學(xué)習(xí)使用鏡臺(tái)測(cè)微尺和目鏡測(cè)微尺；在顯微鏡下測(cè)定微生物大小。試驗(yàn)(一)微生物大小測(cè)定一、目標(biāo)要求微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第1頁二、試驗(yàn)原理鏡臺(tái)測(cè)微尺是中央部分刻有準(zhǔn)確等分線載玻片，普通是lmm等分為100格，每格長0.01mm(即10um)，用于校正目鏡測(cè)微尺每格相對(duì)長度。目鏡測(cè)微尺是一塊可放入接目鏡內(nèi)圓形小玻片，其中央有準(zhǔn)確等分刻度。目鏡測(cè)微尺每小格所代表實(shí)際長度不一樣，需將其放在接目鏡中隔板上，測(cè)量前，必須先用鏡臺(tái)測(cè)微尺進(jìn)行校正。微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第2頁目鏡測(cè)微尺鏡臺(tái)測(cè)微尺1.利用鏡臺(tái)測(cè)微尺測(cè)定目鏡測(cè)微尺每格絕對(duì)值2.目鏡測(cè)微尺每格長度（um）＝兩重合線間鏡臺(tái)測(cè)微尺格數(shù)×10/兩重合線間目鏡測(cè)微尺格數(shù)3.利用目鏡測(cè)微尺測(cè)定微生物大小微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第3頁三、試驗(yàn)器材

1、菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）2、器材：顯微鏡、鏡臺(tái)測(cè)微尺、目鏡測(cè)微尺微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第4頁三、試驗(yàn)步驟

1、目鏡測(cè)微尺校正鏡臺(tái)測(cè)微尺有刻度一面朝上，置顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡觀察，將鏡臺(tái)測(cè)微尺有刻度部分移至視野中央．轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡使目鏡測(cè)微尺刻度與鏡臺(tái)測(cè)微尺刻度平行。利用移動(dòng)器移動(dòng)鏡臺(tái)測(cè)微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺(tái)微尺和目鏡微尺所占格數(shù)。先10x，后40x，分別計(jì)算10x,40x下目鏡測(cè)微尺校正值。2、細(xì)胞大小測(cè)量酵母菌懸液滴在載玻片上，蓋上蓋玻片，置顯微鏡載物臺(tái)上。用目鏡測(cè)微尺測(cè)量細(xì)胞寬和長。微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第5頁三、試驗(yàn)結(jié)果1.計(jì)算出目鏡測(cè)微尺校正結(jié)果（物10×和40×）2.酵母菌大小測(cè)定酵母菌大小測(cè)定,選擇5-8個(gè)酵母菌，測(cè)定其40×大小范圍。四、思索題p512(2)微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第6頁1、明確血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)原理。2、掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)方法。

試驗(yàn)(二)微生物數(shù)量測(cè)定一、目標(biāo)要求微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第7頁顯微鏡直接計(jì)數(shù)法是將小量待測(cè)樣品懸浮液置于一個(gè)尤其含有確定面積和容積載玻片上(又稱計(jì)菌器)，于顯微鏡下直接計(jì)數(shù)一個(gè)方法。用于細(xì)胞總數(shù)測(cè)定顯微鏡直接計(jì)數(shù)法優(yōu)點(diǎn)是直觀、快速。缺點(diǎn)是所測(cè)得結(jié)果通常是死菌體和活菌體總和。當(dāng)前已經(jīng)有一些方法能夠克服這一缺點(diǎn)，如結(jié)合活菌染色，微室培養(yǎng)等方法來到達(dá)只計(jì)數(shù)活菌體目標(biāo)。

二、試驗(yàn)原理微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第8頁血細(xì)胞計(jì)數(shù)板由兩條槽組成三個(gè)平臺(tái)；中間較寬平臺(tái)又被一短橫槽隔成兩半，每一邊平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分為八個(gè)大方格，中間大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室是由一個(gè)大方格分成25個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成16個(gè)小方格；共計(jì)400個(gè)小方格。計(jì)數(shù)時(shí)，通常數(shù)五個(gè)中方格總菌數(shù)，然后求得每個(gè)中方格平均值，以及大方格中總菌數(shù)，再換算成1ml菌液中總菌數(shù)。微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第9頁１個(gè)計(jì)數(shù)室＝１×１mm包含５×５個(gè)中方格１個(gè)中方格＝４×４個(gè)小方格微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第10頁三、試驗(yàn)器材

1、菌種：釀酒酵母、大腸桿菌2、器材：顯微鏡、血球計(jì)數(shù)板微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第11頁三、試驗(yàn)步驟

