第一節(jié)體液調節(jié)是通過化學信號實現(xiàn)的調節(jié)第一節(jié)體液調節(jié)是通過化學信號實現(xiàn)的調節(jié)第四章基因工程第二節(jié)神經系統(tǒng)通過下丘腦控制內分泌系統(tǒng)第二節(jié)神經系統(tǒng)通過下丘腦控制內分泌系統(tǒng)第一節(jié)基因工程賦予生物新的遺傳特性第2課時基因工程的基本操作程序1目

錄獲取目的基因的方法原核細胞基因與真核細胞基因的結構異同PCR技術和凝膠電泳技術基因工程的基本工具：限制性內切核酸酶、DNA連接酶、載體基因工程的實質就是利用工具對基因進行操作那基因的結構如何呢？原核基因和真核基因又有什么區(qū)別？1.啟動子：2.終止子：位于基因的“上游”，有RNA聚合酶結合的位點，控制轉錄的開始；位于基因末端，當RNA聚合酶到達時，釋放出RNA產物，轉錄結束。真核、原核基因的結構3.編碼序列

（1）原核基因中編碼蛋白質的序列是連續(xù)的

（2）真核基因中編碼蛋白質的序列是不連續(xù)的。編碼蛋白質的序列稱為外顯子，外顯子之間不能編碼蛋白質的序列稱為內含子。不同基因的外顯子和內含子的數(shù)目及長度是不同的。（3）真核基因和原核基因的表達1.真核基因的外顯子和內含子均會被轉錄2.真核細胞轉錄形成的RNA需要經過加工（切去內含子對應的部位），才可用于翻譯3.原核細胞轉錄形成的RNA，不需要加工，可直接用于翻譯基因結構原核生物基因真核生物基因非編碼區(qū)位置作用主要結構編碼區(qū)位于基因的兩端對基因的表達起調控作用啟動子終止子與RNA聚合酶結合，控制轉錄的開始當RNA聚合酶到達時，釋放出RNA產物，轉錄結束核苷酸序列是連續(xù)的，轉錄出的mRNA可直接作為翻譯的模板核苷酸序列是不連續(xù)的，分為外顯子和內含子，兩者均會被轉錄成mRNA前體，再在核內切去內含子對應部分，加工成為成熟的mRNA。啟動子和起始密碼子、終止子和終止密碼子的區(qū)別

啟動子終止子起始密碼子終止密碼子化學成分位置作用DNA片段mRNA上三個相鄰堿基DNA片段mRNA上三個相鄰堿基目的基因首端目的基因尾端mRNA首端mRNA尾端RNA聚合酶識別和結合的部分，驅動基因轉錄出mRNA決定轉錄的結束翻譯的起始信號決定翻譯過程的結束基因工程的基本操作程序獲取目的基因、構建重組DNA分子、將重組DNA分子導入受體細胞、檢測目的基因及其表達產物等。（一）獲取目的基因1、目的基因：人們所需要的基因。如：人的胰島素基因、植物的抗病基因等

根據(jù)不同的需要，目的基因不同，主要是指編碼蛋白質的基因。如：與生物抗逆性、優(yōu)良品質、生產藥物、毒物降解和工業(yè)用酶等相關的基因。目的基因“殺蟲基因”—Bt抗蟲蛋白基因（2）目的基因的序列已知：從基因文庫獲得（1）目的基因的序列未知：2、獲取方法：根據(jù)蛋白質中氨基酸序列根據(jù)mRNA中的堿基序列（逆轉錄法）化學方法合成

已經給了目的基因：聚合酶鏈式反應（PCR技術）擴增（受體菌群，每個受體菌含有一段不同的DNA片段）①基因組文庫：把某種生物的基因組DNA切成適當大小，分別與載體組合，導入微生物細胞，形成克隆。基因組中所有DNA序列克隆的總匯被稱為基因組文庫。（1）目的基因序列未知借助載體建立基因文庫（1）基因組文庫（2）cDNA文庫提取某種生物的全部DNA用適當?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉腄NA片段

