摘要采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，研究茯苓、澤瀉治療糖尿病腎病的主要蛋白靶點及作用機(jī)制。使用中藥系統(tǒng)藥理分析平臺在線數(shù)據(jù)庫、DigSee、GeneCards、UniProt等對茯苓、澤瀉中糖尿病腎病相關(guān)的活性成分、蛋白靶點和基因進(jìn)行檢索篩選，使用Cytoscape3.8.2軟件和STRING在線網(wǎng)站分別構(gòu)建化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)圖和蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖，最后利用DAVID和KOBAS數(shù)據(jù)庫對核心靶點進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。從茯苓和澤瀉兩味藥材中共篩選得到與糖尿病腎病相關(guān)活性化合物25個，涉及26個靶點，核心化學(xué)成分為常春藤皂苷元和谷甾醇，關(guān)鍵作用靶點為NR3C1和NCOA2，主要參與的信號通路有花生四烯酸代謝和脂肪細(xì)胞脂解的調(diào)節(jié)。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，發(fā)現(xiàn)茯苓和澤瀉治療糖尿病腎病具有“多成分、多靶點、多途徑”的特點，兩味藥材聯(lián)用，使利水作用倍增，增強(qiáng)了對糖尿病腎病的治療效果。關(guān)鍵詞：網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；茯苓；澤瀉；糖尿病腎病目錄TOC\o"1-3"\h\u1引言 引言在我國，由于人們生活方式的改變，糖尿病患病率逐年上升，糖尿病患者腎臟并發(fā)癥的發(fā)生率也在增加。糖尿病腎病(DN)是糖尿病引起的腎臟疾病，是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，也是糖尿病患者終末期腎病的重要原因之一。其本質(zhì)是腎小球病變，糖尿病患者血糖高，體內(nèi)糖代謝紊亂，引起微血管損傷，血流動力學(xué)改變，最后發(fā)生腎小球硬化。本病臨床癥狀一般為尿白蛋白排泄增加、高血壓、腎小球濾過率下降和心血管病，無其他腎臟疾病。近年來，糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制研究十分廣泛，但其具體發(fā)病機(jī)制尚不清楚。目前認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制可能與糖脂代謝紊亂、炎癥因子和腎臟血液微循環(huán)障礙等有關(guān)。因此，西醫(yī)治療中控制病情發(fā)展的主要途徑是控制血壓、調(diào)節(jié)血糖，形成良好的生活方式。同時，糖尿病腎病患者缺乏臨床表現(xiàn)，無法根據(jù)臨床癥狀準(zhǔn)確診斷。因此，常以患者體內(nèi)炎癥指標(biāo)和腎功能指標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)來診斷有無糖尿病腎病。傳統(tǒng)中醫(yī)理論認(rèn)為，糖尿病腎病可歸入“腎勞”、“水腫”、“腎消”等范疇。為了長期解渴，腎氣損傷、水濕停滯、皮膚四肢溢液、氣陰兩虛、瘀血阻滯是解渴病的痼疾。近年來，中醫(yī)藥治療糖尿病腎病越來越受到重視。DN的病理機(jī)制與五臟相關(guān)，以腎臟為主。其基本病機(jī)為表虛。本虛是指氣陰陽兩虛，主要是腎虛。實證為內(nèi)熱、外邪、痰濕、血瘀、毒濁，但血瘀與痰濕最為重要。在病程的不同階段，有獨特的病機(jī)重點。中醫(yī)治療中，根據(jù)糖尿病腎病氣陰兩虛、腎虛血瘀的特點，多采用益氣養(yǎng)陰補腎方治療。本實驗通過總結(jié)分析已知的治療糖尿病腎病的中藥方劑和文章，發(fā)現(xiàn)茯苓和澤瀉是DN治療方劑中的高頻中藥材，張仲景《傷寒論》中記載的該藥主要作用是利尿、除濕、健脾，符合DN的基本病機(jī)特點。茯苓(Schw))狼為多孔菌科傘菌屬真菌茯苓的干燥菌核。性平、味甘、淡、入心、肺、脾、腎經(jīng)?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》記載：“主胸充盈、憂、驚、心悸、心口痛、寒熱滿、咳嗽、口舌干燥、小便不利。”主治：水腫、痰飲、心悸、失眠。其主要功效為利尿、除濕、健脾和中。澤瀉是澤瀉科植物澤瀉的干躁根莖。寒性、甘、淡、歸腎、膀胱經(jīng)?！端幮哉摗酚小爸颇I虧自釋，治五淋，益膀光熱、冷水道”。具體作用為利尿、退腫、清熱利濕、清熱解毒。與茯苓對比，澤瀉利尿能力很強(qiáng)，也有潤肺滋陰的功效。張仲景《金匱要略》一書中記述澤瀉可以治療“解渴”。澤瀉可雙向調(diào)節(jié)，利尿清熱利濕生津解渴。茯苓和澤瀉是古醫(yī)籍記載利尿、潤肺藥對。茯苓性溫、味辛、滋潤健壯、全透明，能增強(qiáng)體質(zhì)、避邪。拉肚子性嚴(yán)寒，可以使水變濕，驅(qū)逐發(fā)熱量。