ICS07.120納米技術(shù)基于斑馬魚(yú)胚胎的納米材料毒性評(píng)價(jià)(ISO/TS22082:2020,MOD)國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì)GB/T42470—2023 I Ⅱ 2規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義 1 2 2 25.2儲(chǔ)備液 35.3陽(yáng)性對(duì)照 3 36.1技術(shù)設(shè)備 36.2分析儀器 3 4 47.2產(chǎn)卵刺激 47.3胚胎破膜 7.4納米材料儲(chǔ)備液的制備 67.5試驗(yàn)濃度 67.6納米材料的分散 67.7陽(yáng)性對(duì)照化學(xué)物：3,4-二氯苯胺 67.8試驗(yàn)方法 77.9數(shù)據(jù)分析 8 88.1試驗(yàn)步驟 88.2報(bào)告中包含的信息 8附錄A(資料性)機(jī)械破膜法 附錄B(資料性)斑馬魚(yú)胚胎產(chǎn)卵步驟 附錄C(資料性)結(jié)果驗(yàn)證 起草。本文件修改采用ISO/TS22082:2020《納米技術(shù)基于斑馬魚(yú)胚胎的納米材料毒性評(píng)價(jià)》,文件類(lèi)型由ISO的技術(shù)規(guī)范調(diào)整為我國(guó)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。本文件與ISO/TS22082:2020的技術(shù)差異及其原因如下：——原圖1不符合5.1描述中雌魚(yú)大雄魚(yú)小的形態(tài)特征，因此更改了圖1中雄性及雌性斑馬魚(yú)圖片(見(jiàn)圖1);——在5.2中增加了注釋內(nèi)容，引用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)純凈水的質(zhì)量做了說(shuō)明(見(jiàn)5.2);—--在5.2中增加了對(duì)后文儲(chǔ)備液配置方法部分的引用(見(jiàn)5.2);——6.1.2中光照周期不符合常規(guī)實(shí)驗(yàn)及國(guó)內(nèi)慣例，故引請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專(zhuān)利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專(zhuān)利的責(zé)任。本文件由全國(guó)納米技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)(SAC/TC279)歸口。IⅡ魚(yú)類(lèi)試驗(yàn)是廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)水環(huán)境中化學(xué)物毒性的重要手段。然而，使用包括魚(yú)在內(nèi)的脊椎動(dòng)物對(duì)化學(xué)物進(jìn)行測(cè)試存在動(dòng)物福利問(wèn)題。用已發(fā)育完全的幼魚(yú)進(jìn)行測(cè)試會(huì)給動(dòng)物帶來(lái)明顯不適(如使用OECDTG203),使用生命早期的魚(yú)胚胎而不是成魚(yú)或幼魚(yú)進(jìn)行測(cè)試是一種更符合動(dòng)物福利的替代納米技術(shù)正在諸多領(lǐng)域發(fā)揮積極作用，但人們?nèi)匀粚?duì)納米產(chǎn)品的環(huán)境潛在危害有所擔(dān)憂。經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)使用魚(yú)胚胎評(píng)估急性毒性的試驗(yàn)指南(見(jiàn)OECDTG236)指出，有些化學(xué)物可能不適用這一方法進(jìn)行試驗(yàn)，如分子量≥3kDa的大分子結(jié)構(gòu)物質(zhì)和引起孵化延遲的物質(zhì)。卵膜是魚(yú)胚米材料受到該屏障的影響。使用去卵膜胚胎進(jìn)行毒性評(píng)估盡管不能提供直接的生態(tài)毒理學(xué)信息，但可量破膜胚胎進(jìn)行高通量測(cè)試。但酶破膜法的一個(gè)不足之處在于鏈霉蛋白酶活性的變化可能影響卵膜去除的成功率。許多研究小組已經(jīng)使用去卵膜胚胎進(jìn)行化學(xué)物和納米材料的毒性評(píng)價(jià)[63E9],但方法尚未去卵膜斑馬魚(yú)胚胎可作為其他脊椎動(dòng)物系統(tǒng)的替代系統(tǒng)，用于檢測(cè)納米材料的潛在危害。