大家好1流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024流式細胞術(shù)實驗方法及應用2流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024科研型分選功能激光四色熒光(、、、）3流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024一、流式細胞術(shù)的原理流式細胞儀的發(fā)展起源于細胞計數(shù)自動化的研究。其原理是被熒光染色的單細胞或顆粒，經(jīng)過高速的液流系統(tǒng)形成細胞柱，排列成單細胞依次通過流動室，在激光照射區(qū)域，攜帶熒光素細胞受激發(fā)產(chǎn)生不同的熒光信號，這些熒光信號可以反映細胞的生物特性。4流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024前向散射激光5流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024的液流系統(tǒng)（如何形成單個細胞流）樣本管鞘液管6流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024

近年來流式細胞術(shù)在我國得到很快的發(fā)展，應用范圍不斷增大。目前，流式細胞術(shù)作為一門生物檢測技術(shù)廣泛應用于免疫學、血液學、腫瘤學、細胞遺傳學、細胞生物學、生物化學等臨床醫(yī)學和基礎(chǔ)醫(yī)學研究領(lǐng)域。7流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024速度快極短時間內(nèi)可分析大量細胞，每秒可檢測上萬個細胞，甚至幾萬個細胞。多參數(shù)分析可同時分析單個細胞的多種特性，獲得單個細胞多種信息，也可以根據(jù)其細胞表面標志的不同把細胞群分為各亞群。二、流式細胞術(shù)的特點、優(yōu)點8流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024定性、定量分析細胞通過熒光染色對單細胞的某些成分，如：、抗原或受體等進行定性、定量分析。靈敏度高熒光能檢測到單個微粒上標有熒光分子少于<個(如或)；前向角檢測到小于顆粒。分選感興趣的細胞純度達，收獲率可達。9流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024流式細胞術(shù)的應用范圍細胞大小細胞表面分子系列細胞漿內(nèi)分子：胞內(nèi)細胞因子細胞核內(nèi)分子：細胞功能檢測:細胞周期、細胞凋亡其他：線粒體膜電位、細胞內(nèi)鈣離子濃度10流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024常用熒光素激發(fā)光波長（）發(fā)射波長()異硫氰酸（）

（綠）藻紅蛋白（）

（橙）碘化丙啶（）

（紅）藻紅蛋白偶聯(lián)物（）

（紅）藻紅蛋白偶聯(lián)物（）

（紅外）別藻青蛋白（）

（紅）別藻青蛋白偶聯(lián)物（）（紅外）三、單克隆抗體標記熒光探針選擇.了解激發(fā)光波長和發(fā)射波長11流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024

.要有高的光子產(chǎn)量提高信號強度。.對激光有強的吸收降低背景噪音。.激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之間差距大減少干擾。.易與被標記的物質(zhì)結(jié)合，而不影響被標記物的特異性。.穩(wěn)定性好，不易受光、溫度、標本抗凝劑和固定劑等影響。12流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024細胞表型分析：雙色分析：與三色分析：雙色分析四色分析：三色分析含量分析：凋亡與壞死分析：凋亡用雙染常用熒光探針組合13流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024四、標本的收集、單細胞懸液的制備骨髓、外周血、細胞株、組織器官、胸水、腹水、尿液脫落細胞等

14流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024、骨髓及外周血細胞單細胞懸液的制備

骨髓及外周血都是天然的單個細胞，可直接標記，再溶血。單細胞的分離制備分離液血液生理鹽水離心，單個核細胞15流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024單核細胞:利用單核細胞在短時培養(yǎng)貼壁快的特性（），可采用短時培養(yǎng)獲得較純的單核細胞.16流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024、培養(yǎng)細胞樣品的制備(貼壁細胞)培養(yǎng)板吸去培養(yǎng)液洗次胰蛋白酶℃，室溫，含血清的培養(yǎng)基吹打洗次單細胞懸液。17流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024.組織器官單細胞懸液的制備酶消化法

組織器官單細胞制備儀剪碎法機械法網(wǎng)搓法研磨法

18流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024（）、酶消化法組織塊洗去血液剪成小塊胰蛋白酶℃，含血清的培養(yǎng)基目鋼篩網(wǎng)過濾目尼龍網(wǎng)過濾離心，洗次單細胞懸液。19流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024（）、機械法單細胞制備儀組織塊洗去血液剪成小塊制備儀目鋼篩網(wǎng)過濾目尼龍網(wǎng)過濾離心，洗次單細胞懸液。剪碎法組織塊洗去血液剪至漿狀吸管輕輕吹打目鋼篩網(wǎng)過濾目尼龍網(wǎng)過濾離心，洗次單細胞懸液。

