第51講基因工程的基本工具和基本操作程序【課標(biāo)要求】1.闡明重組DNA技術(shù)的實(shí)現(xiàn)須要利用限制性內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶和載體三種基本工具。2.闡明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的篩選與獲得、基因表達(dá)載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞和目的基因的檢測(cè)與鑒定等步驟。3.活動(dòng)：（1）DNA的粗提取與鑒定。（2）DNA片段的擴(kuò)增及電泳鑒定?？键c(diǎn)一重組DNA技術(shù)的基本工具1.基因工程的概念2.重組DNA技術(shù)的基本工具（1）限制性內(nèi)切核酸酶（簡(jiǎn)稱限制酶）。①主要來(lái)源：。②種類：分別的限制酶有種。③特點(diǎn)（專一性）：識(shí)別雙鏈DNA分子的。使每一條鏈中特定部位的斷開(kāi)。④[易錯(cuò)提示]限制酶作用的化學(xué)鍵是磷酸二酯鍵，不是氫鍵；在切割含目的基因的DNA分子時(shí)，需用限制酶切割2次此DNA分子，產(chǎn)生4個(gè)末端。（2）DNA連接酶。（3）載體。[易錯(cuò)提示]與膜載體的區(qū)分：基因工程中的載體是DNA分子，能將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞內(nèi)，并利用它在宿主細(xì)胞內(nèi)對(duì)目的基因進(jìn)行大量復(fù)制；膜載體是蛋白質(zhì)，與細(xì)胞膜的通透性有關(guān)。[答案自填]1.DNA分子轉(zhuǎn)基因遺傳特性生物類型基因重組2.（1）①原核生物②數(shù)千③特定核苷酸序列磷酸二酯鍵（2）磷酸二酯鍵大腸桿菌黏性末端黏性末端和平末端（3）環(huán)狀雙鏈DNA分子噬菌體、動(dòng)植物病毒一個(gè)至多個(gè)自我復(fù)制受體DNA標(biāo)記[教材命題點(diǎn)思索]1.自然的DNA分子是否可以干脆用作基因工程載體？為什么？提示：不行以。含有復(fù)制原點(diǎn)、含有一種或多種限制酶的識(shí)別序列、有標(biāo)記基因等特點(diǎn)的DNA分子才可以干脆用作基因工程的載體。事實(shí)上，自然的DNA分子一般不完全具備上述條件，往往須要進(jìn)行人工改造后才能用于基因工程操作。2.實(shí)踐中常用某些病毒載體作為基因工程工具，除具備一般質(zhì)粒載體的條件外，還應(yīng)具有的條件是______________________________（答出2點(diǎn)即可）。提示：對(duì)靶細(xì)胞具有較高的轉(zhuǎn)化效率、不能增殖、對(duì)細(xì)胞無(wú)害3.限制酶EcoRⅠ只能識(shí)別序列—GAATTC—，并只能在G與A之間切割。若在某目的基因的兩側(cè)各有1個(gè)EcoRⅠ的切點(diǎn)，請(qǐng)畫(huà)出目的基因兩側(cè)被限制酶EcoRⅠ切割后所形成的黏性末端。提示：—GAATTC……GAATTC——CTTAAG……CTTAAG—目的基因1.限制酶的選擇原則（1）依據(jù)目的基因兩端的限制酶切割位點(diǎn)確定限制酶的種類。①應(yīng)選擇切割位點(diǎn)位于目的基因兩端的限制酶，以便將目的基因“切出”，如圖可選擇PstⅠ。②不能選擇切割位點(diǎn)位于目的基因內(nèi)部的限制酶，防止破壞目的基因，如圖不能選擇SmaⅠ。③為避開(kāi)目的基因和質(zhì)粒的自身環(huán)化和隨意連接，也可運(yùn)用不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒，如圖可選擇用PstⅠ和EcoRⅠ兩種限制酶（但要確保質(zhì)粒上也有這兩種限制酶的切割位點(diǎn)，而且這兩種限制酶切割后不會(huì)完全破壞標(biāo)記基因）。（2）依據(jù)質(zhì)粒的特點(diǎn)確定限制酶的種類。（3）依據(jù)Ti質(zhì)粒的T-DNA片段選擇限制酶，圖中甲、乙、丁Ti質(zhì)粒均不宜選取，丙Ti質(zhì)粒宜選?。ㄔO(shè)切割目的基因的限制酶為XbaⅠ和SacⅠ）。2.標(biāo)記基因的作用可用于檢測(cè)目的基因是否導(dǎo)入受體細(xì)胞。1.（2024·高考新課標(biāo)卷）某同學(xué)擬用限制酶（酶1、酶2、酶3和酶4）、DNA連接酶為工具，將目的基因（兩端含相應(yīng)限制酶的識(shí)別序列和切割位點(diǎn)）和質(zhì)粒進(jìn)行切割、連接，以構(gòu)建重組表達(dá)載體。