善于熄脾經(jīng)火，有利于膀胱濕熱。兩藥共用，茯苓利尿去濕實際效果翻倍，澤瀉利尿還可以將脾下身從膀光裝運。茯苓與澤瀉搭配具備利水功效，對水液證功效翻倍，可治療水腫、排尿不暢、等不適反復(fù)性水液證。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是系統(tǒng)理論支撐的一門學(xué)科。建立和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)互聯(lián)網(wǎng)，挑選特殊節(jié)點設(shè)計多靶點藥品。根據(jù)搭建化學(xué)物質(zhì)與病癥靶點聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖，能夠預(yù)測分析藥品的合理有效成分及各靶點，科學(xué)研究藥品對病癥具體的作用機(jī)理。伴隨著網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的高速發(fā)展，中藥材繁雜制度的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)剖析慢慢造成大家的高度關(guān)注。中醫(yī)藥學(xué)是一個多組分、多靶點、多途徑相互影響的復(fù)雜系統(tǒng)。辯證和整體觀念這倆特性根植于中藥治療的全流程。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和傳統(tǒng)實驗方法的區(qū)別就是，以系統(tǒng)學(xué)和藥學(xué)基礎(chǔ)知識為載體，應(yīng)用計算機(jī)技術(shù)等學(xué)科，融合現(xiàn)代科學(xué)科研成果，擺脫“一靶、一藥”傳統(tǒng)的見解，搭建多靶點多組分互聯(lián)網(wǎng)，從宏觀視角其研究思路的一致性和系統(tǒng)化與中醫(yī)基礎(chǔ)理論相關(guān)。因為茯苓和澤瀉成份繁雜，醫(yī)治糖尿病腎病涉及到身體內(nèi)多種多樣流程和轉(zhuǎn)錄因子。傳統(tǒng)雙組分相匹配單靶點的研究思路不太適合論述茯苓和澤瀉醫(yī)治糖尿病腎病的作用機(jī)理。本試驗融合茯苓、澤瀉的重要相關(guān)成分和中藥材“藥對”的“多成分、多靶點、多途徑”功能特性，用以藥品靶點疾病治療，對藥品靶點病癥糖尿病腎病的數(shù)據(jù)可視化網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖和潛在性蛋白質(zhì)靶點進(jìn)行全面的、全方位的解讀，表明其作用機(jī)理為科學(xué)評價茯苓和澤瀉醫(yī)治糖尿病腎病的臨床療效給予一定的理論來源，并進(jìn)一步科學(xué)研究澤瀉和茯苓醫(yī)治糖尿病腎病的功效。方法茯苓、澤瀉化學(xué)成分收集以“茯苓”“澤瀉”為關(guān)鍵詞利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺，檢索茯苓、澤瀉兩味藥材中所含有的全部化學(xué)成分，建立茯苓-澤瀉化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫?；钚曰瘜W(xué)成分及靶標(biāo)蛋白的篩選在化學(xué)成分?jǐn)?shù)據(jù)庫的成功建立中，以口服生物利用度和藥物相似度指數(shù)兩個指標(biāo)作為篩選藥物活性成分的條件，設(shè)定口服生物利用度（OB）≥30%，藥物相似度指數(shù)（DL)≥0.18以維持藥物的有效成分?？诜锢枚缺硎究诜幬镏械幕钚曰鶊F(tuán)或活性成分到達(dá)全身循環(huán)并被吸收的程度和速率，OB值通常與藥物的生物活性分子的藥物相似指數(shù)成正比。隨后利用TCMSP網(wǎng)站的化合物靶標(biāo)識別功能，選擇“RelatedTargets”按鍵，通過查找功能對篩選得到的茯苓和澤瀉中的有效活性成分所對應(yīng)的蛋白靶點進(jìn)行逐一檢索，最終整理得到藥材有效活性成分及靶標(biāo)蛋白。疾病靶點的篩選利用OMIM、DigSee、GeneCards等數(shù)據(jù)庫，將關(guān)鍵詞設(shè)為“DiabeticNephropathy”進(jìn)行檢索，將從各數(shù)據(jù)庫中收集得到的疾病靶點進(jìn)行合并和去除重復(fù)項處理，經(jīng)過整理后得到與糖尿病腎病相關(guān)的基因。靶標(biāo)蛋白基因名的確定為了更有利于后期數(shù)據(jù)的處理和分析，實驗借助UniProt、HGNC、PubMed等數(shù)據(jù)庫查詢中得到的蛋白靶點，且限定物種為“homosapiens”，讓全部蛋白靶點轉(zhuǎn)化為較為規(guī)范的簡單的symbol,去除部分在數(shù)據(jù)庫中找不到對應(yīng)名稱的靶標(biāo)蛋白后，最終得到藥物的有效靶點。韋恩圖的構(gòu)建為了明晰藥物作用靶點和糖尿病腎病表達(dá)靶點之間的關(guān)系，本實驗利用Venny2.1.0網(wǎng)站將得到的茯苓和澤瀉中活性將成分對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白與疾病靶點的關(guān)系映射在一起，最終得到在線韋恩圖。