實驗五

醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質并定量1精品醫(yī)學ppt目的

學習醋酸纖維薄膜電泳分離血清蛋白質的原理和方法學習蛋白質染色的方法了解電泳法分離血清蛋白質的臨床意義

2精品醫(yī)學ppt原理

1、電泳（electrophoresis）法在外電場的作用下，帶電顆粒，例如不處于等電狀態(tài)的蛋白質分子帶電荷的蛋白質，在電場中將向著與其所帶電荷電性相反的電極泳動這種現象稱為電泳。3精品醫(yī)學ppt電泳影響因素蛋白質在電場中移動的速度取決于蛋白質所帶的電荷性質、數量及質點的大小和形狀；此外還受外界因素的影響如，電場強度、溶液的PH、離子強度及電滲等。常見的有：醋酸纖維膜電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、毛細管電泳4精品醫(yī)學ppt醋酸纖維薄膜電泳醋酸纖維薄膜作為支持介質醋酸纖維薄膜：將纖維素的羥基乙?；癁榇姿狨?，溶于丙酮后制成有均一細密微孔的薄膜，其厚度為0.1～0.15mm

5精品醫(yī)學ppt血漿蛋白：(1)清蛋白（Alb）、α1、α2、β、纖維蛋白原和γ-球蛋白;(2)血漿中蛋白質的PI小于7.0，在PH8.6Buffer中解離成負離子，在電場中向正極移動。(3)在同一pH下所帶電荷量多少有差異，各蛋白質的分子大小與分子形狀也不相同，因而在同一電場中泳動速度不同。6精品醫(yī)學ppt染色劑

一般蛋白質染色常使用氨基黑、考馬斯亮藍、麗春紅糖蛋白用甲苯胺藍或過碘酸-Schiff試劑脂蛋白則用蘇丹黑或品紅亞硫酸染色

7精品醫(yī)學ppt白蛋白a1-球蛋白a2-球蛋白β-球蛋白γ－球蛋白醋酸纖維薄膜法顯示血清蛋白質從陽極端起依次為白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、β-球蛋白和γ－球蛋白五條區(qū)帶。8精品醫(yī)學ppt定量

與蛋白質結合的染料可溶解于堿液，溶液顏色深淺與蛋白質量呈正比比色法比較各蛋白質條帶溶于堿后的溶液顏色，可計算出各種蛋白質所占的百分比9精品醫(yī)學ppt計算

OD總和T＝A+α1+α2+β+γ白蛋白％＝A/T×100％α1球蛋白％＝α1/T×100％α2球蛋白％＝α2/T×100％β球蛋白％＝β/T×100％γ球蛋白％＝γ/T×100％10精品醫(yī)學ppt操作1、準備（1）電泳儀的準備（2）薄膜的準備：在薄膜無光澤面標記點樣位置將薄膜置于巴比妥緩沖液中浸泡11精品醫(yī)學ppt2、點樣（1）無光澤面朝上，吸去多余Buffer,（2）用蓋玻片蘸取少量血漿，垂直印在劃線處。注意：不能超出邊緣；不能重復點樣；必須與邊緣平行要適量、均勻和垂直，并避免弄破薄膜。12精品醫(yī)學ppt3、平衡：無光澤面朝下，點樣側位于陰極（5min)4、電泳：打開電源，U＝160V或I＝1.6mAt=45－50min；冬季1小時5、染色：氨基黑10B染色充分，5－10min6、漂洗：3－4個漂洗皿，洗去染料至背景無色。13精品醫(yī)學ppt臨床意義血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分，含量為60～80g/L，絕大部分由肝臟合成，僅γ球蛋白由漿細胞合成

正常值： 白蛋白57％—72％α1球蛋白2％—5％α2球蛋白4％—9％β球蛋白6.5％—12％γ球蛋白12％—20％

14精品醫(yī)學ppt血漿蛋白的主要功能

維持血漿膠體滲透壓調節(jié)血漿pH值，維持酸堿平衡運輸營養(yǎng)物質、代謝物、激素、藥物及金屬離子等免疫作用

15精品醫(yī)學ppt肝炎：白蛋白、a1-球蛋白、a2-球蛋白、β-球蛋白下降，γ－球蛋白升高肝