將DNA片段與載體連接基因表達載體導入受體菌中儲存基因組文庫②構建cDNA文庫：從特定的組織或細胞中提取并純化全部mRNA，然后在逆轉錄酶等酶的催化下，以mRNA為模板合成互補的DNA，即cDNA

。最后，借助載體，利用與構建基因組文庫相同的方法構建cDNA文庫，只包含了一種生物的部分基因。由于基因的選擇性表達，不同組織細胞的cDNA文庫是不同的，同一組織細胞在不同的發(fā)育階段，cDNA文庫也會有差異。例如，胰島素基因的cDNA只能在由胰島β細胞建立的cDNA文庫中找到。提取某種生物的某器官或特定發(fā)育時期的mRNA反（逆）轉錄酶單鏈互補DNADNA聚合酶雙鏈DNA片段與載體連接基因表達載體導入受體菌中儲存cDNA文庫真核細胞的cDNA的獲取編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)DNA聚合酶剪接有關的酶RNA聚合酶mRNA前體mRNA單鏈DNAcDNA逆轉錄酶轉錄剪接逆轉錄復制啟動子終止子基因不含非編碼序列。即不含非編碼區(qū)和內含子基因組DNA文庫與cDNA文庫的比較文庫類型cDNA文庫

基因組文庫文庫大小基因中啟動子基因中內含子基因多少

物種間的基因交流小大無有無有某種生物的部分基因某種生物的全部基因可以部分基因可以

該法最大的缺點是帶有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能將真核生物的基因轉移到原核生物中去(含有不表達的內含子，這樣獲得的基因在原核生物體內不能表達)。所以此方法不適合獲得真核生物目的基因的編碼序列。

