國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局發(fā)布國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)I Ⅲ IV 12規(guī)范性引用文件 1 1 4 55.1標(biāo)本采集 55.2新鮮組織運(yùn)送要求 6 7 7 7 7 96.5RNA的分離 9 附錄A(資料性)檢驗(yàn)前變量對(duì)從常規(guī)手術(shù)期間和之后收集的冷凍肝組織樣品獲得的RNA譜的影響 A.1在缺血條件下鑒定的穩(wěn)定和不穩(wěn)定基因的比較 A.2基于結(jié)果的建議 Ⅲ本文件是GB/T42080《分子體外診斷檢驗(yàn)冷凍組織檢驗(yàn)前過(guò)程的規(guī)范》的第1部分。本文件等同采用ISO20184-1:2018《分子體外診斷檢驗(yàn)冷凍組織檢驗(yàn)前過(guò)程的規(guī)范第1部 1GB/T42080.1—2022/ISO冷凍組織檢驗(yàn)前過(guò)程的規(guī)范第1部分：分離RNAGB/T22576.1—2018醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的要求第1部分：通用要求(ISO15189:2012,ISO15189醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量和能力的要求(Medicallaboratories—Requirementsforquality2GB/T42080.1—2022/ISO術(shù)語(yǔ)]34確認(rèn)validation驗(yàn)證verification4通則參見(jiàn)GB/T22576.1—2018中4.2備、試劑和消耗品的要求應(yīng)遵循GB/T22576.1—2018中5.3的要求；GB/T22576.1—2018中和或GB/T27020—2016中6.2也能適用。物分子穩(wěn)定性和樣品貯存條件。應(yīng)記錄不能完全控制的工作流程步驟(例如熱缺血),并進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估性能的損害(例如進(jìn)行時(shí)間進(jìn)程試驗(yàn)或研究。參見(jiàn)附錄A)。5關(guān)于運(yùn)送和處理的安全說(shuō)明應(yīng)符合GB/T22576.1—2018中5.2.3和5.4.5,以及ISO15190的另參見(jiàn)GB/T22576.1—2018中5.4.4。文件記錄應(yīng)包括標(biāo)本供體/患者身份信息(ID),能用代碼形式。別等);a)通過(guò)記錄缺血相關(guān)的血管結(jié)扎/夾閉時(shí)間點(diǎn)(通常為動(dòng)脈夾閉時(shí)間)來(lái)表示體內(nèi)缺血開(kāi)始(熱缺血);如果在實(shí)驗(yàn)室外進(jìn)行組織冷凍，則應(yīng)記錄6.2中描述的步驟，需要進(jìn)行病理評(píng)估時(shí)，應(yīng)執(zhí)行6.3文件記錄還宜包括標(biāo)本采集人員身份信息(ID)。需要冷凍用于診斷目的的組織可能來(lái)自大的組織標(biāo)本，也可能來(lái)自像活檢這類小的組織標(biāo)本(例如通過(guò)內(nèi)窺鏡檢查獲取的標(biāo)本，或者在需要快速冷凍切片診斷的外科手術(shù)過(guò)程中從患者身上取出6GB/T42080.1—2022/ISO20184-1:2018見(jiàn)6.2)。如果在沒(méi)有病理診斷要求的情況下取出標(biāo)本，評(píng)估標(biāo)本的選擇和記錄可由病理學(xué)家以外的其他有a)如果標(biāo)本或樣品在實(shí)驗(yàn)室外冷凍，立即b)如果標(biāo)本或樣品在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)冷凍，則需要將新鮮的組織標(biāo)本運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。應(yīng)立即執(zhí)行5.2c)容器的標(biāo)記(例如注冊(cè)號(hào)、條形碼、標(biāo)本類型、數(shù)量和等級(jí)、來(lái)源的器官組織)和其他文件標(biāo)本從身體移除后宜立即轉(zhuǎn)移到容器中。然后宜將容器保存在冰上或2℃~8℃條件下，以減少RNA譜變化。度范圍宜按環(huán)境溫度、室溫或2℃~8℃估算。如果標(biāo)本尚未冷凍，宜立即置于冰上或維持溫度在2℃~8℃情況下進(jìn)行即時(shí)運(yùn)送，以盡量減少RNA譜的變化。7GB/T42080.1—2022/ISO20184-1:2018標(biāo)本病理學(xué)的評(píng)估和記錄以及從標(biāo)本中選擇用于進(jìn)一步處理的樣品應(yīng)由選擇用于RNA檢驗(yàn)的樣品。a)用于分子和組織病理學(xué)檢查以及可選的進(jìn)一步研究目的標(biāo)本的適當(dāng)部分的選擇應(yīng)由具有醫(yī)師資格的病理學(xué)家進(jìn)行或在其監(jiān)督下進(jìn)行，以確保收集樣品用于RNA檢查不會(huì)影響組織病理壞死部位。