一、任務(wù)來源

本國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)列入國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)委關(guān)于下達(dá)2018年第

二批國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)制修訂計(jì)劃的通知》（國(guó)標(biāo)委綜合〔2018〕41號(hào)），項(xiàng)目編號(hào)“20181041-T-424”。

該標(biāo)準(zhǔn)由中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化研究院提出并歸口，由清華大學(xué)等單位承擔(dān)該標(biāo)準(zhǔn)的制定任務(wù)。

二、標(biāo)準(zhǔn)制定目的和意義

數(shù)字PCR（dPCR）作為第三代PCR的技術(shù)代表，由Vogelstein等提出。dPCR是把一

個(gè)樣本的反應(yīng)體系均勻分配到大量反應(yīng)單元中，每個(gè)反應(yīng)單元中不包含或包含一個(gè)到多個(gè)

目的核酸序列，獨(dú)立地進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)每個(gè)反應(yīng)單元的熒光信號(hào)，最終根據(jù)泊松分布

以及熒光信號(hào)陽性的反應(yīng)單元數(shù)量占所有反應(yīng)單元的比例，來計(jì)算目的核酸序列的拷貝

數(shù)，dPCR反應(yīng)中熒光信號(hào)的產(chǎn)生過程基本與qPCR相同。目前，該技術(shù)已經(jīng)在稀有突變檢

測(cè)、CNV分析和復(fù)雜樣本基因表達(dá)檢測(cè)等方面有著廣泛的應(yīng)用。

本標(biāo)準(zhǔn)擬將dPCR技術(shù)應(yīng)用到常見污染菌和致病菌的檢測(cè)體系構(gòu)建中，為生產(chǎn)企業(yè)的

過程控制提供必要的技術(shù)保障，也為dPCR技術(shù)在其它污染菌和致病菌的檢測(cè)上的推廣奠

定基礎(chǔ)。

三、標(biāo)準(zhǔn)制定原則和依據(jù)

（一）標(biāo)準(zhǔn)編制原則

本標(biāo)準(zhǔn)以現(xiàn)有國(guó)內(nèi)外相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范為基礎(chǔ)，與現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)相銜接，主要

對(duì)微生物痕量基因殘留測(cè)定有關(guān)微滴數(shù)字PCR法的標(biāo)準(zhǔn)方法和流程進(jìn)行規(guī)范，旨在對(duì)不同

工業(yè)微生物菌株的質(zhì)量評(píng)價(jià)具有實(shí)用性和統(tǒng)一性。

（二）標(biāo)準(zhǔn)制訂主要依據(jù)

1、標(biāo)準(zhǔn)編寫遵循GB1.1-2009《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》

的有關(guān)要求。

2、標(biāo)準(zhǔn)編寫內(nèi)容參考的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，包括：

GB/T14926.43-2001實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)檢測(cè)染色法、培養(yǎng)基和試劑

GB/T6682-2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法

1

GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量檢測(cè)規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)

GB/T10092-2009數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)處理和解釋.測(cè)試結(jié)果的多重比較

ISO2602-1980測(cè)試結(jié)果的統(tǒng)計(jì)解釋均值的估計(jì)和置信區(qū)間

3、法律、法規(guī)及文件

《中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化法》

《中華人民共和國(guó)標(biāo)準(zhǔn)化法實(shí)施條例》

《國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化體系建設(shè)發(fā)展規(guī)劃（2016—2020年）》

《深化標(biāo)準(zhǔn)化工作改革方案》

四、主要工作過程

1、組成標(biāo)準(zhǔn)起草小組

標(biāo)準(zhǔn)制定任務(wù)下達(dá)后，2018年6月，組成了標(biāo)準(zhǔn)起草工作組，明確了任務(wù)要求，安排

了工作進(jìn)度，成立了標(biāo)準(zhǔn)起草工作小組，會(huì)議研究討論了工作小組的工作目標(biāo)、任務(wù)分解、

可量化的考核指標(biāo)，以及通過召開調(diào)研會(huì)、行業(yè)需求征集會(huì)、專家論證會(huì)和行業(yè)用戶推廣

會(huì)等，旨在制定微生物痕量基因殘留測(cè)定的微滴數(shù)字PCR法，且可以有效推行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

2、開展相關(guān)調(diào)研情況

為了更好地制定標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行了方法調(diào)研、可行性調(diào)研，以及用戶需求調(diào)研等活動(dòng)，從

行業(yè)需求層面、科學(xué)理論層面、方法學(xué)角度，以及實(shí)際可操作性等方面，對(duì)該標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了

多角度論證。

3、標(biāo)準(zhǔn)起草完善過程

依據(jù)GB/T1.1—2000《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)和編寫規(guī)則》、GB/T

