原代細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)陳加祥，Ph.D第一節(jié)、原代細(xì)胞培養(yǎng)基本概念：來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細(xì)胞稱之為原代細(xì)胞。初代培養(yǎng)物開始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱之為細(xì)胞系（CellLine）?！軌蜻B續(xù)傳代的細(xì)胞叫做連續(xù)細(xì)胞系—不能連續(xù)培養(yǎng)的稱為有限細(xì)胞系通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中獲得具有特殊性質(zhì)或標(biāo)志物的培養(yǎng)物稱為細(xì)胞株（CellStrain）。原代細(xì)胞的培養(yǎng)是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng)，是建立細(xì)胞系的第一步。原代細(xì)胞生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化，最接近和反映體內(nèi)生長特性。原代細(xì)胞往往有多種細(xì)胞組成，比較混雜。原代細(xì)胞生物特性尚不穩(wěn)定，如需做較為嚴(yán)格的對(duì)比性實(shí)驗(yàn)研究，還需進(jìn)行短期傳代培養(yǎng)。一、原代細(xì)胞的取材

取材的基本要求：（1）注意新鮮和保鮮：取材時(shí)應(yīng)盡量在4-6h內(nèi)能制作成細(xì)胞；（2）嚴(yán)格無菌；（3）用鋒利的器械切碎組織，減少對(duì)細(xì)胞的機(jī)械損傷；（4）去除材料上的血液、脂肪、壞死組織及結(jié)締組織；（5）盡量選用易培養(yǎng)的組織進(jìn)行培養(yǎng)。胚胎組織易于成熟個(gè)體組織，分化低易于分化高的組織，腫瘤組織易于正常組織。二、原代細(xì)胞的分離和制作1、懸浮細(xì)胞的分離方法組織來源：血液、羊水、胸水或腹水。方法：1000r/min的低速離心10min→沉淀用無鈣、鎂PBS洗兩次，培養(yǎng)基洗一次→調(diào)整適當(dāng)細(xì)胞濃度→分瓶培養(yǎng)。若選用懸液中某些細(xì)胞，加入細(xì)胞分層液，經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層。如：淋巴細(xì)胞分離。2、實(shí)體組織材料的分離方法實(shí)體組織細(xì)胞間結(jié)合緊密，為了使組織中的細(xì)胞充分分散，形成細(xì)胞懸液，可采用：（1）機(jī)械分散法（2）消化分離法（1）機(jī)械分散法適用組織：纖維成分少的軟組織。如腦組織，部分胚胎組織。方法：采用剪刀剪切、用吸管吹打分散組織細(xì)胞。將已充分剪碎分散的組織放在注射器內(nèi)使細(xì)胞通過針頭壓出。在不銹鋼網(wǎng)內(nèi)用鈍物壓擠使細(xì)胞從網(wǎng)孔中壓擠出。特點(diǎn)：分離細(xì)胞簡便、快速，但對(duì)組織機(jī)械損傷大，而且細(xì)胞分散效果差。（2）消化分離法組織消化法是把組織剪切成小塊，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng)，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀，再結(jié)合機(jī)械法（用吸管吹打分散或電磁攪拌）使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散，制成細(xì)胞懸液。1）酶消化分離法常采用胰蛋白酶和膠原酶（a）胰蛋白酶胰酶是一種胰臟制品，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水解而使細(xì)胞分散。影響胰酶消化細(xì)胞能力的因素：①組織類型適于消化細(xì)胞間質(zhì)較少的軟組織（肝、腎、胚胎組織、上皮組織）。對(duì)含結(jié)締組織較豐富的組織單用無效（如乳腺、滑膜、子宮、腫瘤組織），需與膠原酶合用。②酶的活力：新鮮配制，低溫保存。③酶的濃度:

為0.1%-0.25%。④溫度:

常用的溫度為37℃。⑤pH:

