項目三人干擾素α2b的生產(chǎn)任務(wù)六人干擾素α2b的凝膠層析嚴(yán)格遵守GMP和執(zhí)行人干擾素α2b凝膠層析崗位SOP，取疏水層析后洗脫液，完成SephadexG-25凝膠層析操作，制得人干擾素α2b原液。任務(wù)描述人干擾素α2b的凝膠層析2任務(wù)支撐（一）凝膠層析操作的目的與作用

凝膠層析去除料液中仍殘留的少量分子量與人干擾素α2b有差異的雜質(zhì)和內(nèi)毒素等，并將人干擾素α2b所處溶液置換為pH4.5，80mmol/LHAc-NaAc，0.05mol/LNaCl溶液。人干擾素α2b的凝膠層析3（二）脫鹽與去除熱原的技術(shù)4

生產(chǎn)中，經(jīng)離子交換層析或鹽析等操作后的料液中具有較高離子強(qiáng)度，有時需進(jìn)行脫鹽操作，以降低離子濃度。

脫鹽利用鹽離子較小而生物大分子較大，兩者存在大小差異，予以分離。1.脫鹽的技術(shù)超濾脫鹽法透析脫鹽法鹽離子進(jìn)入孔徑較小的凝膠，遷移速率慢；生物大分子不能進(jìn)入，行進(jìn)路徑短、遷移快。以濃度差為推動力，鹽離子能通過透析袋，大分子被截留。壓力推動下，溶液中的鹽離子通過一定孔徑的超濾膜，截留住大分子。凝膠層析脫鹽法（二）脫鹽與去除熱原的技術(shù)5（1）藥物中熱原來源溶劑帶入（蒸餾操作不當(dāng)、注射用水儲存不當(dāng)或過久）原輔料帶入（包裝損壞、受潮、生物材料）容器或用具、管道、裝置等帶入制備過程帶入（空氣、環(huán)境、人員衛(wèi)生，操作時間過長，產(chǎn)品滅菌不及時等）儲存中帶入（密閉不合格）使用過程帶入（輸液器、注射針筒針頭、配藥器具，配藥環(huán)境、操作、用品、混入的其他藥品）2.去除熱原的技術(shù)（二）脫鹽與去除熱原的技術(shù)6（2）去除容器上熱原

①酸堿法強(qiáng)酸、強(qiáng)堿或強(qiáng)氧化劑等能破壞熱原，所以可使用重鉻酸鉀硫酸清潔液浸泡玻璃容器、用具及輸液瓶等破壞熱原。②高溫法注射用針頭、針筒及玻璃器皿等，先洗滌潔凈烘干后，再在180℃加熱2h或250℃加熱30min以上處理破壞熱原。2.去除熱原的技術(shù)（二）脫鹽與去除熱原的技術(shù)7（3）去除料液中熱原①離子交換法。熱原在適當(dāng)pH的水溶液中帶負(fù)電，可被陰離子交換樹脂所交換，被去除。②活性炭吸附法。配液時加入0.1%～0.5%（溶液體積）的針用一級活性炭，煮沸并攪拌15min，能除去大部分熱原，并且活性炭還有脫色、助濾、除臭作用。但活性炭也會吸附部分藥液，故使用時應(yīng)過量投料，但小劑量藥物不宜使用。③凝膠過濾法。利用熱原與藥物分子量的差異分離。但當(dāng)兩者分子量相差不大時，不適用。④超濾法。3.0～15nm孔徑的超濾膜可有效去除藥液中的細(xì)菌與熱原。2.去除熱原的技術(shù)（二）脫鹽與去除熱原的技術(shù)8（4）去除溶劑中熱原①蒸餾法。利用熱原的不揮發(fā)性來制備注射用水，但熱原又具有水溶性，所以蒸餾器要有隔沫裝置，擋住霧滴的通過，避免熱原進(jìn)入蒸餾水中。②反滲透法。用醋酸纖維素膜和聚酰胺膜制備注射用水可除去熱原，與蒸餾法相比，具有節(jié)約熱能和冷卻水的優(yōu)點。去除料液中熱原的方法有時也適用于去除溶劑中熱原。2.去除熱原的技術(shù)（三）多模式層析技術(shù)9多模式層析是一種通過集合多種類型的相互作用（如空間排阻、電荷性、疏水性、氫鍵、嗜硫親和等作用）于一種介質(zhì)而具備高選擇性、高分辨率的層析技術(shù)，又稱為復(fù)合模式層析。它在凝膠層析的基礎(chǔ)上，連接有吸附功能基團(tuán)。多模式層析=凝膠層析+離子交換層析+疏水層析+……（三）多模式層析技術(shù)101.多模式層析介質(zhì)（1）Captoadhere層析介質(zhì)性質(zhì)上與陰離子交換層析類似，帶有正電荷。另外，還有氫鍵和疏水作用，是集合疏水等作用的多模式陰離子交換介質(zhì)。它用于抗體純化工藝中的精純步驟，可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)層析填料的一步或兩步層析，可同時去除掉聚集體、DNA、病毒、脫落的ProteinA配基、內(nèi)毒素和宿主蛋白。（三）多模式層析技術(shù)111.多模式層析介質(zhì)（2）CaptoMMC層析介質(zhì)類似于陽離子交換填料，帶有負(fù)電荷。另外還有氫鍵，嗜硫作用和疏水作用。其特性是耐高鹽和更好的選擇性，不需要對含鹽樣品進(jìn)行稀釋或脫鹽就可以直接上樣。在高鹽濃度的情況下，其仍能與陽離子結(jié)合。（三）多模式層析技術(shù)121.多模式層析介質(zhì)