通過分析圖的交叉部分，得到藥物和疾病的相同靶點。也就是澤瀉治療糖尿病腎病的潛在靶點。（1）藥物活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建為了明確茯苓和澤瀉中各活性成分、靶點與疾病之間的關(guān)系，將篩選出的茯苓和澤瀉中的活性化合物與1.5中得到的茯苓和澤瀉治療DN的靶點進(jìn)行匹配，將得到的對應(yīng)關(guān)系輸入表格，再將表格導(dǎo)入到Cytoscape3.8.2軟件中構(gòu)建藥物活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)，分析各化合物和靶點節(jié)點的度（degree）值，預(yù)測茯苓和澤瀉中治療糖尿病腎病的重要化合物成分和關(guān)鍵作用靶點。（2）蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)（PPICN）圖的構(gòu)建為了從蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步了解藥物靶點和DN靶點之間的關(guān)系，本實驗將1.5中得到的11個茯苓和澤瀉治療DN的將靶點導(dǎo)入蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)站STRING10.5()，并將物種定義為“homosapiens”，創(chuàng)建蛋白質(zhì)相互作用核心網(wǎng)絡(luò)圖譜。然后將PPICN網(wǎng)絡(luò)圖數(shù)據(jù)保存為“TSV”文件格式，然后將文件導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件進(jìn)行可視化分析。核心靶點的基因本體功能富集分析和KEGG通路分析為了闡明茯苓和澤瀉中治療糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點的生物學(xué)功能以及其與體內(nèi)各信號通路之間的關(guān)系，在DAVID在線數(shù)據(jù)庫（/）中輸入1.5中得到的11個茯苓和澤瀉治療DN的作用靶點，輸入目標(biāo)基因的名稱列表并限定物種為“homosapiens”，在上述數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索等一系列操作，得到GO富集數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)出，選取具代表性的條目進(jìn)行GO（geneontology）生物學(xué)過程富集分析，得到茯苓和澤瀉潛在靶點參與的生物學(xué)反應(yīng)過程，所具有的分子功能以及所在的細(xì)胞部位，另外利用在線繪圖網(wǎng)站-微生信網(wǎng)站（/）繪制出GO功能富集分析氣泡圖。同時我們利用DAVID網(wǎng)站對基因名先進(jìn)行轉(zhuǎn)換得到GeneID，然后將轉(zhuǎn)換后得到的GeneID輸入到網(wǎng)站KOBAS3.0(/anno_iden.php)，選擇研究種類為“EntrezGeneID”，限定物種為“homosapiens”，便可得到KEGG（KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes）信號通路富集結(jié)果，之后將結(jié)果導(dǎo)出并設(shè)定閾值p<0.05,選取排名靠前的KEGG通路進(jìn)行作圖詳細(xì)分析，探究茯苓-澤瀉治療糖尿病腎病的潛在靶點參與的生物學(xué)過程和涉及到的體內(nèi)信號通路。結(jié)果茯苓-澤瀉活性化合物和靶標(biāo)蛋白的篩選通過TCMSP網(wǎng)站檢索到澤瀉和茯苓兩味藥材共有80個化合物，其中46個來自澤瀉，34個來自茯苓。然后以以口服生物利用度（OB）≥30%和藥物相似指數(shù)（DL）≥0.18為篩選條件，獲得藥物的有效成分。最終共獲得25種活性成分，其中10種來自澤瀉。15來自茯苓。25種篩選活性化合物的基本信息如表2-1所示。利用TCMSP網(wǎng)站的化合物靶標(biāo)識別功能，選擇“RelatedTargets”按鍵分別對25個有效活性成分所對應(yīng)的靶點蛋白名稱進(jìn)行逐一檢索，將得到的靶蛋白通過UniProt、HGNC、PubMed等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行規(guī)范化和簡化，限定物種為“homosapiens”，去除部分無法在數(shù)據(jù)庫中找到對應(yīng)名稱的靶標(biāo)蛋白后，經(jīng)整理最終一共得到了39個藥物有效靶點。