選用7.6~8.0之間。⑥無機(jī)鹽離子：鈣和鎂可抑制胰酶的消化作用，配制時(shí)應(yīng)采用無鈣鎂離子的PBS配制。⑦消化時(shí)間：

20分鐘為宜，冷消化時(shí)可使用低濃度消化液4℃過夜。⑧無血清：血清中含有抗胰蛋白酶因子（b）膠原酶（Collagenase）膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來的酶，水解結(jié)締組織中膠原蛋白成分，而不損傷其它蛋白質(zhì)和組織。適用組織：纖維性組織、上皮組織以及癌組織。對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用。有鈣、鎂離子存在仍有活性。消化作用緩和，無需機(jī)械振蕩。價(jià)格較高，大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。采用膠原酶與胰蛋白酶聯(lián)合消化。最終濃度0.1~0.3mg/mL。膠原酶Ⅰ：用于上皮、肺，脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的分離。膠原酶Ⅱ：適用于肝臟，骨，甲狀腺，心臟和唾液腺組織。膠原酶Ⅳ：包含至少7種蛋白酶成分，能消化多種組織。膠原酶Ⅴ：可用于胰腺小島組織的分離（2）非酶消化法（EDTA消化法）EDTA又稱螯合劑，全名為乙烯二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對(duì)上皮組織分散效果好原理：與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離缺點(diǎn)：細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀，有團(tuán)塊。與胰酶混合使用（1:1或2:1），不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散，可降低胰酶的用量和毒性作用。消化分離法的操作步驟：（1）剪切：把組織塊剪碎。（2）漂洗：無鈣鎂PBS洗2-3次。（3）消化：加入消化液（胰蛋白酶/膠原酶/EDTA）于37℃中作用適當(dāng)時(shí)間。（4）棄去消化液：傾斜自然沉降或低速離心法。（5）漂洗：將含有血清、鈣、鎂的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入，中止消化反應(yīng)，漂洗2-3次后，加入完全培養(yǎng)基。（6）機(jī)械分散：采用吸管吹打或振蕩法，使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)過濾后分瓶培養(yǎng)。注意事項(xiàng)（1）組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。（2）胰酶濃度不宜過高，作用時(shí)間不能太長，以免過量損傷細(xì)胞。（3）消化后組織不僅要盡量棄去消化液，而且動(dòng)作要輕柔。三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法:如淋巴細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法：如血管平滑肌細(xì)胞消化培養(yǎng)法：如血管內(nèi)皮細(xì)胞1.淋巴細(xì)胞分離原理（密度梯度離心）淋巴細(xì)胞分離液：由60%的聚蔗糖Ficoll