基因文庫的構建——直接分離法（或鳥槍法）DNA合成儀①前提：基因比較小、核苷酸序列已知（適于合成序列較短的基因）②方法：通過DNA合成儀用化學方法直接合成目的基因（2）目的基因序列已知1）化學合成法目的基因的mRNA逆轉錄單鏈DNA合成雙鏈DNA（目的基因）蛋白質氨基酸序列推測mRNA的核苷酸序列推測結構基因的核苷酸序列化學合成目的基因1）化學合成法途徑1：逆錄法途徑2：根據(jù)已知氨基酸序列直接合成DNA③過程PCR是一項根據(jù)DNA半保留復制的原理，在體外提供參與DNA復制的各種組分與反應條件，對目的基因的核苷酸序列進行大量復制的技術。優(yōu)點：簡單、快速、靈敏應用：醫(yī)學鑒定、法醫(yī)鑒定、古生物學研究2）利用PCR技術擴增目的基因前提:要有一段已知目的基因的脫氧核苷酸序列，以便合成引物。（1）原理：DNA半保留復制（2）條件：模板：原料：酶：引物：耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）四種脫氧核苷三磷酸（dNTP））DNA模板引物穩(wěn)定的緩沖溶液（一般添加Mg2+）DNA復制時，脫氧核苷酸鏈的延伸使用的原料只能是dNTP。DNA的合成需要能量，dNTP才能提供足夠的能量，過程：多次循環(huán)925575℃3`5`5`3`Taq聚合酶引物1引物2原料模板DNA目的基因PCR過程925575℃變性3`5`5`3`第一輪含有目的基因的雙鏈DNA片段氫鍵斷裂，DNA解聚為單鏈溫度上升到90℃以上變性925575℃退火Taq聚合酶引物1引物2原料第一輪兩條DNA單鏈引物和兩條單鏈DNA堿基互補配對溫度下降到50℃左右復性925575℃延伸Taq聚合酶引物1引物2原料第一輪引物和互補DNA結合脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，按堿基互補配對原則合成新的DNA鏈溫度上升到72℃左右延伸925575℃變性Taq聚合酶引物1引物2原料第二輪925575℃退火Taq聚合酶引物1引物2原料第二輪925575℃延伸Taq聚合酶引物1引物2原料第二輪925575℃變性第三輪925575℃退火第三輪925575℃延伸第三輪思考：繼續(xù)循環(huán)N次，會得到多少個DNA分子呢？DNA呈指數(shù)形式擴增。①變性②退火③延伸反應過程：模板DNA雙鏈在高溫下（90~95℃）氫鍵斷裂，解旋成2條DNA單鏈溫度降低（50~60℃）后，2個引物分別與各自互補的DNA單鏈結合分別以兩條DNA單鏈為模板，4種脫氧核苷三磷酸為原料，耐高溫的TaqDNA聚合酶在適宜的溫度（約72℃）下，以引物與模板形成的小段DNA雙鏈區(qū)為起點，催化合成一條新的DNA互補鏈。（3）過程：（包括多次循環(huán)）PCR的引物引物其實就是引子，是一小段單鏈DNA（體內DNA復制所用的引物是RNA），是作為DNA復制的起始點，決定PCR擴增產物的特異性和長度。1.概念2.引物的長度其長度常用的是15～30個脫氧核苷酸因為過短則特異性低。過長的引物會導致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進行反應。3.引物的種類PCR擴增時應有兩種引物，即分別能與兩條模板鏈配對的兩種單鏈DNA。4.結合位點由于DNA復制只能是5'→3'進行，而DNA的兩條單鏈又是反向平行的。5.設計引物的要求引物是復制時所要合成的新鏈中的一段，在整個PCR周期都一直存在（體內DNA復制因用的引物是RNA，最后是被DNA聚合酶I切除的）。要考慮長度、G/C堿基對的數(shù)目外，還要避免兩個引物（特別是3’端）間發(fā)生互補，避免引物內部出現(xiàn)二級結構等。6.引物數(shù)量要求模板鏈的3’端例題：1.設計引物是PCR技術關鍵步驟之一。某同學設計的兩組引物（只標注了部分堿基序列）都不合理（圖1），請分別說明理由。①第1組：

；②第2組：

。引物I和引物Ⅱ局部發(fā)生堿基互補配對而失效引物I’自身折疊后會出現(xiàn)局部堿基互補配對而失效2.采用PCR技術擴增HSA基因。圖3中箭頭表示一條引物結合模板的位置及擴增方向，請用箭頭在方框內標出另一條引物的位置及擴增方向。思考：（1）PCR技術中DNA雙鏈解旋的原理與體內DNA復制相同嗎？為什么？（2）PCR擴增的DNA片段大小由什么決定？擴增DNA片段的起點和終點由2個引物決定PCR技術具有簡便、快速、靈敏的特點,已廣泛應用于醫(yī)學診斷、法醫(yī)鑒定、古生物學研究等方面。下圖表示PCR的前三個循環(huán),目的基因位于模板DNA分子中與兩種引物所對應的位置之間,請據(jù)圖回答下列問題。PCR技術擴增過程1.細胞內DNA復制時是否需要引物?為什么?提示

需要。因為DNA聚合酶不能從頭開始合成DNA單鏈,只能將游離的脫氧核苷酸連接在一條DNA單鏈的3'端,所以細胞內DNA復制時需要引物。2.PCR過程中,如果兩種引物之間互補序列較長,會有什么樣的結果?提示