1.2—2002《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第2部分：標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)范性技術(shù)要素內(nèi)容的確定方法》等標(biāo)

準(zhǔn)編制要求，對(duì)《微生物痕量基因殘留測(cè)定微滴數(shù)字PCR法》標(biāo)準(zhǔn)開展了研制工作，2018

年起草工作小組完成了《微生物痕量基因殘留測(cè)定微滴數(shù)字PCR法》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（草案）。

并針對(duì)草案中的具體條件進(jìn)行優(yōu)化和擴(kuò)展，2018年12月征求了專家意見，起草組按照專

家意見對(duì)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容進(jìn)行了修改完善，形成了標(biāo)準(zhǔn)征求意見稿。

五、主要技術(shù)內(nèi)容

數(shù)字PCR是將原始的擴(kuò)增體系進(jìn)行分割，對(duì)每個(gè)分割體系進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)，之后進(jìn)行

數(shù)據(jù)分析，最終根據(jù)泊松分布原理以及陽性微滴的比例，分析軟件可直接給出待檢靶分子

的拷貝數(shù)濃度。全新的數(shù)字化終點(diǎn)檢測(cè)方式和分子計(jì)數(shù)的定量手段，賦予了數(shù)字PCR卓越

2

的性能，即無需標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照，對(duì)影響PCR效率的抑制物不敏感，大大提高了檢測(cè)靈

敏度、精確度、準(zhǔn)確度和重復(fù)性，并實(shí)現(xiàn)了真正意義上的絕對(duì)定量。

目前應(yīng)用比較多的數(shù)字PCR是微滴式數(shù)字PCR和芯片式數(shù)字PCR。芯片式數(shù)字PCR是

應(yīng)用的微流控芯片實(shí)現(xiàn)反映的分割，但芯片式數(shù)字PCR由于價(jià)格昂貴目前應(yīng)用還比較少。

微滴式數(shù)字PCR是形成的油包水的微小液滴，該方法成本較低，應(yīng)用較為普遍。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)一

驗(yàn)證材料：Lactobacillusplantarum提取的基因組；Saccharomycescerevisiae提

取的基因組。

方法驗(yàn)證1：S.ce的引物和L.pl的引物特異性驗(yàn)證

驗(yàn)證過程：在PCR儀中用S.ce的引物分別擴(kuò)增S.ce和C.al的基因組，用L.pl的引物

分別擴(kuò)增L.pl和E.fa的基因組。對(duì)其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

驗(yàn)證結(jié)果：如圖1所示，S.ce的引物擴(kuò)增S.ce的基因組，獲得105bp的產(chǎn)物；S.ce的

引物擴(kuò)增C.al的基因組，無擴(kuò)增產(chǎn)物；L.pl的引物擴(kuò)增L.pl的基因組，獲得71bp的產(chǎn)物；

L.pl的引物擴(kuò)增E.fa的基因組，無擴(kuò)增產(chǎn)物。驗(yàn)證S.ce的引物和L.pl的引物特異性良好。

圖1S.ce的引物和L.pl的引物特異性驗(yàn)證

方法驗(yàn)證2：S.ce的探針優(yōu)化

驗(yàn)證過程：設(shè)計(jì)了3條不同的S.ce的探針，稱為SC-1，SC-2，SC-3。在實(shí)時(shí)熒光定

量PCR（qPCR）中分別使用3種不同的探針進(jìn)行擴(kuò)增。并通過數(shù)字PCR測(cè)得SC-1和SC-2

的陽性率進(jìn)行對(duì)比。

驗(yàn)證結(jié)果：qPCR結(jié)果如圖2所示，SC-2的信號(hào)更強(qiáng)，但SC-1的高本底熒光使得陰

性液滴信號(hào)更強(qiáng)，便于分析。數(shù)字PCR結(jié)果如表1所示，SC-1的陽性率對(duì)比SC-2沒有降

3

低。因此采用SC-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2S.ce的探針優(yōu)化

表1數(shù)字PCR中SC-1和SC-2的陽性率

樣品陽性液滴數(shù)陰性液滴數(shù)陽性率拷貝數(shù)

Sce-5x-SC-11410180000.07831.63*103

Sce-5x-SC-21261180000.07011.45*103

方法驗(yàn)證3：L.pl核酸qPCR和dPCR檢測(cè)線性

驗(yàn)證過程：在qPCR儀中對(duì)不同濃度的L.pl待測(cè)核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增，獲得相應(yīng)的Ct

值數(shù)據(jù)；在dPCR儀中對(duì)不同濃度的L.pl待測(cè)核酸樣品進(jìn)行擴(kuò)增，獲得相應(yīng)的拷貝數(shù)數(shù)據(jù)。