1、在10×和40×下找到計(jì)數(shù)室。2、蓋上蓋玻片將搖勻釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室。3、靜置5min，先用低倍鏡將計(jì)數(shù)室移至視野中央。4、在高倍下(40X)計(jì)數(shù)：對(duì)兩個(gè)計(jì)數(shù)室記數(shù)，方法：每個(gè)計(jì)數(shù)室選5個(gè)中格(4個(gè)角和中央一個(gè)中格)中菌體進(jìn)行計(jì)數(shù)，求得每個(gè)中方格平均值，再乘上25即為大方格中總菌數(shù)，最終換算成1ml菌液中總菌數(shù)。對(duì)于分布在刻線上細(xì)胞，依照“數(shù)上不數(shù)下，數(shù)左不數(shù)右“標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。5、最終結(jié)果是兩個(gè)計(jì)數(shù)室所記菌數(shù)平均值微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第12頁三、試驗(yàn)結(jié)果

1、統(tǒng)計(jì)每個(gè)計(jì)數(shù)室（五個(gè)中格）細(xì)胞數(shù)量四、思索題p562(1)記數(shù)中格12345細(xì)胞記數(shù)2、計(jì)算每ml酵母菌懸液酵母菌數(shù)量。稀釋倍數(shù)為1記數(shù)中格12345細(xì)胞記數(shù)微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第13頁經(jīng)過細(xì)菌數(shù)量測(cè)量了解大腸桿菌生物特征和規(guī)律，繪制生長曲線。了解光電比濁計(jì)數(shù)法原理。學(xué)習(xí)、掌握光電比濁計(jì)數(shù)法操作方法。

試驗(yàn)(三)大腸桿菌生長曲線測(cè)定一、試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第14頁生長曲線

將少許純種單細(xì)胞微生物接種到定量液體培養(yǎng)基中，定時(shí)取樣測(cè)定細(xì)胞數(shù)量，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以菌數(shù)為縱坐標(biāo)作圖，得到一條反應(yīng)單細(xì)胞微生物在整個(gè)培養(yǎng)期間菌數(shù)改變規(guī)律曲線。二、試驗(yàn)原理一個(gè)經(jīng)典生長曲線分為延緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定時(shí)和衰亡期四個(gè)時(shí)期微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第15頁稀釋平板計(jì)數(shù)法對(duì)樣品稀釋培養(yǎng)，據(jù)形成菌落數(shù)計(jì)數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：活菌計(jì)數(shù)方法，對(duì)設(shè)備要求不高。缺點(diǎn)：操作復(fù)雜。顯微鏡直接計(jì)數(shù)法使用血球計(jì)數(shù)板在顯微鏡下直接計(jì)數(shù)。優(yōu)點(diǎn)：操作簡便，計(jì)數(shù)直觀。缺點(diǎn)：計(jì)數(shù)結(jié)果為活細(xì)菌和死菌體總和。測(cè)定細(xì)胞數(shù)量慣用方法微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第16頁光電比濁法光電比濁法是利用在一定范圍內(nèi)，微生物細(xì)胞濃度與透光度成反比原理。當(dāng)細(xì)菌細(xì)胞在溶液中數(shù)量越多，濁度越大，在光電比色計(jì)中測(cè)定時(shí)所吸收光線越多。優(yōu)點(diǎn)：簡便快速，適合于自動(dòng)控制。

缺點(diǎn)：測(cè)定結(jié)果受培養(yǎng)液成份影響；一些樣品樣品不適適用此法。

微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第17頁菌種培養(yǎng)不一樣時(shí)段大腸桿菌。儀器或其它用具分光光度計(jì)，比色皿等。三、試驗(yàn)器材微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第18頁開電源，儀器預(yù)熱20min，將波長調(diào)至600nm處。打開樣品室，將檔光體插入比色皿架，將其推或拉入光路。蓋好樣品室蓋，在TMODE下，按0%T鍵調(diào)零透射比。取出檔光體，按100%T/OA鍵調(diào)100%透射比。四、試驗(yàn)步驟1.樣品測(cè)試前調(diào)試微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第19頁2.樣品測(cè)定將參比溶液（未接種LB液體培養(yǎng)基）以及被測(cè)溶液倒入比色皿中。打開樣品室蓋，將參比溶液放在樣品架第一個(gè)槽位中，將被測(cè)溶液依次放入其它槽位。將參比溶液推入光路，按100%T/OA鍵調(diào)滿度。按MODE，將測(cè)試方式調(diào)至吸光度方式（A）。此時(shí),顯示器顯示“0.000”。將被測(cè)溶液推入光路，顯示器顯示為被測(cè)樣品吸光值。微生物實(shí)驗(yàn)微生物數(shù)量和大小測(cè)定第20頁

在600nm波長下，用未接種LB液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，分別對(duì)培養(yǎng)了0、4、8、12、16和20h大腸桿菌培養(yǎng)液，進(jìn)行光電比濁測(cè)定。對(duì)于高濃度大腸桿菌培養(yǎng)液,要用