可能會導致在退火過程中,引物之間相互結合,從而使引物不能很好地與模板DNA鏈結合。3.PCR過程中,退火的目的是什么?提示

使2個引物分別與各自互補的DNA單鏈結合。4.PCR擴增的是完整的模板DNA分子嗎?提示

不是,PCR擴增的僅僅是兩種引物之間所對應的特定DNA片段。5.經過第幾輪擴增后,擴增出的含有目的基因的DNA片段才不含黏性末端?比例是多少?提示

第三輪。1/4。6.如果已知某目的基因的序列和結構,利用PCR篩選和擴增出該目的基因的關鍵是什么?提示

根據(jù)目的基因兩端的核苷酸序列設計引物。討論1.目的基因雙鏈DNA片段在第

次循環(huán)后出現(xiàn)。2.第n次循環(huán)后共有

個分子。這些分子可以分為3種類型：目的基因雙鏈DNA片段為

個，雙鏈中有1條鏈長于目的基因的DNA片段為

個，雙鏈均長于目的基因的DNA片段有

個。3.共進行n輪循環(huán)，總共消耗引物A的數(shù)量

個。第n輪循環(huán)后，含有引物A的DNA數(shù)量

個。三（2n-2n）2（n-1）22n2n-12n-1利用PCR技術擴增目的基因,其原理與細胞內DNA復制類似，如圖所示。圖中引物為單鏈DNA片段,它是子鏈合成延伸的基礎。①從理論上推測,第四輪循環(huán)產物中含有引物A的DNA片段所占的比例為

。②在第

輪循環(huán)產物中開始出現(xiàn)兩條脫氧核苷酸鏈等長的DNA片段。15/16三PCR技術與細胞內DNA復制的比較比較項目細胞內DNA復制PCR技術區(qū)別解旋方式場所酶引物溫度結果聯(lián)系解旋酶催化DNA在高溫下變性解旋主要在細胞核內細胞外解旋酶、DNA聚合酶熱穩(wěn)定TaqDNA聚合酶細胞內溫和條件3個溫度，需在不同溫度下進行合成整個DNA分子擴增特定的DNA片段或基因(1)模板：均需要脫氧核苷酸雙鏈作為模板(2)原料：均為四種脫氧核苷三磷酸（dNTP）(3)酶：均需DNA聚合酶(4)引物：都需要引物，使DNA聚合酶從引物開始進行互補鏈的合成RNA、最后切除單鏈DNA、始終存在用PCR可以擴增mRNA嗎？mRNA不可以直接擴增，需要將它逆轉錄成cDNA再進行擴增。1.逆轉錄酶以RNA為模板合成一條與RNA互補的DNA鏈，形成RNA-DNA雜交分子；2.核酸酶H降解RNA-DNA雜交分子中的RNA鏈，使之變成單鏈DNA；3.以單鏈DNA為模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一條互補的DNA鏈，形成雙鏈DNA分子，即cDNA（4）產物鑒定的方法------電泳技術

核酸帶負電（含磷酸基團），其移動速率主要受核酸片段長度的影響。在電場強度一定時，核酸分子越大，向正極移遷速率越慢。電泳時常使用凝膠作為介質，凝膠的孔隙可起到分子篩的作用；凝膠浸沒于電泳緩沖液中。電泳緩沖液的作用是在電泳過程中維持合適的PH，并使溶液具有一定的導電性，利于核酸遷移。每個條帶包含的DNA片段長度是相同的DNA相對分子質量標準物---作為參照物亞甲基藍將DNA染成藍色分離、鑒定、純化核酸和蛋白質的方法