表2-1藥物活性成分表藥材編號化學(xué)成分名稱OB(%)DL澤瀉MOL000359sitosterol36.910.75MOL000830AlisolB34.470.82MOL000831AlisolBmonoacetate35.580.81MOL000832alisol,b,23-acetate32.520.82MOL00084916β-methoxyalisolBmonoacetate32.430.77MOL000853alisolB36.760.82MOL000854alisolC32.70.82MOL000856alisolCmonoacetate33.060.83MOL0024641-Monolinolein37.180.3MOL000862[(1S,3R)-1-[(2R)-3,3-dimethyloxiran-2-yl]-3-[(5R,8S,9S,10S,11S,14R)-11-hydroxy-4,4,8,10,14-pentamethyl-3-oxo-1,2,5,6,7,9,11,12,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]butyl]acetate35.580.81茯苓M(jìn)OL000273(2R)-2-[(3S,5R,10S,13R,14R,16R,17R)-3,16-dihydroxy-4,4,10,13,14-pentamethyl-MOL0002732,3,5,6,12,15,16,17-octahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-6-methylhept-5-enoicacid30.930.81MOL000275trametenolicacid38.710.8MOL0002767,9(11)-dehydropachymicacid35.110.81MOL000279Cerevisterol37.960.77MOL000280(2R)-2-[(3S,5R,10S,13R,14R,16R,17R)-3,16-dihydroxy-4,4,10,13,14-pentamethyl-2,3,5,6,12,15,16,17-octahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-5-isopropyl-hex-5-enoicacid31.070.82MOL000282ergosta-7,22E-dien-3beta-ol43.510.72MOL000283Ergosterolperoxide40.360.81MOL000285(2R)-2-[(5R,10S,13R,14R,16R,17R)-16-hydroxy-3-keto-4,4,10,13,14-pentamethyl-1,2,5,6,12,15,16,17-octahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl]-5-isopropyl-hex-5-enoicacid38.260.82MOL0002873beta-Hydroxy-24-methylene-8-lanostene-21-oicacid38.70.81MOL000289pachymicacid33.630.81MOL000290PoricoicacidA30.610.76MOL000291PoricoicacidB30.520.75MOL000292poricoicacidC38.150.75MOL000296hederagenin36.910.75MOL000300dehydroeburicoicacid44.170.83糖尿病腎病相關(guān)靶點的篩選和在線韋恩圖的構(gòu)建從OMIM、DigSee、GeneCards等數(shù)據(jù)庫中，以“DiabeticNephropathy”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將各數(shù)據(jù)庫中檢索得到的基因經(jīng)過合并和去除重復(fù)項后，一共得到了3312個與糖尿病腎病相關(guān)的靶點。同時將2-1中得到的茯苓和澤瀉有效活性成分所對應(yīng)的靶點經(jīng)過去除重復(fù)項處理后，最終獲得26個藥物潛在作用靶點。將這3312個疾病靶點與26個藥物潛在作用靶點共同輸入到Venny2.1.0網(wǎng)站中得到在線韋恩圖（如圖2-1），通過在線韋恩圖可知，中藥澤瀉中的藥物靶點為NR3C2、NCOA2、PGR、NR3C1、PTGS1。同時，這些靶點全包含在茯苓的藥物靶點中，也都是糖尿病腎病的靶點，這證明了澤瀉在治療糖尿病腎病中起著重要作用。此外，在藥材茯苓中除去這5個靶點，還含有6個治療糖尿病腎病的靶點，分別是CHRM2、ADH1B、LYZ、PTGS2、RXRA、SLC6A2。這11個茯苓-澤瀉治療糖尿病腎病的靶點信息見表2-2。