宜采取對(duì)組織進(jìn)行顯微切割以選擇或富集疾病的某在冷凍之前和/或之后對(duì)手術(shù)標(biāo)本進(jìn)行宏觀評(píng)估前，宜核對(duì)標(biāo)本的臨床信息(參見(jiàn)5.1.2和臨床信息和問(wèn)題相關(guān)聯(lián)。應(yīng)描述標(biāo)本中所示6.3.1應(yīng)立即冷凍標(biāo)本或樣品。宜選擇和使用標(biāo)本或樣品中關(guān)于預(yù)期用途和工作條件的最佳冷凍方烷(C?H??,也稱甲基丁烷或2-甲基丁烷)應(yīng)預(yù)冷，溫度范圍為>-160℃~-80℃,能用于急些設(shè)備可在控制或不控制冷卻速率的情況下使異戊烷保持在≤-80℃。異戊烷應(yīng)在管子或其他容器(例如玻璃燒杯)中冷卻，以抵抗大的和突然的溫度變化。預(yù)冷異戊烷的體積應(yīng)至少8GB/T42080.1—2022/ISO20184-1:2018在組織冷凍后，應(yīng)將其轉(zhuǎn)移到指定的預(yù)冷標(biāo)記的低溫小瓶中。應(yīng)按照制異戊烷在室溫和壓力下是極易揮發(fā)且極易燃的液體。因此，實(shí)驗(yàn)b)快速冷凍程序：組織應(yīng)在預(yù)先冷卻的金屬板或置于液氮表面的金屬籃上或干冰上快速冷凍。金屬表面應(yīng)預(yù)冷，溫度范圍為>-196℃~-80℃。能使用合適的支架和夾具將金屬板或金中冷凍。然而，緩慢的冷凍過(guò)程能導(dǎo)致膜破裂，因?yàn)辂}的濃度升高和晶體形成能嚴(yán)重影響形的選定部分應(yīng)冷凍到適當(dāng)?shù)睦鋬鼋橘|(zhì)中，安裝在低溫恒溫器上的專用金屬網(wǎng)格上。宜記錄使用的冷凍介質(zhì)。通過(guò)將金屬保持在液氮或干冰中直至組織冷凍來(lái)冷1)容器應(yīng)具有足夠的體積以容納標(biāo)本或樣品的尺寸貯存；2)容器應(yīng)經(jīng)過(guò)貯存溫度認(rèn)證；4)容器應(yīng)適合在冷凍貯存條件下進(jìn)行永久性標(biāo)記。e)標(biāo)簽應(yīng)適合各自的冷凍貯存條件。1)標(biāo)本供體/患者的ID,標(biāo)本/樣品唯一ID和采集標(biāo)本和/或樣品的日期，所有這些都可以是代碼的形式(每個(gè)標(biāo)本/樣品都是唯一的);2)組織類型，組織和疾病狀況影響(例如腫瘤)或未受影響，除非樣品跟蹤系統(tǒng)能將這些信息與1)中使用的標(biāo)本或樣品的識(shí)別信息相匹配；3)每個(gè)容器的唯一編號(hào)包括在1)中。資質(zhì)的病理醫(yī)師對(duì)分子檢驗(yàn)實(shí)際使用的組織樣品進(jìn)行評(píng)估分子檢驗(yàn)的組織標(biāo)本所反映的疾病特征(例如，不同的9GB/T42080.1—2022/ISOe)提取的RNA宜保存在冰上或2℃~8℃條件下(例如冷卻塊),并宜立即檢測(cè)。GB/T42080.1—2022/ISO20184-1:2018宜在RNA能力測(cè)試程序中測(cè)試RNA分離性能。使用不同制造商的產(chǎn)品可能影響結(jié)果，因?yàn)楫a(chǎn)品可能不兼容。只有在組6.6分離RNA的定性和定量評(píng)估宜根據(jù)診斷試劑盒制造商的說(shuō)明檢測(cè)RNA的數(shù)量和質(zhì)量，或者通過(guò)普遍接受的物理化學(xué)和生物微流體方法來(lái)確定質(zhì)量系數(shù)[例如RNA完整性數(shù)量(RIN),RNA質(zhì)量指標(biāo)(RQI)d)測(cè)試干擾物質(zhì)的存在[使用外源對(duì)照(摻入RNA和DNA對(duì)照)或檢查異常的qPCR反應(yīng)曲6.7分離RNA的貯存對(duì)于長(zhǎng)期貯存，宜對(duì)分離RNA進(jìn)行分裝以避免反復(fù)凍融或從其他歸檔系統(tǒng)重復(fù)解凍。不宜進(jìn)一對(duì)于少量RNA,宜使用具有減少管壁對(duì)核酸吸附的貯存容器。宜避免在長(zhǎng)期貯存期間由于水分蒸發(fā)而意外冷凍干燥的分離的RNA,因?yàn)镽NA能降解，并且從在長(zhǎng)期貯存期間水分蒸發(fā)。宜記錄貯存容器類型和蓋類型。對(duì)于長(zhǎng)期貯存，宜有一個(gè)經(jīng)過(guò)確認(rèn)的程序來(lái)組織和唯一標(biāo)記含有分離RNA或由其衍生的等分試GB/T42080.1—2022/ISO20184-1:20186.7.2使用商品化RNA分離試劑盒宜遵循RNA分離試劑盒提供者在檢查前貯存分離的RNA的具體說(shuō)明。如果檢查提供者的指示如果RNA分離試劑盒提供者或檢測(cè)提供者既沒(méi)有提供說(shuō)明，分離程序，宜立即檢測(cè)分離的細(xì)胞RNA,實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的程序說(shuō)明[包括適當(dāng)?shù)馁A存介質(zhì)(例如不含RNase的水)]如何在分析階段之前貯存分離的RNA。對(duì)于長(zhǎng)期貯存，宜在適當(dāng)?shù)木彌_液中洗脫分離的RNA,并在≤-70℃下貯存。