DNA本身是無色的，可以用熒光或放射性染料對DNA進行標記，或使用亞甲基藍將DNA染成藍色。

含有DNA條帶的凝膠可以用刀片切割下來，回收凝膠中的DNA，從而達到提純的目的。核酸分子大小采用堿基對數(shù)進行描述。DNA相對分子質量標準物（DNAMarker）是一組已知長度的和含量的標準DNA片段混合物，在電泳中能作為參照物。不同的DNAMarker所含的DNA片段的長度和含量是不同的。利用電泳技術鑒定PCR擴增產物一、實驗原理：活動·PCR擴增DNA片段及凝膠電泳鑒定（1）PCR經過多次循環(huán)______、_______、_______三個步驟，可獲得大量目的基因或DNA片段。（2）PCR技術擴增的酵母細胞中編碼核糖體RNA的DNA部分片段，長度為841bp，通過______________進行鑒定。（3）PCR擴增DNA片段還利用了______________的原理；變性退火延伸瓊脂糖凝膠電泳1.利用PCR在體外進行DNA片段擴增的原理DNA半保留復制2.DNA片段電泳鑒定的原理①DNA分子具有_____________，在一定的pH下，這些基團可以帶上正電荷或負電荷，在電場的作用下，這些________會向著________________的電極移動，這個過程就是電泳。可解離的基團帶電分子與它所帶電荷相反②PCR的產物一般通過_______________來鑒定；③在凝膠中DNA分子的遷移速率與___________、______________和_____等有關④凝膠中的DNA分子使用

進行染色，再用

以及蒸餾水

，觀察并分析瓊脂糖凝膠中DNA條帶。瓊脂糖凝膠電泳凝膠的濃度亞甲基藍溶液75%酒精脫色DNA分子的大小構象PCR儀、微量離心管、微量移液器、一次性吸液槍頭電泳裝置（包括電泳儀、電泳槽等）

4種脫氧核苷三磷酸的等量混合液、2種引物

TaqDNA聚合酶、模板DNA、擴增緩沖液、無菌水、

電泳緩沖液、凝膠載樣緩沖液、瓊脂糖和核酸染料等瓊脂糖凝膠電泳裝置PCR儀2.材料用具1.微量移液器槍頭、微量離心管使用前需進行高壓蒸汽滅菌。2.擴增緩沖液（含

Mg2+)，增強Taq酶的活性4.上樣緩沖液(loadingbuffer)；內含甘油可以增加樣品密度，確保DNA能夠沉入加樣孔內；含有少許溴酚藍作為電泳指示劑，電泳時溴酚藍遷移速率較快，在其遷移出凝膠前關閉電泳儀電源。5.0.1%亞甲基藍溶液：稱取0.1g亞甲基藍溶于100mL蒸餾水中。避免接觸皮膚和眼睛，避光保存。3.市售2U/uLTaqDNA聚合酶(U為酶活力單位，定義為30℃、最適pH、底物濃度飽和的條件下，1min轉化1umol底物所需要的酶量)3.方法步驟（1）PCR擴增①使用___________將PCR體系各成分加入0.2mL已滅菌的微量離心管中。②以3000г/min的轉速離心____,使反應液集中于微量離心管的底部。③將微量離心管放入_______中，設置反應條件.擴增后的PCR產物可儲存在_______條件下。微量移液器30sPCR儀-20℃（2）瓊脂糖凝膠電泳①制備瓊脂糖凝膠②加樣③電泳制備瓊脂糖凝膠：溶化：稱取瓊脂糖0.25g，加到盛有25ml電泳緩沖液的三角瓶中。將三角瓶蓋上封口膜并用橡皮筋綁住后，用微波爐或沸水浴加熱，使瓊脂糖溶化呈透明狀。倒模：將瓊溶化的脂糖倒入膠盒，若瓊脂糖中有氣泡，可用槍頭除去氣泡。凝固：待凝膠完全凝結，小心拔出梳子，凝膠上梳齒的位置成為加樣孔。加液：將裝有凝膠的膠托從膠盒中取出，放入電泳槽內，加樣孔一端朝向負極，向電泳槽中加入電泳緩沖液，使其沒過凝膠。加樣：用微量移液器向50μLPCR產物中加入10μ

L6×上樣緩沖液，并反復吹吸混合均勻。將20μL樣品混合液緩慢加到加樣孔內（留第一個加樣孔加

DNAMarker與上樣緩沖液）。將20μLDNAMarker與4μ

L6×上樣緩沖液混合均勻，全部加到加樣孔內。每加樣一次需更換一次槍頭.電泳：蓋上電泳槽蓋，連接好電極插頭后再接通電源。將直流電泳儀的電壓設置成80V，開始電泳。