圖2-1茯苓-澤瀉作用靶點與DN相關(guān)靶點的交集基因韋恩圖表2-2化合物與疾病交集靶點名稱靶點名稱NR3C2Mineralocorticoidreceptor(鹽皮質(zhì)激素受體)NCOA2Nuclearreceptorcoactivator2(細(xì)胞核受體共激活因子2)PGRprogesteronereceptor(孕激素受體)NR3C1Glucocorticoidreceptor(糖皮質(zhì)激素受體)PTGS1Prostaglandin-endoperoxidesynthase1(前列腺素內(nèi)過氧化物合酶1)CHRM2MuscarinicacetylcholinereceptorM2(毒蕈堿乙酰膽堿受體M2）ADH1BAll-trans-retinoldehydrogenase[NAD(+)](全反式視黃醇脫氫酶[NAD(+)])LYZLysozymeC(溶菌酶C)PTGS2Prostaglandin-endoperoxidesynthase2(前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2)RXRARetinoicacidreceptorRXR-alpha(視黃酸受體RXR-alpha)SoluteCarrierFamily6(NeurotransmitterTransporter),Member2[溶質(zhì)載體家族6(神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運SLC6A2藥物活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)分析將藥品相關(guān)成分和中藥材與病癥共同的靶標(biāo)線上Wayne圖譜引進(jìn)Cytoscape3.8.2手機(jī)中，打造了包含13個活性化合物節(jié)點和11個交叉式靶標(biāo)節(jié)點、24條邊的24個節(jié)點的相關(guān)成分-交叉式靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖在這里網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖中，左側(cè)紅色的節(jié)點表明伏苓和澤瀉里的活性化合物，左邊的淡黃色、綠色和藍(lán)色節(jié)點表明伏苓和澤瀉醫(yī)治高血壓腎病的潛在性靶標(biāo)。一個節(jié)點的相對密度值表明網(wǎng)絡(luò)里傳送到該節(jié)點的其他節(jié)點總數(shù)，2個節(jié)點間的相互作用用邊沿表明。在藥品活性成份交叉式靶標(biāo)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖中，節(jié)點尺寸隨度值轉(zhuǎn)變。多度值越多，節(jié)點也就越大。除此之外，右邊相交點對象色調(diào)隨度系數(shù)的增加而發(fā)暗。該圖還描寫了中藥材多組分與小分子抑制劑的相互作用體制。各化合物均值與0.8個靶相互作用，各靶均值與1.2個化合物相互作用。根據(jù)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖能夠得知，澤瀉伏苓存有一種化合物應(yīng)用于好幾個靶標(biāo)相互作用的情況以及不同化合物應(yīng)用于同一個靶標(biāo)的情況。挑選具備更皮內(nèi)瘤系數(shù)的節(jié)點展開分析。節(jié)點度值越大，代表著節(jié)點相連的化合物或靶標(biāo)越大，在網(wǎng)絡(luò)里起到重要作用，很有可能是不可或缺的化合物或靶標(biāo)。在成份等級分類上，中藥茯苓中MOL000296-青藤堿的水平最大，與9個靶標(biāo)相互作用，其次澤瀉中MOL000359-谷甾醇與3個靶標(biāo)相互作用。其它11個交叉式靶標(biāo)按水平排列，比較大的為NR3C2、NR3C1和PGR，先后與5、4、4個化合物相互作用。圖2-2藥物活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖茯苓-澤瀉與糖尿病腎病蛋白質(zhì)相互作用的構(gòu)建與分析將2.3中得到的11個茯苓和澤瀉治療糖尿病腎病的作用靶點帶入蛋白交互作用網(wǎng)站STRING10.5繪制圖表以獲得PPICN（圖2-3）。該圖總共包含11個節(jié)點和12條邊。節(jié)點代表相關(guān)蛋白質(zhì)，每條邊代表蛋白質(zhì)之間的相互作用，線越多越粗，節(jié)點之間的關(guān)聯(lián)度越大，平均節(jié)點度值為2.18，局部聚類系數(shù)為0.652。同時保存PPICN網(wǎng)絡(luò)圖TSV格式文件，導(dǎo)入Cytoscape3.8.2軟件進(jìn)行可視化分析，分析結(jié)果顯示NR3C1、NCOA2、PGR這三個靶點度值排名靠前，則可能為茯苓-澤瀉治療糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點。圖2-3茯苓-澤瀉與糖尿病腎病蛋白質(zhì)相關(guān)作用核心網(wǎng)絡(luò)圖（PPICN）核心靶點的基因本體功能富集分析和KEGG通路分析糖尿病腎病治療藥材11個核心靶點進(jìn)入DAVID網(wǎng)站進(jìn)行GO功能富集分析和最終GO條目一共有28個，其中包含與生物過程（BiologicalProcess，BP）相關(guān)條目有13個，5個細(xì)胞組成（CellularComponent，CC）以及10個與功能分子（MolecularFunction，MF）相關(guān)條目。生物過程（BP）富集結(jié)果顯示，交集靶點主要涉及前列腺生物合成、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞脂質(zhì)代謝等生物過程。