20流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024

網(wǎng)搓法組織塊洗去血液目鋼篩網(wǎng)輕搓生理鹽水收集濾液目尼龍網(wǎng)過濾離心，洗次單細胞懸液。研磨法組織塊洗去血液研磨器研至勻漿目鋼篩網(wǎng)目尼龍網(wǎng)過濾離心，洗次單細胞懸液。21流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024.石蠟包埋組織單細胞懸液的制備

醇乙脫水：

％→→％→→醇乙→二甲苯→石蠟包埋

脫蠟水化：

二甲苯脫蠟→％醇乙→→→％→％→蒸餾水手術(shù)獲得的新鮮實體組織，常要送病理石蠟包埋處理，這些標本也可用于流式細胞術(shù)的檢測。22流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024石蠟包埋組織制備

單細胞懸液石蠟包埋組織切片二甲苯脫蠟天水化乙醇，蒸餾水組織器官胰蛋白酶℃，冰目鋼篩網(wǎng)過濾目尼龍網(wǎng)過濾離心，洗次單細胞懸液23流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024.脫落細胞單細胞懸液的制備包括：尿液脫落細胞胸水、腹水脫落細胞沖洗液脫落細胞

24流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024收集胸水、腹水、尿液、沖洗液置℃冰箱中沉淀取底部洗次目尼龍濾網(wǎng)過濾單細胞懸液收集方法、沉淀時間胸水、腹水：胸、腹水，加入肝素液，置于℃冰箱中靜置尿液：收集尿液，置℃冰箱中自然沉淀沖洗液：生理鹽水沖洗膀胱，冰箱內(nèi)置

25流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024五、熒光標記主要包括間接免疫熒光染色和直接免疫熒光染色兩種方法。間接標記是采用特異的無熒光標記的一抗與待測標本反應后，洗去未結(jié)合抗體再加入熒光標記的二抗，形成有熒光的抗原抗體抗體復合物。其操作復雜、費時，目前很少用。在科研中需要一些新的抗體沒有直接抗體，只能采用此方法。直接標記是在標記時加入連接著熒光素的特異性抗體，該方法簡單，目前廣泛應用于各實驗室。羊抗兔兔抗小鼠小鼠直標間標26流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024

根據(jù)細胞部位的不同，可分為細胞表面和細胞內(nèi)抗原染色，細胞內(nèi)標記需要固定、破膜等步驟.細胞表面抗原的標記法（外周血為例）全血（×）相應抗體→避光孵育→溶血素→室溫→洗次→上機分析（多聚甲醛固定）。27流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024.細胞漿或核內(nèi)抗原標記法收集單細胞懸(×)固定劑室溫，洗滌去固定液破膜劑及抗體室溫，洗滌次上機分析（多聚甲醛固定）。.細胞表面和細胞內(nèi)抗原同時標記在流式分析中通常需要細胞膜表面和細胞內(nèi)同時標記，首先標記表面抗原，然后再對細胞膜和核膜進行固定破膜后再標記胞內(nèi)或核內(nèi)抗原。常見細胞破膜劑：皂角素、曲拉通()、乙醇、商品化固定破膜劑（、）。28流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024、空白對照用緩沖液（）代替單克隆抗體進行實驗、陽性染色對照用現(xiàn)有試劑和方法檢測已知表達某種特異性抗原的細胞即為陽性細胞。如檢測血小板時，可用被誘導活化血小板作為檢測的陽性對照細胞。六、熒光染色對照設(shè)置(空白對照、陽性對照、陰性對照、

同型對照)29流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024.陰性染色對照已知不表達某種抗原的細胞即為陰性細胞群，如雙染檢測健康人血液淋巴細胞亞群時，應有一群不表達這兩種抗原的雙陰性細胞群（主要是細胞），可作陰性對照。.同型對照與染色的單克隆抗體特異性無關(guān)的免疫球蛋白亞型，如、30流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024七、熒光補償流式細胞分析中常需要兩種或兩種以上不同熒光素標記的單克隆抗體進行多色分析。由于目前使用的各種熒光染料都是寬發(fā)射光譜性質(zhì)，發(fā)射光譜范圍有一定的重疊，出現(xiàn)結(jié)果誤差，克服這種誤差的有效方法就是使用熒光補償。31流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/202432流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/202433流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024八、數(shù)據(jù)分析流式細胞術(shù)的目的是對我們感興趣的細胞進行分析，其中設(shè)門技術(shù)是流式細胞數(shù)據(jù)分析中最為獨特的技術(shù)，是指在細胞分布圖中指定一個范圍或一片區(qū)域（門），對其中的細胞進行單參數(shù)或多參數(shù)分析。設(shè)門包括線性門、矩形門、圓形門、多邊形門、任意門和四象門等。任意門、矩形門線性門四象門34流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024多重邏輯門：當一種細胞有兩種以上的參數(shù)需要被分析時，常需要設(shè)多個門，各門之間由此出現(xiàn)邏輯關(guān)系，此種設(shè)門技術(shù)稱為多重邏輯門或聯(lián)合門。淋巴細胞淋巴細胞（）（）35流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024數(shù)據(jù)顯示采用的圖:散點圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為單參數(shù)直方圖和雙參數(shù)散點圖。36流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024參數(shù)的意義:的強度與細胞的大小有關(guān)，也就是說，細胞越大，散射光越強，細胞越小,散射光越弱;對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，可反映細胞顆粒性程度大小。單參數(shù)直方圖軸代表熒光或散射光的強度，軸代該道所具有相同光信號細胞的頻率或相對的細胞數(shù)；雙參數(shù)散點圖軸和軸均代表散射光或熒光的強度.37流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024