具有凝膠過濾和疏水，離子交換等作用。外層精確控制孔徑，分子量大于700KD的生物大分子均不能進(jìn)入填料顆粒內(nèi)部，直接穿透。內(nèi)層是多模式配基辛氨基，對進(jìn)入到填料顆粒內(nèi)部的蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)生物分子有強(qiáng)烈的吸附作用。特別適用于病毒顆粒以及分子量大于700KD的蛋白和疫苗的分離純化，在去除內(nèi)毒素、核酸、宿主蛋白等方面也有非常好的效果。（3）CaptoCore700層析介質(zhì)（三）多模式層析技術(shù)132.多模式層析的特點及應(yīng)用

（1）多模式層析的特點

親水性好，對蛋白質(zhì)的非特異性吸附極低；高流速，高載量，高傳質(zhì)速率，耐受苛刻的化學(xué)清洗；能在高回收率條件下有效分離；有完整的法規(guī)支持文件等優(yōu)點。利用基架相連的配基上的多種作用，多模式層析介質(zhì)可提供與傳統(tǒng)填料不一樣的選擇性，可同時有效去除多聚體、宿主蛋白、病毒、電荷異構(gòu)體等多種雜質(zhì)。（2）多模式層析的應(yīng)用①適用于傳統(tǒng)層析方法難以達(dá)到效果的層析需求。②適用于難以同時去除多種痕量雜質(zhì)的層析需求。③CaptoAdhere有效用于兩步法抗體純化的精純步驟。④CaptoMMC有效用于發(fā)酵液直接高鹽上樣，有效簡化處理步驟及降低成本。任務(wù)實施人干擾素α2b的凝膠層析12345生產(chǎn)前準(zhǔn)備裝柱67平衡上樣洗脫再生清場141.確認(rèn)與填寫檢查記錄確認(rèn)是否有前批清場合格證副本，確認(rèn)生產(chǎn)環(huán)境、衛(wèi)生和設(shè)備器具是否符合要求。填寫發(fā)酵液中菌體的處理產(chǎn)前檢查記錄。2.領(lǐng)料與溶液配制領(lǐng)取生產(chǎn)用試劑耗材物料并配液：（1）平衡/上樣液：pH4.5，80mmol/LHAc-NaAc，0.05mol/LNaCl溶液。（2）清潔液：0.5mol/LNaOH溶液。（一）生產(chǎn)前準(zhǔn)備15（二）裝柱1柱床體積（CV）徑高比純化蛋白質(zhì)25～100倍1︰20～1︰100脫鹽4～10倍1︰5～1︰25連接底端部件、頂部適配器的管線。用20%乙醇潤洗篩網(wǎng)和濾膜（孔徑與凝膠的粒徑要匹配）。用注射器連接底端部件，推入20%乙醇，排除底端柱頭中的空氣。將底端部件與空柱連接，柱子垂直固定，加入20%乙醇或蒸餾水至2cm的高度。將裝柱器連接在空柱上，要確保柱管沒有傾斜。借助玻璃棒將凝膠懸液倒入柱管中，用裝柱緩沖液補(bǔ)足裝柱器，上端空余體積蓋上裝柱器頂蓋。以緩沖液沖洗凝膠，至柱床體積恒定后，拆除裝柱器。調(diào)節(jié)頂部適配器至凝膠床上表面。16（1）收集OD280＞0.1洗脫峰。（2）收集結(jié)束后，如樣品量大，平衡1倍柱床體積后繼續(xù)上樣。可重復(fù)上樣及洗脫。（3）OD280/OD260比值，值應(yīng)大于1.8?？刂芆D280在0.5～1.0。（4）用微孔濾膜除菌后取樣，樣品入庫。（5）計算收率。（五）洗脫（1）預(yù)熱紫外檢測儀及記錄儀，30min。（2）以平衡液30.0mL/min，平衡5倍柱床體積，至流出液pH為4.5為止。（三）平衡（1）將進(jìn)液管換至上樣液（疏水洗脫液）中，流速為30.0mL/min，開始上樣。（2）上樣量不超過柱床體積的20%。（3）上樣后，以洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫時泵流速為30.0mL/min。（四）上樣17（六）清場

