動物實驗室安全防護與實施暖通南社

2月26日生物安全相關法律、法規(guī)、規(guī)范：《中華人民共和國傳染病防治法》全國人大《生物安全實驗室建筑技術規(guī)范》GB50346-2004《人間傳染的高致病性病原微生物實驗室和實驗活動生物安全審批管理辦法》2006.8.15《人間傳染的病原微生物名錄》2006.1.1《可感染人類的高致病性病原微生物菌(毒)種或樣本運輸管理規(guī)定》2005.12.28《傳染病病人或疑似傳染病病人尸體解剖查驗規(guī)定》2005.4.30《病原微生物實驗室生物安全管理條例》2004.11.12《衛(wèi)生部、勞動和社會保障部關于保障接觸病毒或細菌科研人員醫(yī)療服務有關問題的通知》2004.5.9《實驗室生物安全通用要求》(GB9489-2004)國家標準于2004年4月5日審定通過，2004年10月1日正式實施。2008年修訂，目前實施的是《實驗室生物安全通用要求》(GB9489-2008)該標準的發(fā)布是我國實驗室安全管理、公共衛(wèi)生體系建設以及認證認可體系建設具有里程碑意義的一件大事，它標志著我國實驗室生物安全管理和實驗室生物安全認可工作步入了科學、規(guī)范和發(fā)展的新階段。實驗室生物安全組織體系：實驗室負責人為實驗室生物安全的第一責任人；實驗室負責人應當任命一名實驗室生物安全負責人；指定專人監(jiān)督檢查實驗室技術規(guī)范和操作規(guī)程的落實情況。

實驗室生物安全負責人應為微生物學家或專業(yè)人員，有基礎物理學、生物科學的技術背景，有與行政、技術、后勤的有效溝通協(xié)調。實驗室生物安全負責人的工作：(1)生物安全、生物安全保障以及技術規(guī)章方面的咨詢工作。(2)就技術方法、程序和方案、生物因子、材料和設備進行定期的內部安全檢查。(3)與有關人員討論違反生物安全方案或程序的情況。(4)核實所有工作人員都接受了適當?shù)纳锇踩嘤枴?5)進行生物安全繼續(xù)教育。(6)對于所有牽涉到潛在感染性物質或有毒物品泄露等意外事故進行調查，并將調查結果以及處理意見向實驗室主任和生物安全委員會報告。(7)就可能的實驗室感染與醫(yī)務人員進行協(xié)調。(8)在出現(xiàn)涉及感染性物質溢出或其他事故時，要確保清除了污染。(9)確保廢棄物的正確管理。(10)確保對所有設備在修理或維護之前已經過適當?shù)南咎幚怼?11)經常了解社區(qū)對衛(wèi)生和環(huán)境問題的態(tài)度。(12)要根據(jù)國家規(guī)定，針對病原體運入、運出實驗室制訂適當?shù)某绦颉?13)對所有涉及感染性物質研究工作的計劃、方案以及操作程序，均要在具體操作實施以前進行生物安全審查。(14)組織應急系統(tǒng)。實驗室生物安全管理體系文件：以四層次劃分為例：安全管理手冊：對組織結構、人員崗位及職責、安全及安保要求、安全管理體系、體系文件架構等規(guī)定和描述。安全要求不能低于國家和地方的相關規(guī)定及標準的要求。應明確規(guī)定人員的權限和責任，保證遵守安全管理體系要求。手冊編制注意事項：強調實驗室設立單位的主要負責人對安全管理負總責；批準頁由設立單位的主要負責人簽發(fā)。實驗活動相關的全過程：記錄：提供所完成活動的證據(jù)的文件，具可追溯性的文件，驗證、預防措施和糾正措施的證據(jù)。要求制定記錄管理程序；明確記錄應包含：記錄內容、要求、記錄的檔案管理、使用權限、記錄的安全、保存期限等；保證記錄的真實、足夠信息、可追溯性；記錄的更改規(guī)定及更改人簽字、日期；記錄存儲方式：紙質？電子文檔？便于查閱、檢索；記錄存放條件：盜竊？丟失？……涉及病原微生物實驗室生物安全法律法規(guī)與監(jiān)督管理：法律：中華人民共和國傳染病防治法。法規(guī)：病原微生物實驗室生物安全管理條例、醫(yī)療廢物管理條例。