九、流式細胞術(shù)的應用及標記方法

38流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024、含量分析意義：腫瘤的早期診斷，腫瘤的良惡性判斷，觀察細胞的增殖狀態(tài)及細胞周期分布。正常生物細胞，含量隨著細胞增殖周期時相而發(fā)生變化。即期（）、期（→）期（）。→39流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024進行細胞周期含量分析時，需要對進行染色，染料（）與結(jié)合具有特異性，有一定量效關(guān)系，即含量的多少與熒光染料的結(jié)合量成正比，熒光強度與吸收熒光分子多少成正比。分析一個細胞群周期與倍體時，將含量直方圖分為三部分，即、、三個細胞峰。()()

(→)()40流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024方法：細胞懸液（*）冰乙醇o，離心去固定液洗次洗次避光上機采集細胞，軟件進行細胞周期分析()

(→)()41流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024當人體癌變或者具有惡性潛能的癌前病變時，在其發(fā)生、發(fā)展過程中可伴隨有細胞倍體及期的改變（異倍體）惡性腫瘤細胞增殖周期的判斷：>、>或>、>42流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024白細胞分化抗原（分子）的命名：年世界衛(wèi)生組織和國際免疫學會聯(lián)合會，將所有抗體根據(jù)白細胞分化抗原反應性的類型劃分為群，把每一群抗體稱為一個分化抗體群(，)，進行編號、命名，即為單克隆抗體的國際命名法。由抗體群識別的分化抗原就稱為分子。目前已有個分化抗體群被鑒定并命名、淋巴細胞亞群分析43流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024流式細胞結(jié)合單克隆抗體技術(shù)能準確分類計數(shù)淋巴細胞亞群，被認為是血液中淋巴細胞免疫表型分析的標準方法。血液淋巴細胞是一群特異性極強的細胞，根據(jù)淋巴細胞的功能及膜表面標志，主要分為淋巴細胞()、淋巴細胞()、細胞()三個亞群。44流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024淋巴細胞（）淋巴細胞淋巴細胞（）細胞（）45流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024細胞:()淋巴細胞:（）（）（）46流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024相應抗體避光孵育加溶血素室溫洗一次上機分析抗體:三標抗體二標抗體二標抗體同型對照外周血淋巴細胞亞群標記方法（表面標記）47流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024淋巴細胞亞群檢測臨床意義：、、總數(shù)降低：細胞免疫功能低下（）降低或()升高：、病毒感染、惡性腫瘤（復發(fā)或轉(zhuǎn)移）、再生障礙性貧血等()升高或()降低：自身免疫性疾、多發(fā)性硬化病、自身免疫性溶血性貧血細胞減少：見于免疫球蛋白缺乏癥、胸腺發(fā)育不良、嚴重免疫缺陷病。48流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024[()]活性低下：腫瘤、白血病、自身免疫病、免疫缺陷病等[()]活性增高：多發(fā)性骨髓瘤、骨髓移植感染、感染性疾病（病毒、皰疹病毒、肺）、習慣性流產(chǎn)等細胞減少：體液免疫抑制細胞增高：細胞惡性增殖性疾?。ò籽。?9流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024作為白血病輔助診斷，免疫分型是急白血病診斷的關(guān)鍵技術(shù)。利用不同類型的白血病具有不同抗原表達的特異性進行分型：髓系、淋巴系、淋巴系、非系列特異性等。標記方法：往往需要胞漿和胞膜同時標記，一線抗體包括：胞漿（髓系，淋巴系,淋巴系）,胞膜(髓系、，淋巴系、,淋巴系、)等、白血病免疫分型50流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024采用和側(cè)向散射(）設(shè)門技術(shù)可將各細胞群分開，熒光從強大到弱：淋巴細胞群>單核細胞>成熟粒細胞>原幼細胞(白血病細胞)，而成熟的紅細胞和血小板不表達。51流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024正常骨髓流式細胞分布圖52流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024各系表達的抗原造血干細胞：、髓系表達：、、巨核細胞：、細胞系：、、細胞系：、、、細胞:、、53流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024細胞因子（）主要由免疫細胞產(chǎn)生，也可由非免疫細胞如內(nèi)皮細胞、成纖維細胞等產(chǎn)生。一種細胞可產(chǎn)生多種，一種也可由多種細胞產(chǎn)生。細胞因子分為類：白細胞介素（）；干擾素（）；造血生長因子；腫瘤壞死因子（）。、細胞因子的檢測54流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024血液中未活化的白細胞內(nèi)無或僅極小量細胞因子，當其被各種激活劑活化后，細胞內(nèi)細胞因子合成增加并不斷分泌到細胞外而發(fā)揮作用。因此，要測定細胞內(nèi)的細胞因子較為困難。通常應用刺激劑（如：佛波脂）來刺激細胞因子分泌，同時加入一定濃度的細胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑（如：莫能霉素），使細胞因子合成后累積在細胞內(nèi)，通過細胞因子特異的單克隆抗體進行細胞內(nèi)熒光染色，并結(jié)合膜表面抗原染色，進行多色分析各種細胞內(nèi)合成的細胞因子。55流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/202456流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024全血或單細胞刺激素(佛波脂)和阻斷劑(莫能霉素)℃培養(yǎng)加入細胞表面抗體(如、)孵育洗次加固定破膜劑室溫加入和抗體孵育洗兩次。細胞因子檢測（，）：57流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024結(jié)果分析：運用流式設(shè)門技術(shù)，先利用前向散射（）和側(cè)向散射（）圈出淋巴細胞，再用和設(shè)門圈出淋巴細胞，再用設(shè)門選定淋巴細胞亞群，再分析和淋巴細胞淋巴細胞（）（）58流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024檢測是高特異性熒光指示劑，能與特異結(jié)合。它本身是親水性，不易透過膜的，依賴其脂溶性（乙酰氧甲基），酯化后就容易跨過質(zhì)膜進入胞漿，在胞內(nèi)酯酶的作用下，脫去重新生成親水性形式，一方面不能再進入細胞器，另一方面易于在胞內(nèi)擴散，與游離鈣離子結(jié)合，通過檢測其熒光強度可反映出細胞內(nèi)游離濃度的變化。單細胞懸液o避光孵育洗次上機檢測、細胞內(nèi)濃度

