45DB45/T2804—2023獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病PCR診斷技術(shù)規(guī)程Technicalcodeondiagnosisofbacterialcankerdiseaseofkiwifruitby2023-12-26發(fā)布2024-02-01實(shí)施廣西壯族自治區(qū)市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布I本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)1本文件確立了獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病PCR診斷技術(shù)的程序，給出了縮略語(yǔ)、診斷原理，規(guī)定了樣品采本文件適用于廣西壯族自治區(qū)行政區(qū)域內(nèi)獼猴桃屬植物感染獼猴桃細(xì)菌性潰瘍2規(guī)范性引用文件獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病bacterialcankerdiseaseofkiwifrubp：堿基對(duì)DNA：脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleicacid）PCR：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymerTaq酶：TaqDNA聚合酶（Taqenzyme）pH：氫離子濃度指數(shù)（Hydrogenionconcentrati利用獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌DNA特異性擴(kuò)增引物，在熱穩(wěn)定DNA聚合酶的作用下，合成大量目標(biāo)DNA片段，最終通過(guò)凝膠電泳分離檢測(cè)出特定大小的獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌特異性DNA譜帶，根據(jù)該譜帶的26.1.1采有典型和疑似癥狀的植株葉片樣品（參見(jiàn)1234567PCR緩沖液[×10，含15mMMg2+]89DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)（DNAmaker，可區(qū)分100bp～31PCR擴(kuò)增儀23456789PCR反應(yīng)管采集的樣品經(jīng)處理后，在2℃~8℃條件下保存應(yīng)不超過(guò)2周，若需長(zhǎng)期保存，應(yīng)置于-70采用商用植物基因組DNA提取試劑盒（推薦使用按照其操作步驟和方法提取樣品總DNA，或者選用其他能達(dá)到PCR擴(kuò)增質(zhì)量要求的方法提取樣品總DNA，4），束后，將瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存，正向引物5’-CAGAGGCGCTAACGAGG1-2PCR緩沖液[×10]11-按表3，依次向PCR反應(yīng)管中加入超純水、dNTPs、PCR緩檢測(cè)時(shí)設(shè)置空白對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照（獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌基因組DNA）和陰性對(duì)照（健康獼猴桃植分子量作為片段大小的標(biāo)準(zhǔn)，在120V電壓下電泳約60min。5電泳結(jié)束后，將瓊脂糖凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中拍照保存8診斷后樣品處理DNA提取液放置于-20℃以下，以備復(fù)檢。用于獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病菌檢測(cè)的植物樣品、用具，以6A.1葉片癥狀特征葉片發(fā)病時(shí)在新生葉片上呈現(xiàn)褪綠小點(diǎn)，水浸狀，后發(fā)展為1mm～3mm的不規(guī)則形或多角形褐色病葉片病斑呈暗紫色或暗褐色，容易脫落。癥狀特征A.2枝干癥狀特征的枝干壞死，也會(huì)向下部擴(kuò)展導(dǎo)致地上部分枯死或整株死亡。癥狀特征見(jiàn)圖A7定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH為8.0，高溫滅菌），8