隨著高發(fā)育周期短(約3個(gè)月成年)、基因組資源的可獲得性(完整的斑馬魚(yú)基因組序列)以及基因與人類(lèi)的相似性。與人類(lèi)基因組的比對(duì)表明，大約70%的人類(lèi)基因在斑馬魚(yú)中存在至少一個(gè)同源基因[14],因此斑本文件提供了使用去卵膜斑馬魚(yú)胚胎進(jìn)行毒性評(píng)價(jià)的方法，推薦了去除斑馬魚(yú)胚胎卵膜的一種優(yōu)1GB/T42470—2023納米技術(shù)基于斑馬魚(yú)胚胎的納米材料毒性評(píng)價(jià)本文件規(guī)定了一種快速評(píng)價(jià)納米材料毒性的方法(魚(yú)類(lèi)生命早期階段，0HPF～120HPF),包括去除卵膜的詳細(xì)操作步驟和使用去卵膜斑馬魚(yú)胚胎評(píng)價(jià)納米材料毒性的完整方案。本文件的重點(diǎn)是測(cè)試納米材料的毒性。本文件適用于商業(yè)化及非商業(yè)化納米材料的毒性2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過(guò)文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文本文件。GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法ISO/TS12805納米技術(shù)材料規(guī)范納米物體特征指南(Nanotechnologies—Materialsspecifi-cations—Guidanceonspecifyingnano-objects)注：GB/T37156—2018納米技術(shù)材料規(guī)范納米物體特性指南(ISO/TS12805:2011,IDT)ISO/TR13014納米技術(shù)納米材料毒理學(xué)評(píng)價(jià)前理化性質(zhì)表征指南(Nanotechnologies—Guid-anceonphysico-chemicalcharacterizationofengineerednanoscalematerialsfortoxicologicassess-ment)注：GB/T39261—2020納米技術(shù)納米材料毒理學(xué)評(píng)價(jià)前理化性質(zhì)表征指南(ISO/TR13014:2012,IDT)ISO/TS17200納米技術(shù)粉體納米顆粒表征和測(cè)量(Nanotechnology—Nanoparticlesinpowderform—Characteristicsandmeasurements)ISO/TR18196納米技術(shù)納米物體表征用測(cè)量技術(shù)矩陣(Nanotechnologies—Measurementtechniquematrixforthecharacterizationofnano-objects)注：GB/T41204—2021納米技ISO22412粒度分析動(dòng)態(tài)光散射法(Particlesizeanalysis—Dynamiclightscattering(DLS))ISO/TS80004-1納米科技術(shù)語(yǔ)第1部分：核心術(shù)語(yǔ)(Nanotechnologies—Vocabulary—Part注：GB/T30544.1—2014納米科技術(shù)語(yǔ)第1部分：核心術(shù)語(yǔ)(ISO/TS80004-1:2010,IDT)ISO/TS80004-2納米科技術(shù)語(yǔ)第2部分：納米物體(Nanotechnologies—Vocabulary—Part2:Nano-objects)OECDTG236:魚(yú)胚胎急性毒性試驗(yàn)OECD化學(xué)品測(cè)試指南第2部分.OECD出版社，巴黎，2013(TestNo.236:FishEmbryoAcuteToxicity(FET)Test.OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals.Section2.OECDPublishing,Paris,2013)2GB/T42470—2023在溶液中起到分散和穩(wěn)定納米材料作用的溶劑或分散劑。將卵排到水中受精。3.3陽(yáng)性對(duì)照positivecontrol當(dāng)?shù)年?yáng)性或反應(yīng)性的任何充分表征的材料或物質(zhì)。3.4劑量探索試驗(yàn)range-findingtest濃度范圍。注：該試驗(yàn)包括至少5個(gè)濃度的納米材料處理組和未經(jīng)處理的對(duì)照組。[來(lái)源：OECDTG236:2013,有修改]3.5有毒物質(zhì)導(dǎo)致一組試驗(yàn)生物體半數(shù)(50%)死亡的濃度。[來(lái)源：ISO6107-3:1993,39,有修改]下列縮略語(yǔ)適用于本文件：DO:溶解氧(dissolvedoxygen)DPF:受精后天數(shù)(daypostfertilization)EM:胚胎培養(yǎng)基(embryomedia)HPF:受精后小時(shí)數(shù)(hourpostfertilization)NOAEL:未觀察到有害作用水平(noobservedadverseeffectlevel)甸。成年斑馬魚(yú)的平均體長(zhǎng)為2cm～3cm,并有藍(lán)色條紋，類(lèi)似于斑馬的身體側(cè)面。成年雄性斑馬魚(yú)可以在水族箱中飼養(yǎng)和繁殖，器官發(fā)生在5個(gè)DPF內(nèi)完成，約3個(gè)月成年，壽命約為2年～3年。3ABAa)雄性b)雌性圖1斑馬魚(yú)使用純凈水現(xiàn)用現(xiàn)配(見(jiàn)7.4)。實(shí)驗(yàn)室用水達(dá)到GB/T6682—2008中規(guī)定的最低標(biāo)準(zhǔn)。3,4-二氯苯胺(3,4-DCA)(CAS#95-76-1)?？梢允褂枚嗫装?6孔或12孔)進(jìn)行化學(xué)物暴露。為防止水分在暴露過(guò)程中蒸發(fā)，宜使用生物相容性基材(如封口膜或透明的自粘箔)密封容器。孵化溫度控制在27℃±1℃,光照周期控制為14:10(明：暗)(見(jiàn)GB/T39649—2020)。改為14:10(明：暗)。體視或倒置顯微鏡，放大倍數(shù)不低于80倍。通常由一個(gè)互相匹配的產(chǎn)卵框和一個(gè)稍大的收集缸組成，尺寸不限。產(chǎn)卵框底部的網(wǎng)格尺寸為單通道移液器。使用ISO/TR18196中給出的及以下分析儀器。4利用電子束掃描納米材料表面獲得放大圖像。6.2.2透射電子顯微鏡(TEM)利用電子束穿過(guò)樣品并與其相互作用獲得納米材料的放大圖像。6.2.3動(dòng)態(tài)光散射儀(DLS)用于測(cè)定液體中納米材料的粒度分布。6.2.4靜態(tài)多重光散射儀(SMLS)用于分析濃縮分散液中的粒徑變化。用于檢測(cè)和定量濃度低至10-15的金屬離子。應(yīng)給出斑馬魚(yú)品系。成年斑馬魚(yú)宜無(wú)外部可見(jiàn)疾病和感染，并且6個(gè)月內(nèi)未接受任何藥物處理。成年斑馬魚(yú)宜在最佳條件和密度下飼養(yǎng)以保持健康。成年斑馬魚(yú)每天采用活的豐年蝦無(wú)節(jié)幼體(Artemiasp.)或市售干餌料喂食兩次，宜避免過(guò)量喂食。為了保持最佳水質(zhì)，宜每天清除所有剩余食物。仔魚(yú)和幼魚(yú)每天要用干餌料喂食3次。應(yīng)記錄喂建議光照14h,黑暗10h。應(yīng)記錄光照周期的偏差。7.1.4溫度和pH斑馬魚(yú)養(yǎng)殖水溫建議在26℃~28℃,pH接近中性。應(yīng)記錄實(shí)際水溫和pH。7.2產(chǎn)卵刺激魚(yú)胚胎可通過(guò)年齡在3個(gè)月～12個(gè)月之間的親魚(yú)繁殖獲得。成年斑馬魚(yú)可以雌雄單獨(dú)配對(duì)或成群配對(duì)產(chǎn)卵，產(chǎn)卵在市售設(shè)備或定制裝置中進(jìn)行。將成年斑馬魚(yú)以2:1或1:1(雌性：雄性)的性別比放入繁殖缸中，開(kāi)啟全光譜白光刺激產(chǎn)卵，在燈光開(kāi)啟后1h內(nèi)收集胚胎。胚胎采用EM沖洗幾次，肉眼檢查并將卵膜內(nèi)部不透明和/或細(xì)胞破裂的未受精胚胎移除(見(jiàn)附錄B)。5GB/T42470—2023程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。機(jī)械破膜法在體視顯微鏡下手動(dòng)操作去除早期胚胎的卵膜(0HPF～10HPF)時(shí)存在一0.081g硫酸鎂(MgSO?)溶于純凈水定容至1L,配制含5.0mMNaCl、0.17mMKCl、整至7.4。--—收集受精的胚胎，并根據(jù)需要分離盡可能多的處于4HPF發(fā)育階段的胚胎(比實(shí)際需要的胚胎數(shù)量多20%)。 鏈霉蛋白酶(EC:CAS#9036-06-0)儲(chǔ)備液配制。該酶是從灰鏈霉菌中獲得的幾種非特異性內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶的混合物，可以將蛋白質(zhì)消化成單個(gè)氨基酸。使用蒸餾水在的胚胎(～1000個(gè))。鏈霉蛋白酶)浸泡3min?！?—沖洗后，使胚胎在27℃±1℃下靜置20min～30min。然后在另一個(gè)EM漂洗周期(6min)去除培養(yǎng)皿中殘留的破碎卵膜。酶破膜法示意圖見(jiàn)圖2。6·蛋白酶(來(lái)自灰色鏈霉菌)酶處理濃度：19.1U/25mL·溫度：27℃±1℃·沖洗(至少3遍)A——正常胚胎；B——破膜胚胎。過(guò)超聲波和(或)攪拌的方式制備儲(chǔ)備液。必要時(shí)可使用增溶劑(溶劑或分散劑)分散納米材料。在試驗(yàn)過(guò)程中，宜根據(jù)材料的種類(lèi)選擇適宜的方法對(duì)納米材料在介質(zhì)中的分散穩(wěn)定性進(jìn)行檢測(cè)。若使用增溶劑，濃度不宜超過(guò)0.01%(體積分?jǐn)?shù)),并需增設(shè)增溶劑對(duì)照組，保持各組試驗(yàn)容器一致。增溶劑不宜對(duì)通過(guò)連續(xù)稀釋儲(chǔ)備液來(lái)制備所需濃度的測(cè)試液。必要時(shí)可使用增溶劑(溶劑或分散劑)分散納米符合ISO22412中納米材料的分散狀態(tài)。3,4-二氯苯胺是一種非特異性的膜刺激劑或代謝抑制劑，在化學(xué)工業(yè)中用作合成3,4-二氯苯基異為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。在這個(gè)試驗(yàn)濃度下，陽(yáng)性對(duì)照組120HPF胚胎的死亡率宜至少達(dá)到30%。7見(jiàn)7.3中的試驗(yàn)方法制備。以下為納米材料暴露的具體步驟。a)選擇健康且形態(tài)正常的4HPF斑馬魚(yú)胚胎，采用0.764U/mL的鏈霉蛋白酶除去卵膜(見(jiàn)7.3)。b)在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)測(cè)定實(shí)際顆粒濃度。c)新破膜的胚胎在培養(yǎng)箱中孵育直到試驗(yàn)開(kāi)始。將10個(gè)處于6HPF發(fā)育階段的健康破膜胚胎分別放入裝有測(cè)試液的培養(yǎng)板中(6孔板為4mL/孔；12孔板為2mL/孔)。e)在半靜態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中，每24h徹底更換一次測(cè)試液以保證濃度穩(wěn)定，直到測(cè)試結(jié)束。納米材料毒性測(cè)試的胚胎暴露周期為6HPF～120HPF。f)最終試驗(yàn)至少宜設(shè)置5個(gè)測(cè)試濃度，以不大于2.2的固定倍數(shù)逐級(jí)稀釋得到。若使用增溶劑，濃度宜不大于0.01%(體積分?jǐn)?shù)),并保持各組試驗(yàn)容器一致。每組3個(gè)復(fù)孔。h)暴露期間每天使用體視顯微鏡觀察胚胎。記錄并從孔中移除死亡胚胎。通過(guò)檢查可見(jiàn)的終點(diǎn)來(lái)確定胚胎(仔魚(yú))死亡(見(jiàn)7.8.4)。j)為了計(jì)算出準(zhǔn)確的LC?。,最終試驗(yàn)濃度宜包括NOAEL濃度和100%致死的濃度。為了確定LC?o,需對(duì)納米材料進(jìn)行兩輪測(cè)試。首先對(duì)納米材料進(jìn)行劑量探索試驗(yàn)，根據(jù)劑量探索試驗(yàn)的測(cè)試結(jié)果來(lái)確定最終試驗(yàn)的濃度設(shè)置。劑量探索試驗(yàn)中，試驗(yàn)濃度應(yīng)間隔較大(例如：確定胚胎(仔魚(yú))死亡。試驗(yàn)期間需每日在體視顯微鏡下觀察胚胎(或仔魚(yú))。尾部不能從卵黃囊中分離的胚胎視為死亡。心臟跳動(dòng)在48HPF易于觀察到。如果胚胎(或仔魚(yú))沒(méi)有呼吸運(yùn)動(dòng)和(或)沒(méi)有心跳，則視為死亡。8心跳不規(guī)律(不穩(wěn)定)的不認(rèn)為是死亡。根據(jù)95%置信區(qū)間內(nèi)120HPF的LC??來(lái)評(píng)價(jià)受試樣品的毒性。通過(guò)概率分析和非線性logistic試驗(yàn)報(bào)告應(yīng)與所使用的試驗(yàn)步驟一致。在報(bào)告中說(shuō)明受試納米材料的如下信息。在報(bào)告中說(shuō)明受試斑馬魚(yú)的如下信息?！唏R魚(yú)來(lái)源(包括品系名稱及發(fā)育階段)?！糜诒┞兜?HPF斑馬魚(yú)胚胎數(shù)量。在報(bào)告中說(shuō)明所使用材料和儀器的如下信息?！{米材料制備說(shuō)明：儲(chǔ)備液和測(cè)試液的制備、增溶劑(如果使用的情況下)及其他溶劑的制在報(bào)告中說(shuō)明所用輔助材料的如下信息。在報(bào)告中說(shuō)明試驗(yàn)設(shè)計(jì)的如下信息。9料在試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)和24h后的實(shí)際濃度(如果可能的話)、金屬基納米材料(如AgNP)釋放的離——計(jì)算120HPF的LC??(見(jiàn)7.8.4)。GB/T42470—2023(資料性)機(jī)械破膜法以下為機(jī)械破膜法操作步驟。a)準(zhǔn)備一對(duì)經(jīng)過(guò)消毒的精密鑷子。b)收集同一天的受精胚胎，并使用4HPF的胚胎進(jìn)行試驗(yàn)。c)雙手各拿一只鑷子，在體視顯微鏡下，于胚胎側(cè)面的兩個(gè)相近位點(diǎn)夾住卵膜。e)觀察胚胎有無(wú)損傷跡象，如細(xì)胞層撕裂或卵黃穿孔。不要使用受損胚胎進(jìn)行試驗(yàn)。以下為機(jī)械破膜法優(yōu)點(diǎn)?！僮骱?jiǎn)單。A.3缺點(diǎn)以下為機(jī)械破膜法缺點(diǎn)?！枰罅烤毩?xí)方可熟練操作。——獲得大量破膜胚胎費(fèi)時(shí)費(fèi)力。——胚胎機(jī)械損傷率高。——不適合高通量檢測(cè)方法。機(jī)械破膜法示意圖見(jiàn)圖A.1。圖A.1機(jī)械破膜法(資料性)——準(zhǔn)備繁殖缸(見(jiàn)圖B.1);———將雌性和雄性親魚(yú)(性別比為2:1或1:1)放入繁殖缸中，并由擋板隔開(kāi)；--—用網(wǎng)篩收集胚胎；(資料性)結(jié)果驗(yàn)證a)試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組(稀釋水對(duì)照和溶劑對(duì)照)中斑馬魚(yú)胚胎總存活率宜≥90%;b)試驗(yàn)期間水溫應(yīng)保持在27℃±1℃;c)試驗(yàn)開(kāi)始和結(jié)束時(shí)，溶解氧濃度應(yīng)為空氣飽和度的60%～100%,即21℃和1個(gè)大氣壓條件下濃度為5349mg/L～8915mg/L;d)在批次試驗(yàn)中，收集的魚(yú)卵總受精率宜≥70%。[1]GB/T39649—2020實(shí)驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)魚(yú)質(zhì)量控制[2]ISO6107-3:1993Waterqu[3]ISO10993-10:2010Biologicalevaluati[4]Truong,L.HarperS.L.,TanguayR.L.Evalbrafishmodel.In:Drugsafetyevaluation.ed:Springer,2011,pp.271-279[5]MandrellD.,TruongL.,JephsonC.,SarkerM.R.,MooreA.,LangC.etal.Automazebrafishchorionremovalandsingleembryoplacemenmentaltoxicityscreens.JournalofLaboratoryAutomation.2012,17,pp.66-74[6]CunninghamS.,Brennan-FournetM.E.,LedwithD.,ByrnesL.,JoshiL.Effectofnanop-articlestabilizationandphysicochemicalpropertiesonexposureoutcome:acutetoxicityofsilvernano-particlepreparationsinzebrafish(Daniorerio).Environmentalscience&.technology.2013pp.3883-3892[7]ParkK.,TuttleG.,SincheF.,HarperS.L.Stabilityofcitrate-cappedsilvnanoparticlesinexposuremediaandtheireffectsontrio).Archivesofpharmacalresearch.2013,36,pp.125-133vernanoparticles,2016brafishembryosrevealthatnanotoxicityprofilesaredependentonsurface-functionalizationcontrolledpenetranceofbiologicalmembranes.Scientificreports.2017,7,p.8423[10]TruongL.,MandrellD.,MandrellR.,SimonichM.,TanguayR.L.Arapidapproachidentifiescognitivedeficitsinadultzebrafpolybrominatedflameretardants.Neurotoxicology.2014,43,pp.134-142[11]TruongL.,BugelS.M.,ChlebowskiA.,UsenkoC.Y.,SimonichM.T.,SimL.M.etal.Optimizingmulti-dimensionalhighthroughputscreeningusingzebrafish.ReproductiveToxicology.2016,65,pp.139-147[12]NoyesP.D.,HaggardD.E.,GonnermanG.D.,TanguayR.L.Advancedmorphbehavioraltestplatformrevealprehensivesuiteofhalogenatedandorganophosphateflameret2015,145,pp.177-195[13]HarperS.L.,CarriereJ.L.,MillerJ.M.,HutchisonJ.EL.Systematicevaluationofnanomaterialtoxicity:utilityofstandardizedmaterialsandrapidassays.ACSNano.2011,5,pp.4688-4697[14]HoweK.,ClarkM.D.,TorrojaC.F.,TorranceJ.,Be[15]DeLoidG.M.,CohenJ.M.,PyrgiotakisG.,DemokritouP.Preparation,characterization,andinvitrodosimetryofdispersed,engineerednanomaterials.NatureProtocols.2017,12,p.355[16]ScheilV.,KienleC.,OsterauerR.,GerhardtA.,K?hlerH.-R.EffectsGB/T42470—2023nilineanddiazinonondifferentbvae.Ecotoxicology.2009,18,pp.355-363[17]PereiraT.S.B.,BoscoloC.N.P.,daSilvaD.G.H.,BatlouniS.R.,SchlenkD.,deAlmeidaE.A.Anti-androgenicactivitiesofdiuronanditsmetabolitesinmaleNiletilapia(Oreochromisniloticus).AquaticToxicology.2015,164,pp.10-15[18]SaeedS.,Al-NaemaN.,ButlerJ.D.,FebboE.J.Arabiankillifish(Aphaniusdispar)em-bryos:AmodelorganismfortheriskassessmentoftheArabianGulfcoastalwaters.EnvironmentalToxicologyandChemistry.Chem.2015,34,pp.2898-2905[19]AdeyemiJ.A.,daCunhaMartins-JuniorA.,BarbosaJrF.Teratogenicity,genotoxicityandoxidativestressinzebrafishembryos(Daniorerio)co-exposedtoarsenicandatrazine.ComparativeBiochemistryandPhysiology,partC.2015,172,pp.7-12[20]BaiH.,KongW.-W.,ShaoC.-L.,LiY.,LiuY.-Z.,LiuM.etal.Zebrafishembryotoxic-itymicroscalemodelforichthyotoxicityevaluationofmarinenaturalproducts.MarineBiotechnology.2016,18,pp.264-270[21]Zebrafishembryosamplepreparation(online).Availableat:/Ze-[22]OECD.TestNo.203:Fish,AcuteToxicityTest.OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals.Section2.