiàn)變異隨堂檢測2.植物細胞工程包括植物組織培養(yǎng)、植物體細胞雜交等技術(shù)，具有廣泛的應(yīng)用前景和實用價值。下列對這些操作或應(yīng)用描述錯誤的是()A.通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)實現(xiàn)種苗的大量繁殖,可保持優(yōu)良品種的遺傳特性B.以莖尖為材料利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，可獲得具有抗病毒特性的新品種C.利用植物體細胞雜交技術(shù)獲得白菜—甘藍雜種植株，打破了生殖隔離D.利用植物細胞培養(yǎng)技術(shù)可大量獲得紫草寧，且已投入規(guī)?；a(chǎn)答案：B解析：通過植物組織培養(yǎng)實現(xiàn)種苗的大量繁殖，利用的原理是植物細胞具有全能性，并沒有改變遺傳物質(zhì)，因而可以保持優(yōu)良品種的遺傳特性，A正確；以根尖或莖尖為材料，利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)可獲得脫毒植株，但不能獲得抗病毒的新品種，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可獲得抗病毒的新品種，B錯誤；白菜和甘藍屬于不同的物種，利用植物體細胞雜交技術(shù)獲得白菜—甘藍雜種植株，打破