驗(yàn)證結(jié)果：qPCR的結(jié)果如表2所示；dPCR的結(jié)果如表3所示；對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，

以對(duì)應(yīng)濃度的Ct值為橫坐標(biāo)，拷貝數(shù)以10為底的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)繪圖，結(jié)果如圖3所示。

可以看出dPCR結(jié)果與qPCR結(jié)果展現(xiàn)出極高的線性關(guān)系，R2＞0.99，dPCR的檢測(cè)限可達(dá)

到2.22拷貝/微升。

表2不同濃度的L.pl核酸的qPCR檢測(cè)結(jié)果

濃度

26ng2.6ng260pg26pg2.6pg260fg26fg2.6fg

/μL

拷貝數(shù)

7.41*1067.41*1057.41*1047.41*1037.41*10274.17.410.741

copies/μL

Ct值15.518.522.526.529.733.5無法確定無法確定

表3不同濃度的L.pl核酸的dPCR檢測(cè)結(jié)果

濃度260pg26pg2.6pg260fg26fg2.6fg

4

ng/μL

拷貝數(shù)

7.41*1047.41*1037.41*10274.17.410.741

copies/μL

dPCR結(jié)果

4.55*1044.55*10246.719.94.442.22

copies/μL

圖3不同濃度的L.pl核酸的dPCR結(jié)果和qPCR結(jié)果的線性關(guān)系

方法驗(yàn)證4：S.ce核酸qPCR和dPCR檢測(cè)

驗(yàn)證過程：對(duì)不同濃度的S.ce核酸分別進(jìn)行qPCR和dPCR驗(yàn)證。

驗(yàn)證結(jié)果：對(duì)qPCR和dPCR結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析，如表4所示。dPCR可以達(dá)到

12.8拷貝/微升。

表4S.ce核酸qPCR和dPCR檢測(cè)結(jié)果

單菌落

濃度/μL57.1ng11.42ng5.71ng570pg0

菌液

Ct值--2629無法確定32.6

dPCR結(jié)果2.76*103

1.3*10457.512.80-

copies/μL1.63*103

驗(yàn)證試驗(yàn)二

驗(yàn)證材料：目標(biāo)基因1；目標(biāo)基因2；目標(biāo)基因3。

方法驗(yàn)證1：目標(biāo)基因1的ddPCR法檢測(cè)的溫度優(yōu)化

驗(yàn)證過程：對(duì)目標(biāo)基因1的普通PCR反應(yīng)程序中的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置退火溫度

5

為55℃，梯度差異為5℃，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將96孔板轉(zhuǎn)移到微滴檢測(cè)儀中進(jìn)行檢測(cè)。

驗(yàn)證結(jié)果：如圖4所示，從50℃~56.8℃的擴(kuò)增反應(yīng)效率差距不大，54℃時(shí)微滴數(shù)量

較多，且微滴比較密集，特異性較好，所以目標(biāo)基因1的ddPCR反應(yīng)的最佳退火溫度為

54℃。

1234567891011

圖4目標(biāo)基因1的ddPCR法檢測(cè)的溫度優(yōu)化結(jié)果

Fig.4TheoptimizationtemperatureresultofSalmonellabyddPCR

1:50.0℃;2:50.2℃;3:50.7℃;4:51.6℃;5:52.7℃;6:54.0℃;7:55.4℃;8:56.8℃;9:58.1℃;

10:59.2℃;11:60.0℃;

方法驗(yàn)證2：目標(biāo)基因2的ddPCR法檢測(cè)的溫度優(yōu)化結(jié)果

驗(yàn)證過程：設(shè)置目標(biāo)基因2的PCR反應(yīng)程序的退火溫度為55℃，梯度差異為5℃，擴(kuò)

增反應(yīng)結(jié)束后，將96孔板轉(zhuǎn)移到微滴檢測(cè)儀中進(jìn)行檢測(cè)。

驗(yàn)證結(jié)果：如圖5所示，50.2℃時(shí)微滴數(shù)量和質(zhì)量都較好，所以目標(biāo)基因2的ddPCR

反應(yīng)的最佳退火溫度為50.2℃。

6

1234567891011

圖5目標(biāo)基因2的ddPCR法檢測(cè)的溫度優(yōu)化結(jié)果

Fig.5TheoptimizationtemperatureresultofStaphyloccocusaureusbyddPCR

1:50.0℃;2:50.2℃;3:50.7℃;4:51.6℃;5:52.7℃;6:54.0℃;7:55.4℃;8:56.8℃;9:58.1℃;10:59.2℃;11:60.0℃;

方法驗(yàn)證3：目標(biāo)基因