規(guī)章：傳染性非典型肺炎病毒的毒種保存、使用和感染動物模型的暫行管理辦法、傳染性非典型肺炎病毒研究實驗室暫行管理辦法、人間傳染的病原微生物名錄；標準：《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）、《微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》（WS233－2002）、《生物安全實驗室建設技術規(guī)范》。地方規(guī)范：上海市病原微生物實驗室生物安全管理實施細則、上海市一、二級病原微生物實驗室生物安全管理規(guī)范。生物危害程度的分級：根據(jù)對個體和群體的危害性分四級：Ⅰ級：指危害性最低的病毒、細菌、真菌和寄生蟲等生物因子；Ⅱ級：指中等危害的生物因子，多為條件致病菌或機會致病菌；Ⅲ級：指能引起個體的嚴重感染，但不易在人群中傳播擴散的生物因子；可用抗生素治療；Ⅳ級：指能引起個體和群體嚴重感染，難治療。病原微生物危害程度分類主要依據(jù)：微生物的致病性：致病性越強，導致的疾病越嚴重，其等級越高；微生物的傳播方式和宿主范圍。它們可能會受到當?shù)厝巳阂延械拿庖咚?、宿主群體的密度和流動、適宜媒介的存在以及環(huán)境衛(wèi)生水平等因素的影響。當?shù)厮邆涞挠行ьA防措施包括：通過接種疫苗或給予抗血清的預防（被動免疫）；衛(wèi)生措施，例如食品和飲水的衛(wèi)生；動物宿主或節(jié)肢動物媒介的控制。當?shù)厮邆涞挠行е委煷胧┌ǎ罕粍用庖?、暴露后接種疫苗以及使用抗生素、抗病毒藥物和化學治療藥物，還應考慮出現(xiàn)耐藥菌株的可能性。臨床微生物實驗室及免疫學病原體篩檢的防護標準應該是：病原體危害程度分類實驗活動BSL級別各類腸道致病菌3類（VC2類）BSL-2各類呼吸道致病菌3類（TB2類）BSL-2各類條件致病菌3類BSL-2乙型肝炎病毒3類BSL-2丙型肝炎病毒3類BSL-2愛滋病病毒2類BSL-2梅毒螺旋體3類BSL-2涉及動物的病原微生物實驗：動物實驗室涉及病原微生物，需要考慮的因素包括：正常傳播途徑，使用的容量和濃度，接種途徑，能否和以何種途徑被排出。關于動物實驗室中使用的動物，需要考慮的因素包括：動物的自然特性，亦即動物的攻擊性和抓咬傾向性，自然存在的體內外寄生蟲，易感的動物疾病，播散過敏原的可能性等。對使用野外捕捉的野生動物應考慮潛伏感染的可能性。危險物品共分為九大類：第1類爆炸品第2類氣體第3類易燃液體第4類易燃固體第5類氧化劑和有機過氧化物第6類毒害品和感染性物質第7類放射性物品第8類腐蝕品第9類雜項危險品標準的BSL-2實驗室除了滿足BSL-1的要求以外，在門上增加了生物危險標志、II級生物安全柜。按國標（GB19489-2008）,還要配備高壓蒸汽滅菌器、洗眼器。BSL-1

實驗室：無特殊要求；BSL-2

實驗室：配備高壓滅菌設備，著專用工作服，帶乳膠手套，生物安全柜(A2級)內操作。BSL-2：必須強調對污染的針頭或利器的使用要非常謹慎。對易于通過氣溶膠途徑傳播的微生物、具有增加工作人員暴露氣溶膠或高度飛濺物的程序。二級生物安全防護水平微生物操作必需在一級生物安全防護水平的基礎之上，增加生物安全柜、高壓滅菌器、安全離心機罩帽、防濺罩或面罩等。實驗室生物安全防護的基本原則：安全設備和個體防護；實驗室設計與建造的特殊要求；安全操作規(guī)程；致病微生物及其毒素在實驗室之間的傳遞；管理制度；微生物危害評估。實驗室內務管理：1）有內務管理的政策和程序，包括內務工作所用清潔劑和消毒滅菌劑的選擇、配制、效期、使用方法、有效成分檢測及消毒滅菌效果監(jiān)測等政策和程序，應評估和避免消毒滅菌劑本身的風險。2）不應在工作面放置過多的實驗室耗材。3）應時刻保持工作區(qū)整潔有序。4）應指定專人使用經核準的方法和個體防護裝備進行內務工作。