超載是細胞損傷的重要標志，導致降解，促使細胞凋亡。59流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024、線粒體膜電位線粒體膜電位（）是線粒體功能的重要參數(shù)，是評價線粒體功能的敏感指標，它的大小直接反映線粒體功能及數(shù)量，下降，其氧化磷酸化功能障礙，使產(chǎn)生減少，導致細胞凋亡和壞死。60流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024（羅丹明）、、等多種親脂性的陽離子熒光素都能被流式細胞分析用于作為檢測的探針。這些親脂性熒光染料，對膜具有通透性，另外線粒體內(nèi)外膜之間存在著跨膜電位，線粒體內(nèi)膜的內(nèi)側(cè)帶負電荷，當它們與活細胞一起培養(yǎng)時，這些陽離子熒光素進入細胞內(nèi)就能特異地聚集于線粒體，其攝入量與線粒體膜電位成正比。檢測原理及方法：61流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024當降低后，線粒體內(nèi)的熒光素會發(fā)生外漏，在細胞內(nèi)熒光強度降低。檢測其熒光強度能反映線粒體數(shù)量和的降低或喪失。操作：單細胞懸液（*）的o洗兩次上機檢測62流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024細胞凋亡是細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序結(jié)束其生命的過程。細胞凋亡為一種可調(diào)控的、主動的細胞死亡過程，有很多的促進或抑制凋亡的調(diào)控途徑存在，因而就可以人為地誘導或抑制某些細胞的凋亡，從而達到防病、治病的目的。、檢測細胞凋亡63流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024半胱氨酸蛋白酶（）以無活性的酶原形式存在細胞內(nèi)，需被水解加工后才能成為有活性的片段?；罨倪M一步激活其他的前體，形成了級聯(lián)放大切割過程，是直接導致凋亡細胞解體的蛋白酶系統(tǒng)，目前已發(fā)現(xiàn)個家族成員，分別命名為。在家族成員中，是最重要的指示蛋白酶。（）家族64流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024操作：單細胞懸液（*）固定和破膜劑冰浴洗兩次單抗室溫孵育洗次加上機檢測。65流式細胞術(shù)實驗方法及應用5/9/2024細胞凋亡過程中有多種基因蛋白參與調(diào)控。凋亡相關(guān)基因可分兩類：誘導凋亡基因和抗凋亡基因。主要有家族、、基因家族等?？沟蛲龌?、、等促凋亡基因、、等染色標記同（）凋亡相關(guān)基因蛋白66流式細胞術(shù)實驗方法及應用