同時，根據(jù)細(xì)胞組成（CC）的富集結(jié)果可知，交集基因主要分布在于細(xì)胞核、細(xì)胞器膜、核原生質(zhì)等細(xì)胞部位。功能分子（MF）富集結(jié)果顯示，交集基因主要對類固醇激素受體、序列特異性DNA結(jié)合、過氧化物酶活性、血紅素結(jié)合等過程產(chǎn)生影響，從而發(fā)揮治療作用。利用在線繪圖網(wǎng)站-微生信網(wǎng)站（/）將這三種條目分開進(jìn)行作圖，得到圖2-4、圖2-5和圖2-6，其中縱坐標(biāo)為GO條目名稱,橫坐標(biāo)顯示富集結(jié)果，圖中的氣泡顏色代表的是富集結(jié)果pvalue值，而氣泡大小表示基因Count值，在氣泡圖中，氣泡越大，顏色越深也說明富集越明顯。圖24GO功能富集分析-BP分析氣泡圖圖2-5GO功能富集分析-CC分析氣泡圖圖2-6GO功能富集分析-MF分析氣泡圖同時先后分別利用DAVID網(wǎng)站和KOBAS網(wǎng)站共同進(jìn)行KEGG通路富集分析，總共得到了52條KEGG通路，以p<0.05為條件進(jìn)行篩選，最終得到了44條符合要求的信號通路，另選取p值較小且與糖尿病腎病相關(guān)的排名前十的信號通路進(jìn)行作圖，見圖2.7。KEGG富集結(jié)果顯示茯苓-澤瀉治療糖尿病腎病的11個潛在靶點主要富集在脂肪細(xì)胞脂分解的調(diào)節(jié)、花生四烯酸代謝、甲狀腺激素信號通路、化學(xué)致癌性等信號通路，這也說明茯苓-澤瀉可以通過多靶點多通路協(xié)同作用，從而發(fā)揮出治療糖尿病腎病的作用。圖2-7澤瀉-茯苓治療DN核心靶點KEGG富集分析的10條通路圖討論隨著中國經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展和人民生活質(zhì)量的提高，人們的生活方式已經(jīng)發(fā)生了很大的改變，熱量攝入的增多和體力活動的減少導(dǎo)致肥胖人數(shù)和“三高”人群不斷增加，與此同時，中國人口老齡化程度也不斷加深，糖尿病患病人數(shù)也在迅速上升，而糖尿病患者患病后最多見的一個并發(fā)癥是糖尿病腎?。―N），該并發(fā)癥的患病率也不斷上升。糖尿病腎病是由于高血糖導(dǎo)致腎臟血流動力學(xué)及體內(nèi)的葡萄糖代謝異常，進(jìn)而造成腎功能障礙，最終形成腎小球硬化。臨床主要表現(xiàn)為尿蛋白、水腫、高血壓和腎功能異常,因此目前臨床檢測最常用的生物標(biāo)志物是白蛋白尿和腎小球濾過率（GFR）。另外目前西醫(yī)治療中并沒有對本病的發(fā)病機(jī)制及病因有明確闡述，一般認(rèn)為是多因素作用的結(jié)果，主要與腎臟內(nèi)血流動力學(xué)異常和某些生長因子和細(xì)胞因子的作用有關(guān)。因此，在目前的西醫(yī)治療方案中并沒有特效措施。古代醫(yī)書中并未出現(xiàn)糖尿病腎病這一病名，但該病與《圣濟(jì)總錄》《證治要訣》等古籍中所記載的消渴癥長久不愈所致的水腫、腎消等癥狀高度相似。例如“消病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛衰，氣化失常，開闔不利，水液凝聚體內(nèi)而現(xiàn)浮腫”，出自于《圣濟(jì)總錄》。另外，《證治要訣》中也有這樣類似的記載：“三消久而小便不臭，反作甜氣，在溺中滾涌，有浮在溺面如豬脂，此精不禁”。上述醫(yī)書古籍都明確地指出，消渴癥如果長時間得不到治愈，會出現(xiàn)水腫、腎消等癥狀和體征，而這與糖尿病腎病的現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)識是一致的。通過總結(jié)各醫(yī)家對于DN病機(jī)的研究，現(xiàn)如今，針對糖尿病腎病主要發(fā)病機(jī)制普遍認(rèn)同的觀點是“本虛標(biāo)實”。本虛以氣陰兩虛、脾腎虧虛為主，標(biāo)實則以血瘀、濕濁、痰瘀為主，本虛與標(biāo)實相互夾雜，共同致病。茯苓主要產(chǎn)自于云南，湖北，安徽等地，主要功效為利水滲濕、健脾調(diào)中。茯苓屬于藥食兩用藥材，是臨床運用較多的傳統(tǒng)藥材之一，可用于治療高血壓性心臟病、慢性腎衰、腎病綜合征等疾病。澤瀉主要產(chǎn)自于福建、四川和江西等地，其主要功效為利水消腫、滲濕泄熱。查閱現(xiàn)代藥理學(xué)研究文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，茯苓中主要含有的化學(xué)成分為三萜類化合物、脂肪酸類化合物和多糖類化合物，研究表明中藥茯苓中因含有結(jié)構(gòu)類似于醛固酮拮抗劑的化成分學(xué)，能夠抑制機(jī)體內(nèi)的腎素-血管緊張素系統(tǒng)，抑制水和鈉通道，調(diào)節(jié)水平衡，促進(jìn)機(jī)體保鈉排鉀，從而發(fā)揮利尿的藥理作用，此外茯苓還具有抑制炎癥、增強(qiáng)免疫、抗腫瘤等其他藥理作用。中藥澤瀉中主要含有的化學(xué)成分是三萜及倍半萜類化合物、植物甾醇和揮發(fā)油等?