5）不應混用不同風險區(qū)的內務程序和裝備。6）應在安全處置后對被污染的區(qū)域和可能被污染的區(qū)域進行內務工作。7）應制定日常清潔計劃和清場消毒滅菌計劃，實驗室設備，工作表面。8）指定專人監(jiān)督內務工作，定期評價。9）實驗室的內務規(guī)程和所用材料發(fā)生改變時通知實驗室負責人。10）實驗室規(guī)程、工作習慣或材料的改變可能對內務人員有潛在危險時，通知實驗室負責人并書面告知內務管理負責人。11）發(fā)生危險材料溢灑時，啟用應急處理程序。12)

相關記錄安全保存。實驗室操作與技術：工作時進出受約束或受限制；禁止吃、喝、吸煙；禁止用口移液；將濺灑和氣溶膠減到最少；每天對工作面消毒；將廢物消毒；保持對昆蟲和嚙齒類動物的控制。入實驗室：門禁，更衣，填寫準出入實驗室表。查看實驗室：儀器，試劑，標本，填寫使用記錄。操作：防漏，防氣溶膠，自身保護，遵守SOP。廢棄物處理：廢物桶，廢物袋，高壓（指示物），登記。出實驗室：更衣，清潔，消毒，填寫出入實驗室表。標識系統(tǒng)：設置原則：安全、明確、醒目、便利、通用。標識系統(tǒng)分四大類：警告標識、禁止標識、指令標識、提示標識。用于標示危險區(qū)、警示、指示、證明等的圖文標識是管理體系文件的一部分臨時標識，如“污染”、“消毒中”、“設備檢修”等。標示出危險區(qū)，且應適用于相關的危險。同時使用標識和物理屏障標示出危險區(qū)。標示具體的危險材料、危險。包括：生物危險、有毒有害、腐蝕性、輻射、刺傷、電擊、易燃、易爆、高溫、低溫、強光、振動、噪聲、動物咬傷、砸傷等；同時提示必要的防護措施。注明設備的可用狀態(tài)、驗證周期、下次驗證或校準的時間等信息。實驗室入口處應有標識。明確說明生物防護級別、操作的致病性生物因子、實驗室負責人姓名、緊急聯(lián)絡方式和國際通用的生物危險符號；適用時，應同時注明其他危險。實驗室所有房間的出口和緊急撤離路線有指示。在無照明的情況下也可清楚識別的標識。所有管道和線路應有明確、醒目和易區(qū)分的標識。所有操作開關應有明確的功能指示標識。采取防止誤操作或惡意操作的措施。定期（至少每12個月一次）評審實驗室標識系統(tǒng)。及時更新，以確保其適用現(xiàn)有的危險。國際生物危害警告標志：生物安全實驗室廢物處置：有危險廢物處置程序，包括對排放標準及監(jiān)測規(guī)定。評估和避免危險廢物處理和處置風險。按相關標準分類處理和處置廢物。危險廢物棄置于專門設計的、專用的和有標識容器內。銳器（包括針頭、小刀、金屬和玻璃等）應直接棄置于耐扎的容器內。由經過培訓的人員處理危險廢物，并應穿戴適當?shù)膫€體防護裝備。應存放在指定的安全地方。在實驗室內消毒滅菌含活性高致病性生物因子的廢物。廢棄物處理高壓蒸汽滅菌器：下排氣滅菌器的裝載量不得超過柜室內容量的80%；預真空滅菌器的裝載量不得超過柜室容積90%，且不得小于柜室容積的10%和5%。必須將不同類物品裝放在一起，則以最難達到滅菌物品所需的溫度和時間為準。物品裝放時，上下左右相互間均應間隔一定距離以利蒸汽置換空氣。安全檢查：設施設備的功能和狀態(tài)正常；警報系統(tǒng)的功能和狀態(tài)正常；應急裝備的功能及狀態(tài)正常；消防裝備的功能及狀態(tài)正常；危險物品的使用及存放安全；廢物處理及處置的安全；人員能力及健康狀態(tài)符合工作要求；安全計劃實施正常；實驗室活動的運行狀態(tài)正常；不符合規(guī)定的工作及時得到糾正；所需資源滿足工作要求。應急措施：制定應急措施的政策和程序，包括：生物性、化學性、物理性、放射性等緊急情況；火災、水災、冰凍、地震、人為破壞等任何意外緊急情況；保證使留下的空建筑物處于盡可能安全狀態(tài)的措施；征詢相關主管部門的意見和建議及聯(lián)系方式。