其他經(jīng)過(guò)確認(rèn)的歸GB/T42080.1—2022/ISO20(資料性)識(shí)別RNA譜的變化。在常規(guī)肝臟手術(shù)期間和之后的不同時(shí)間點(diǎn)收集非惡性組織樣品，并在2-甲基丁提取RNA并進(jìn)行所有缺血樣品的微陣列檢查。選擇基因，其顯示由于檢驗(yàn)前測(cè)變異導(dǎo)致的RNARNA譜(參見(jiàn)圖A.1)相比較。這些不可預(yù)測(cè)的變化可能導(dǎo)致重大問(wèn)題，例如在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)和發(fā)GB/T42080.1—2022/ISO20184-1:2Y?——△cq圖A.1血條件下不同供體的穩(wěn)定RNA譜(A)的實(shí)例(續(xù))GB/T42080.1—2022/ISO20184-1:2018圖A.2血條件下不同供體的不穩(wěn)定RNA譜(B)的實(shí)例GB/T42080.1—2022/ISO20184-1:2018雖然平均8量化周期(△cq值)在RNA察到，其中一些在腫瘤發(fā)生過(guò)程中起作用(數(shù)據(jù)未顯示)。許多變量可能在外科手術(shù)過(guò)程中影響RNA體捐贈(zèng)者的遺傳背景也可能很重要。由于這些變量無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化或避免，因此必這些參數(shù)能用于關(guān)聯(lián)檢查中的后期發(fā)現(xiàn)或以可疑影響參數(shù)相同的方式選擇標(biāo)本。通過(guò)這種方式，群組能適用于非常敏感的測(cè)試，這些測(cè)試涉及已知在獲取前階段不穩(wěn)定的基因GB/T42080.1—2022/ISO[2]GB/T19000—2016質(zhì)量管理體系基礎(chǔ)和術(shù)語(yǔ)[3]GB/T21415-2008體外診斷醫(yī)療器械生物樣品中量的測(cè)量校準(zhǔn)品和控制物質(zhì)賦值的[4]GB/T27020—2016合格評(píng)定各類檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的運(yùn)作要求(ISO/IEC17020:2012,IDT)[5]GB/T27043—2012合格評(píng)定能力驗(yàn)證的通用要求[8]NingX.H..XuC.S.,SongYtochondrialbiogenesisduringsubsequentischemia.Am.J.Physiol.1998[9]KapM..SieuwertsA.M.,KubistaM.etal.TheinfluenceoftissueponRNAintegrity,geneexpression,andmorphologyinporcineandhumanBiobank.2015Jun,13(3)[10]Dinovi,C.,Minniti,D.,Barbaro,S.,etal.Vacuum-basedpreservationofsurgicalspeci-mens:anenvironmentally-safesteptowardsaformalin-freehospital.Sci.TotalEnv[11]MagerS.R.,OomenM.H.,MorenteAvailableat:Standardoper[12]GottfriedB.S.,LeeC.J.,BellK.J.TheLeidenfrostPhenomenon:FilmBoilingofLiDropletsonaFlatPlate,”.Int.J.HeatMassTrans[14]MasusdaN.,OhnishiT.,KawamotoS.Anaylsisofchemicalmodififormalin-fixedsamplesaAcidsRes.1999,27pp.4436-4443[15]Chung,J.Y.,BraunSshweig,T.,Willians,R.,etal.FactorsintissuecessingthatimpactRNAobtainedfromtochem.2008,56pp.1033-1042[16]KubistaM.BjOrkman,J.,Svec,D.,SjOback,R.RNAqualitymatters.European_Phamaceutical_ReviewsVo[17]Kashofer,K.,Viertler,C.,Pichler,M.,etal.QualitycontrolofRNApreservationandextractionfromparaffin-embeddedtissue:ImplicationsOne.2013Jul31;8(7):e70714.doi:10.1371/journa[18]Bj?rkmanJ.,&SvecD.2016)."Differentialamplicons(delta[19]BriscoM.J.,&MorleyA.A.2012."QuantificationofRNAintemeasurementoftranscriptnumber."NucleicAcidsRes40(18):el44[20]OivanenM,KuuselaS,Lon