，F(xiàn)代研究表明，澤瀉經(jīng)水提取后得到的物質(zhì)能夠促使胰島細(xì)胞分泌并釋放胰島素，分解血液中的葡萄糖，降低血糖含量，還能對胰島組織產(chǎn)生保護(hù)作用，使其免受傷害。此外，澤瀉還具有抗腎炎活性、抗腫瘤、保肝等其他藥理作用。從兩種藥材的現(xiàn)代藥理學(xué)研究中，我們能夠得知兩種藥材對糖尿病腎病都有一定的治療作用，如茯苓的利尿作用可調(diào)節(jié)機(jī)體水平衡，消除水腫；澤瀉的降糖作用能夠調(diào)節(jié)機(jī)體的糖代謝。而在中醫(yī)理論中，澤瀉有瀉無補，而茯苓則有瀉有補，兩藥并用，利水作用增強(qiáng)，水道暢通無阻，則腫消。本實驗按照網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究的實驗流程，在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺上對茯苓、澤瀉這兩味中藥進(jìn)行檢索，并篩選藥材中的有效活性化學(xué)成分，最終得到25個活性成分。然后基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺分別檢索茯苓和澤瀉中的有效活性成分所對應(yīng)的靶標(biāo)蛋白，同時利用在線數(shù)據(jù)庫，如UniProt、HGNC和PubMed等，將所得到的靶點蛋白進(jìn)行規(guī)范化處理和簡單化處理，得到茯苓化合物蛋白靶點30個，9個澤瀉化合物蛋白靶點，刪除部分重復(fù)項后，如cytochromep450-cam，最終得到26個靶點，體現(xiàn)出了茯苓-澤瀉配伍使用具有多靶點作用且共同作用于多個靶點的特點。此外，通過構(gòu)建茯苓-澤瀉配伍的化合物靶點和疾病靶點的在線韋恩圖（見圖2.1），發(fā)現(xiàn)化合物靶點和疾病靶點聚集在11個基因上（見表2-2）。然后用Cytoscape3.8.2軟件繪制藥物有效成分與交集基因的關(guān)系圖，制作藥物有效成分與交集靶點相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖（見圖2.2），通過對網(wǎng)絡(luò)圖導(dǎo)出的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知：NR3C2、NR3C1、PGR、NCOA2和PTGS1這五個靶點均為茯苓-澤瀉治療糖尿病腎病的重要靶點。其中NR3C2表示的是鹽皮質(zhì)激素受體，是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子。鹽皮質(zhì)激素是一種由腎上腺皮質(zhì)球狀帶分泌的類固醇激素，其主要的生理功能是保留機(jī)體腎小管中的水和促進(jìn)鈉的重吸收，通過與下丘腦分泌、垂體釋放的抗利尿激素協(xié)同作用，維持機(jī)體內(nèi)水平衡和電解質(zhì)平衡。NR3C2與鹽皮質(zhì)激素結(jié)合，主要是醛固酮，能夠調(diào)節(jié)離子和水運蛋白的表達(dá)，通過促進(jìn)水和鹽在腎臟內(nèi)的潴留進(jìn)而直接影響血壓。NCOA2代表細(xì)胞核受體共激活因子2，該因子以配體依賴的方式與核受體進(jìn)行結(jié)合，對核受體轉(zhuǎn)錄過程的活性進(jìn)行調(diào)控。過氧化物酶體增殖物激活受體γ是脂肪分化過程中的關(guān)鍵因子，該因子轉(zhuǎn)錄活性受到NCOA2的調(diào)控，因此NCOA2維持白色和棕色脂肪細(xì)胞之間的穩(wěn)態(tài)平衡，對脂肪沉積有著重要的調(diào)控作用。PTGS1是前列腺素合成的關(guān)鍵酶，主要表達(dá)于胃、腎和血小板，其主要的功能是通過合成前列腺素來調(diào)節(jié)細(xì)胞的正常生理活動，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，與機(jī)體發(fā)生的炎癥反應(yīng)過程息息相關(guān)。同時，在該網(wǎng)絡(luò)圖中度值最大的化合物為中藥茯苓中的MOL000296-常春藤皂苷元（hederagenin）成分。常春藤皂苷元是一種五環(huán)三萜類的化合物，各種藥用植物中均含有，因其具有水溶性較差和生物利用度較低的缺點，故在臨床上沒有被大范圍應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)常春藤皂苷元能夠通過促進(jìn)胰島素的分泌和釋放，降低機(jī)體血液中的糖含量和胰高血糖素水平，增強(qiáng)肝臟和肌肉中的糖原合成，從而發(fā)揮出抗糖尿病的作用，進(jìn)而抗糖尿病腎病。此外常春藤皂苷元還具有抗抑郁、抗腫瘤、抗炎、抑菌、保肝等一系列藥理作用。另外度值排名靠前的化合物還包括中藥澤瀉中的MOL000359-谷甾醇（sitosterol）成分，谷甾醇是一種具有天然活性的植物甾醇，具有抗炎、抗癌、抗氧化等藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)該化合物與膽固醇都屬于甾體化合物，兩者分子結(jié)構(gòu)相似，因此該化合物可與膽固醇競爭體內(nèi)結(jié)合位點，抑制膽固醇吸收，從而達(dá)到降脂作用。