應急程序至少包括：負責人、組織、應急通訊；報告內容；個體防護和應對程序；應急設備；撤離計劃和路線；污染源隔離和消毒滅菌；人員隔離和救治；現(xiàn)場隔離和控制；風險溝通。使所有人員（包括來訪者）熟悉：應急行動計劃；撤離路線；緊急撤離的集合地點。每年應至少組織所有實驗室人員進行一次演習。評估與演練：確保應急措施的針對性、科學性、持續(xù)有效性和充分性。1級生物安全實驗室溢出處理：通知在這一區(qū)域的其他人預防污染。穿戴手套、實驗衣和面罩，用紙巾覆蓋溢出物，把濃縮的消毒劑倒在溢出物區(qū)域周圍并與溢出物混和，并維持適當?shù)慕佑|時間。用鑷子撿起一些玻璃碎片并放在生物危害高壓滅菌袋內待凈化后丟棄。用皂液和消毒洗手液洗手。II級生物安全實驗室溢出：迅速離開房間，避免吸入經空氣傳播的物質。通知其他的人離開。關門并貼上警告標簽。移去污染的衣物，放在生物危害袋內。用肥皂和水清洗所有暴露的皮膚。報告轉化所生物安全負責人，如果需要幫助，請咨詢生物安全委員會。在進入實驗室所前，使氣溶膠彌散至少30分鐘。備齊處理物（消毒劑，紙巾，生物危害袋和鑷子）。穿上防護衣（實驗外套，面罩，實驗手套，必要時穿上長統(tǒng)靴）。按溢出物的狀態(tài)，可以戴一個HEPA過濾呼吸罩以代替外科面罩。用消毒濕巾覆蓋污染區(qū)域，然后，小心地倒上消毒劑在溢出物的周圍。避免擴大污染區(qū)域。因為要被溢出物稀釋所以要用更濃縮的消毒劑。允許至少20分鐘的接觸反應時間。用鑷子撿起一些尖銳的物品丟棄在一個尖銳物存放器皿內，用消毒劑浸泡。用消毒劑擦凈溢出物可能飛濺到的周圍區(qū)域。用消毒劑浸泡溢出物，并放在一個生物危害袋內。用10％家用漂白液噴霧這個區(qū)域和并空氣干燥，或在接觸反應10分鐘后用消毒濕巾擦掉。用消毒劑或抗菌皂和水清洗手和暴露的皮膚部分。實驗動物的護理和使用原則：實驗動物飼養(yǎng)和使用應遵守國家相關法律和規(guī)定應明確使用實驗動物的理由和目的明確實驗所使用動物的種類和數(shù)量，動物的數(shù)量應滿足統(tǒng)計學的要求。完善操作規(guī)程，避免或減輕因實驗對動物造成的不適和痛苦。包括使用適當?shù)逆?zhèn)靜、鎮(zhèn)痛或麻醉方法；禁止不必要的重復操作。嚴格按程序實施實驗后動物的處理，包括麻醉、止痛、實驗后的護理或用麻醉方法處死。實驗過程中要求保證實驗動物的良好生活條件，包括飼養(yǎng)環(huán)境、符合需求的飼料及細心的護理等。研究人員和實驗動物操作人員應接受實驗動物的基本知識和操作技能等方面的培訓。使用過程中要求保證周圍環(huán)境和實驗人員的安全。動物實驗過程的行為規(guī)范：1.物理限制：指在實驗過程中包括檢查、收集標本、給藥、治療或實驗操作等，用手或工具限制動物活動的過程。物理限制的主要原則和要求：限制的工具不能作為常規(guī)的飼養(yǎng)工具。工具的設計應合理，不要僅考慮實驗的便利，主要考慮盡量減少動物的不適，避免傷害。盡量減少限制的時間，以達到實驗目的為基準。在限制過程中，如果發(fā)生損傷或嚴重的行為改變，應暫?；蚪瓜拗?，并給予處理或治療。保證實驗人員和周圍人員的安全。2.手術操作：有些實驗需要對動物進行手術，即打開或刺穿動物的身體，對動物的身體或生理機能產生較大的損害，同時，實驗人員也容易被血液/體液污染或被器械、針頭刺傷，存在潛在生物污染的威脅，因此必須做到。操作一定要使用適當?shù)逆?zhèn)靜、鎮(zhèn)痛或麻醉方法。禁止不必要的重復操作。不提倡利用一個動物進行多個手術實驗，但是，為充分利用動物資源，經動物倫理委員會許可，在可能的條件下可以實施。嚴格實驗操作規(guī)程，防止發(fā)生血液/體液外濺和針刺傷，避免生物污染。手術后的動物、標本以及所用器具材料等必須按規(guī)定程序妥善處置。3.飲食的限制：實驗用動物原則上要求隨時飲食，如果一些實驗需要動物限制食物或水的攝入量，應保證動物存活所需要的最低需求量。4.廢棄物和尸體處理：1）血液和體液標本的處理用于抗體、抗原、病原微生物、生化指標等檢查的血液和體液，按照要求進行處理并檢測，檢測后的標本經121℃，30min高壓消毒處理。2）動物臟器組織的處理