限制酶的切割位點(diǎn)如圖所示。下列重組表達(dá)載體構(gòu)建方案合理且效率最高的是（）A．質(zhì)粒和目的基因都用酶3切割，用E.coliDNA連接酶連接B．質(zhì)粒用酶3切割，目的基因用酶1切割，用T4DNA連接酶連接C．質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4DNA連接酶連接D．質(zhì)粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA連接酶連接解析：選C。只用一種限制酶切割質(zhì)粒和目的基因，會(huì)使質(zhì)粒和目的基因發(fā)生自身環(huán)化或使目的基因在質(zhì)粒中反向連接，A項(xiàng)不符合題意；用酶1切割目的基因，產(chǎn)生的是黏性末端，用酶3切割質(zhì)粒，產(chǎn)生的是平末端，無(wú)法連接，B項(xiàng)不符合題意；質(zhì)粒和目的基因都用酶1和酶2切割后，可運(yùn)用T4DNA連接酶連接，使目的基因定向插入質(zhì)粒中，C項(xiàng)符合題意；酶2和酶4切割后產(chǎn)生的黏性末端相同，易導(dǎo)致目的基因和質(zhì)粒自身環(huán)化或使目的基因在質(zhì)粒中反向連接，并且用酶4切割會(huì)破壞標(biāo)記基因，D項(xiàng)不符合題意。2.圖1是某基因工程中構(gòu)建重組質(zhì)粒的過(guò)程示意圖，載體質(zhì)粒P0具有四環(huán)素抗性基因（TetR）和氨芐青霉素抗性基因（AmpR）。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：（1）EcoRⅤ酶切位點(diǎn)為，EcoRⅤ酶切出來(lái)的線性載體P1為末端。（2）用TaqDNA聚合酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得的目的基因片段，其兩端各自帶有一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸。載體P1用酶處理，在兩端各添加了一個(gè)堿基為的脫氧核苷酸，形成P2；P2和目的基因片段在酶作用下，形成重組質(zhì)粒P3。（3）為篩選出含有重組質(zhì)粒P3的菌落，接受含有不同抗生素的平板進(jìn)行篩選，得到A、B、C三類菌落，其生長(zhǎng)狀況見(jiàn)下表（“＋”代表生長(zhǎng)，“－”代表不生長(zhǎng)）。依據(jù)表中結(jié)果推斷，應(yīng)選擇的菌落是（填表中字母）類，另外兩類菌落質(zhì)粒導(dǎo)入狀況分別是、。平板類型菌落類型ABC無(wú)抗生素＋＋＋氨芐青霉素＋＋－四環(huán)素＋－－氨芐青霉素＋四環(huán)素＋－－（4）為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖2所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物，結(jié)果從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400bp片段，緣由是___________________________________________________。解析：（1）由題圖可知，EcoRⅤ酶切出來(lái)的載體質(zhì)粒為平末端。（2）由題圖可知，目的基因的兩端各有一個(gè)游離的腺嘌呤脫氧核苷酸，由于載體P1為平末端，所以載體P1的兩端應(yīng)當(dāng)各添加一個(gè)胸腺嘧啶脫氧核苷酸，這樣在DNA連接酶的作用下才能把目的基因和載體P1連接起來(lái)。（3）由題圖可知，構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)四環(huán)素抗性基因被破壞，所以導(dǎo)入目的基因的菌落只能在沒(méi)有抗生素或含有氨芐青霉素的培育基中存活，故應(yīng)當(dāng)選B類菌落。A類菌落能在題表中條件下存活，說(shuō)明導(dǎo)入的是P0質(zhì)粒。C類菌落只能在無(wú)抗生素的培育基中存活，說(shuō)明C類菌落沒(méi)有導(dǎo)入質(zhì)粒。（4）據(jù)題圖分析，目的基因的外側(cè)鏈只能用丙作引物，內(nèi)側(cè)鏈可用甲、乙作引物。假如用甲、丙作引物，則無(wú)論目的基因是否插入正確，都能通過(guò)PCR擴(kuò)增大量目的基因，假如用乙、丙作為引物，當(dāng)目的基因插入不正確（反向插入）時(shí)，乙、丙兩引物都結(jié)