同時現(xiàn)代研究證明，澤瀉的水提物和醇提物能夠降低膽固醇含量，具有降血脂的作用。而糖尿病腎病患者體內(nèi)的脂質(zhì)代謝紊亂通常是其發(fā)病機(jī)制之一，且隨著病情的發(fā)展，代謝會更加紊亂，腎臟中會出現(xiàn)脂質(zhì)異常沉積現(xiàn)象。因此，我們有理由推斷，常春藤皂苷元和谷甾醇這兩個化學(xué)成分可能是茯苓和澤瀉治療糖尿病腎病的關(guān)鍵核心化合物。同時本實驗利用蛋白交互作用網(wǎng)站STRING10.5構(gòu)建得到PPICN網(wǎng)絡(luò)圖，在Cytoscape3.8.2軟件中輸入PPICN網(wǎng)絡(luò)圖數(shù)據(jù)，對該網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行分析得到，度值排名前三的靶點依次為NR3C1，NCOA2和PGR，其中NR3C1是度值最大的靶點，為糖皮質(zhì)激素受體。糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid，GC）是腎上腺皮質(zhì)分泌得到的一類甾體激素，又稱腎上腺皮質(zhì)激素。糖皮質(zhì)激素對機(jī)體內(nèi)的大部分生理過程都有調(diào)節(jié)作用，如碳水化合物和脂肪的合成與代謝，同時它還具有抗炎和免疫抑制的藥理作用。糖皮質(zhì)激素受體是一種核受體，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過程中起調(diào)節(jié)作用。糖皮質(zhì)激素必須要與糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合，才能被激活發(fā)揮作用，而糖皮質(zhì)激素受體是從細(xì)胞內(nèi)的熱休克蛋白中分離出來的，同時兩者結(jié)合形成的復(fù)合物迅速進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合反應(yīng)原件，調(diào)節(jié)下游基因的表達(dá)，從而發(fā)揮其抗炎和免疫抑制的藥理作用。我們將PPICN網(wǎng)絡(luò)圖的分析結(jié)果與藥物活性成分-交集靶點網(wǎng)絡(luò)圖的分析結(jié)果進(jìn)行比對研究，從中可知，NR3C1和NCOA2這兩個靶點為茯苓和澤瀉治療糖尿病腎病的關(guān)鍵核心靶點。此外，GO功能富集結(jié)果顯示，茯苓-澤瀉聯(lián)用治療糖尿病腎病的潛在靶點可能與RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞氧化解毒、DNA模板轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞脂質(zhì)代謝、血壓的調(diào)節(jié)等生物過程有著密切的聯(lián)系，主要分布于細(xì)胞核、細(xì)胞器膜、核原生質(zhì)等細(xì)胞部位，同時潛在作用靶點在體內(nèi)發(fā)揮治療作用，可能是因為對類固醇激素受體、序列特異性DNA結(jié)合、過氧化物酶活性、血紅素結(jié)合等過程產(chǎn)生了影響。同時KEGG通路分析顯示，茯苓-澤瀉聯(lián)用治療DN主要涉及脂肪細(xì)胞脂分解的調(diào)節(jié)、花生四烯酸代謝、化學(xué)致癌性等信號通路的調(diào)節(jié)?；ㄉ南┧崾且环N人體必需的氨基酸。它是合成前列腺素的直接前體物質(zhì)，同時還是一種重要的結(jié)構(gòu)脂類物質(zhì)，該物質(zhì)具有降血脂、抗炎、抗脂質(zhì)氧化等一系列藥理作用?；ㄉ南┧嵩诃h(huán)氧合酶作用下可生成前列腺素F2α，最終轉(zhuǎn)化成丙二醛。而8-表氧-前列腺素F2α是在沒有環(huán)氧合酶作用下，脂質(zhì)經(jīng)過氧自由基的催化發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物，其前體物質(zhì)也是花生四烯酸。研究表明糖尿病患者體內(nèi)存在著脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，且病程越長，反應(yīng)越明顯，因此8-表氧-前列腺素F2α可作為反應(yīng)糖尿病腎病患者病情發(fā)展的重要指標(biāo)。脂肪細(xì)胞脂質(zhì)分解的過程與脂肪在人體內(nèi)的分布和機(jī)體脂質(zhì)代謝過程有著緊密的聯(lián)系，同時脂肪細(xì)胞發(fā)生脂肪分解能夠產(chǎn)生游離的脂肪酸。這些游離的脂肪酸可以作為燃料，為周圍組織提供能量，同時，也可以作為信號分子來調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)葡萄糖和胰島素的含量和活性。因此，脂肪細(xì)胞脂分解不僅調(diào)節(jié)了能量的平衡和脂肪的分布，而且對機(jī)體糖脂代謝的正常調(diào)節(jié)起著重要作用。綜上所述，糖尿病腎病