動物器官組織，尤其是用于病原微生物分離的組織按照標準程序進行處理；用于病理切片的組織，均需要經過甲醛固定后再進行切片。剩余的組織經121℃，30min高壓消毒處理。3）動物尸體的處理安樂處死后的動物尸體，取材完畢后，經121℃，30min高壓滅菌處理后，集中送環(huán)保部門處理。動物生物安全三級（ABSL-3）實驗室及以上級的實驗室的感染動物尸體需經室內和雙扉兩道高壓滅菌，才能移出實驗室。4）動物咽拭子的處理用于病原分離和PCR檢測的咽拭子，按照各自的要求處理后，進行病毒分離和PCR檢測，剩余的標本經121℃，30min高壓消毒處理。5）病原分離培養(yǎng)物的處理病原分離的培養(yǎng)物，不論是陽性還是陰性結果，均需經121℃，30min高壓消毒處理。實驗動物使用程序和要求：實驗室如需要使用實驗動物，應首先向生物安全和倫理委員會提出申請，填寫申請表。使用實驗室得到認可后，根據(jù)申請表中申請的動物種屬和數(shù)量，安排實驗動物的飼養(yǎng)和使用。實驗動物必須在指定的區(qū)域內飼養(yǎng)和使用，禁止在實驗室飼養(yǎng)動物。實驗操作結束時，動物須返回指定的飼養(yǎng)區(qū)域內，不能在實驗室內過夜。動物實驗應在實驗室內指定的區(qū)域進行。含有感染性材料的動物實驗要求：涉及感染性材料的操作要在生物安全柜中進行，并防止泄露在安全柜底面。操作包括感染動物的解剖、組織的取材、采血及動物的病原接種。動物籠具在清洗前先做消毒處理。污物、一次性物品需放入醫(yī)療廢物專用垃圾袋中，經高壓滅菌后方可拿出實驗室。動物尸體用雙層醫(yī)療廢物專用垃圾袋包裹后，放入標有動物尸體專用的容器中，用消毒液噴霧容器表面后，運至解剖區(qū)域剖檢。生物安全柜使用后應用消毒液擦拭、揩干。廢液需按比例倒入有消毒液的桶中，倒入時需沿容器壁輕倒并戴眼罩，防止濺入眼中。如果有感染性物質濺到生物安全柜上、地上以及其他地方，應按“菌，毒外溢在臺面、地面和其他表面”處理。每天工作結束時，應用消毒液擦拭門把手和地面等表面區(qū)域。廢物放入高壓滅菌器內時需同時粘貼指示條，物品移出前觀察指示條是否達到滅菌要求。顏色不符時需重復高壓滅菌。高壓滅菌器需每月做滅菌測試一次，并作記錄。小動物的飼養(yǎng)：小動物主要指小鼠、大鼠、豚鼠等嚙齒類動物，其飼養(yǎng)應遵循下列原則：使用動物必須按國家標準或實驗特殊要求檢驗合格，充分準備后進入系統(tǒng)，飼養(yǎng)人員應按實驗設施規(guī)定程序要求進入系統(tǒng)。及時觀察動物飲食、精神狀況，有無異常表現(xiàn)，患病或死亡。動物應可自由進食、飲水。定期檢查水、料是否充足并及時補給。同時保證其他飼養(yǎng)條件完備。大動物飼養(yǎng)：大動物主要指狗、豬及非人類靈長類動物等。使用動物必須按國家標準或實驗特殊要求，檢驗合格，充分準備后方可進入動物實驗室。應將每只動物日攝取總量分批次喂給，以保證動物的進食量和減少浪費。應經常檢查飲水裝置，及時補充不足。動物飼養(yǎng)區(qū)域應每天打掃，保持清潔，每周將地面消毒三次。喂給瓜果、蔬菜等須洗凈消毒。禁止喂給腐爛發(fā)霉不潔的食物，飲水要清潔。對飼喂動物所用的小推車、食物、水容器等用品每周進行兩次消毒。室內光照，要求明暗各12h自動交替。動物的檢疫：實驗動物進入檢疫室

在檢疫室的緩沖間內，用75%酒精噴灑動物的外包裝進行消毒，打開紫外燈照射10～15min。將經上述處理的動物移入檢疫室，根據(jù)要求進行檢疫。各動物的檢疫期不同，大動物為2周，小動物為1周。在