2份和34%的泛影葡胺1份混合制成。1.0201.200特性：分子量大、無化學(xué)活性、比重為1.077士0.001

血液中各種細(xì)胞的比重不同：淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞：1.070粒細(xì)胞和紅細(xì)胞：1.092將血液加至分離液上，通過離心，可使一定比重的細(xì)胞按相應(yīng)密度梯度進(jìn)行分布。2.淋巴細(xì)胞分離步驟：1.抽取靜脈血2ml，注含有肝素的無菌試管中搖勻，加入2mlHanks溶液稀釋。2.吸管吸取稀釋血液沿試管壁緩緩加到含有2ml淋巴細(xì)胞分離液的試管中（血液:Hanks液:淋巴細(xì)胞分離液的比例為1:1:1）。3.水平式離心2000r/min×20min4.用平口吸管小心吸取中層呈白色霧狀的細(xì)胞層，用Hanks溶液洗滌兩次，每次離心1500r/min×10min。5.棄上清，加RPMI-1640培養(yǎng)液1ml混勻，取少許進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)及活力測定。6.貼壁法區(qū)分單核細(xì)胞（易貼壁）和淋巴細(xì)胞注意事項(xiàng)1.抽血后在2小時(shí)內(nèi)使用。2.注意將稀釋后的血輕輕地沿管壁鋪在聚蔗糖液面上，避免破壞其界面。3.在收集單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞時(shí)，將吸管輕輕插入該層后，沿管壁輕輕旋轉(zhuǎn)吸取細(xì)胞。2、組織塊培養(yǎng)法（組織培養(yǎng)）舉例：貼塊法培養(yǎng)血管平滑肌細(xì)胞步驟：鋪瓶：大鼠經(jīng)頸動(dòng)脈放血后，無菌操作取一段胸主動(dòng)脈，置于含Hank‘s液的平皿中漂洗3次，將血凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層，縱行剪開血管，刮血管內(nèi)膜2~3遍，將中膜剪成約1mm2大小碎片，均勻鋪在瓶底，25mL培養(yǎng)瓶可接種20~30小塊。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使瓶底朝上，然后于瓶內(nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞，將瓶傾斜放置在37℃溫箱內(nèi)。翻瓶：待其稍干燥后，將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放，靜置培養(yǎng)。培養(yǎng)24小時(shí)后再補(bǔ)液，培養(yǎng)初期移動(dòng)和觀察時(shí)要輕拿輕放，開始幾天盡量不去搬動(dòng)，以利貼壁和生長，培養(yǎng)3~5天時(shí)可換液。7-9天開始有細(xì)胞從組織塊周圍爬出14天左右細(xì)胞融合成大片3.消化法原代培養(yǎng)HUVEC（1）無菌條件下取正常分娩胎兒的新鮮臍帶(20cm)，用PBS沖洗臍帶至無血色液體流出。（2）從臍靜脈一端注入0.1%的Ⅱ型膠原酶溶液，夾閉臍帶兩端，置于37℃培養(yǎng)箱消化。15min后，收集消化液，并加入含20％胎牛血清的M199培基10ml終止消化，注入M199培基反復(fù)灌洗臍帶，收集沖洗液，與消化液一起于1000rpm離心5min。（3）棄上清液，加入全M199培養(yǎng)液（含20%胎牛血清、100ng/mlVEGF）4ml，吹打使細(xì)胞重新懸浮，移入培養(yǎng)瓶中，靜置培養(yǎng)。（4）24h后換液，以后每隔3天換液一次，約7天左右細(xì)胞長滿匯合，可以傳代。（5）使用前運(yùn)用標(biāo)記因子CD31或VIII因子對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行鑒定。四、培養(yǎng)細(xì)胞的純化1、自然純化2、人工純化（1）酶消化法（2）機(jī)械劃除法（3）反復(fù)貼壁法（4）克隆法（5）培養(yǎng)及限定方法（6）流式分選1、自然純化即利用某一種類細(xì)胞的增殖優(yōu)勢，而排擠其他細(xì)胞生長，靠自然的增殖潛力最后留下生長優(yōu)勢細(xì)胞，去除其他細(xì)胞。無法人為選擇細(xì)胞，時(shí)間長有些惡性腫瘤細(xì)胞可以通過此方法，自然純化建立細(xì)胞系。2、人工純化（1）酶消化法如上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞對(duì)胰酶的耐受性不同：消化細(xì)胞時(shí)，常是成纖維細(xì)胞先脫壁，而上皮細(xì)胞要消化相當(dāng)長的時(shí)間才脫壁，特別是在原代培養(yǎng)和培養(yǎng)早期這種差別尤為明顯，因而采用多次差別消化法將上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分開。（2）機(jī)械劃除法上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞同時(shí)出現(xiàn)，混雜生長。每種細(xì)胞都以小片或區(qū)域性分布的方式生長在瓶壁上。因此可以采用機(jī)械的方法去除不需要的細(xì)胞。（3）反復(fù)貼壁法成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞相比，貼壁快，大部分細(xì)胞常能在短時(shí)間內(nèi)（約10-30min）完成附著，而上皮細(xì)胞大部分在短時(shí)間內(nèi)不能附著或附著不穩(wěn)定，稍加振蕩即浮起，這樣可以利用此差別來純化細(xì)胞。（4）培養(yǎng)基限定方法某些細(xì)胞在生長過程中必須存在或必須去除某種物質(zhì)，否則無法生長，可以利用這種技術(shù)來純化細(xì)胞：溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine