飼料中牛羊源性成分檢測實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)法Determinationofbovineandovinematerialinfeeds—2010-09-21發(fā)布2010-12-01實施I本標(biāo)準(zhǔn)遵照GB/T1.1—2009給出的規(guī)則起飼料中牛羊源性成分檢測實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)法本方法的最低檢出限為0.1%。GB/T20195動物飼料試樣的制備26.1.1緩沖液I:50mmol/LTris-HCl和5%SDS,pH=8.0。稱取Tris堿6.057g、SDS50g,pH至8.0,加水稀釋至1000mL用濃鹽酸(HCl)調(diào)pH至8.0,加水稀釋至1000mL36.2.12×牛羊源性成分檢測反應(yīng)液6.2.2牛羊源性成分檢測引物混合液含有擴增牛羊源性成分檢測引物(序列詳見表1)。引物濃度與使用的實時熒光PCR擴增儀有關(guān)，下游引物6.2.3牛羊源性成分檢測探針混合液含有檢測飼料中牛羊源性線粒體DNA的探針(序列詳見表2)。探針濃度與使用的實時熒光PCR表2牛羊源性成分檢測探針序列牛探針5'(FAM)-TGGACC/GGTTTTAGA/G羊探針5'(FAM)-TGGGCGATTTTAGA/GTGAGA-3'(M5'(FAM)-AGATGTCTTATTTAA7.8冰箱：溫度，-20℃~4C。8.1DNA的提取底懸浮；加入蛋白酶K溶液(6.1.6)20μL,混勻。在65℃水浴約30min,其間混勻2次～3次；加入340μL緩沖液Ⅱ(6.1.2),充分顛倒混勻，65℃水6次～8次，此時可能會出現(xiàn)絮狀沉淀；將所得溶液和絮狀沉淀全部移入一個DNA吸附柱內(nèi)(吸附柱放液Ⅲ(6.1.3)(使用前請按照緩沖液Ⅲ+無水乙醇=13+17的比例加入無水乙醇),12000r/min離心無水乙醇=1+4的比例加入無水乙醇),12000r/min離心30s,倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；向4吸附柱內(nèi)加入500μL漂洗液(6.1.4),12000r/mr/min離心2min,倒掉廢液。將吸附柱放入一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50μL～200μL洗脫緩沖液TE(6.1.5),室溫放置約5min,12000r/min離心2min;該DNA提取溶液于一20℃保存。8.2試樣中DNA濃度和純度的測定將提取的DNA溶液(8.1)用雙蒸水進行適當(dāng)稀釋，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計在260N——核酸稀釋倍數(shù)。8.3實時熒光PCR檢測8.4實時熒光PCR循環(huán)條件實時熒光PCR循環(huán)結(jié)束后，由熒光定量PCR儀自動生成分析結(jié)果報告，以C,平均值表述實驗結(jié)空白對照無C?值并且無擴增曲線，陰性對照無C.值并且無擴增曲線，0.1%的陽性對照出現(xiàn)典