檢查、整理各項記錄。規(guī)范地存放生產(chǎn)用試劑，清洗器具，維護(hù)設(shè)備，處置廢物和廢液，清潔、消毒工作臺和潔凈室。最后，填寫清場合格證。注意：請在任務(wù)實施過程中規(guī)范填寫《人干擾素α2b的凝膠層析操作記錄》，不可補(bǔ)填和篡改！18知識學(xué)習(xí)反思與反饋學(xué)習(xí)成果實踐操作考核與評價19拓展任務(wù)凝膠層析法脫鹽20查閱資料，深入了解雞蛋清組成及性質(zhì)查閱設(shè)計《凝膠層析法脫鹽操作記錄》，在任務(wù)實施過程中同步填寫。以雞蛋蛋清為原材料，硫酸銨鹽析法分級沉淀蛋白質(zhì)，再用凝膠層析法去除制得蛋白質(zhì)溶液中的鹽，并檢測凝膠層析脫鹽的效果。設(shè)計實操設(shè)計（一）任務(wù)描述21（二）實訓(xùn)材料1.材料、試劑新鮮雞蛋、葡聚糖凝膠G-25（SephadexG-25）、硫酸銨、氯化鋇。2.儀器設(shè)備玻璃層析柱（上端為帶有濾網(wǎng)和密封圈等的適配器，下端為帶有濾網(wǎng)和密封圈等的柱頭）、恒流泵、高速冷凍離心機(jī)、0.22μm濾膜與濾器、微量移液器（200～1000μL）、膠頭滴管、具塞刻度試管、秒表、紫外分光光度計、電導(dǎo)率儀。22（三）實訓(xùn)操作0504030201試液配制樣品的制備凝膠預(yù)處理層析柱的準(zhǔn)備裝柱配制1%氯化鋇溶液等。新鮮蛋清2mL+2mL水。加硫酸銨至飽和度50%，離心，取上清。再補(bǔ)加至100%飽和度，離心，收集沉淀。溶解后以0.22μm濾膜除菌。傾去浸泡SephadexG-25的20%乙醇，加入去離子水洗滌，攪拌10min后傾去，反復(fù)5次檢查、洗凈層析柱，垂直固定，安裝下端柱頭。向柱子中加水，排盡底端氣泡后維持一定高度。凝膠輕輕攪動成懸浮液，一次性不斷向柱內(nèi)注入凝膠23（三）實訓(xùn)操作1009080706平衡上樣洗脫和收集凝膠再生檢測和分析用約3倍床體積洗脫劑沖洗平衡柱床。將入口連接于樣品溶液，泵入0.5mL蛋白樣品。層析柱底端開始用具塞刻度試管收集流出液。以1mL/min，用2倍床體積洗脫液洗脫。底端用具塞刻度試管收集洗脫液，每管2mL，順序編號。用2～3倍床體積