《植物轉(zhuǎn)基因成分測定目標(biāo)序列測序法GB/T38570-2020》詳細(xì)解讀contents目錄1范圍2規(guī)范性引用文件3術(shù)語和定義4原理5試劑或材料6儀器設(shè)備contents目錄7測定步驟7.1抽樣和制樣7.2DNA提取與純化7.3文庫構(gòu)建7.4高通量測序8質(zhì)量控制9結(jié)果分析與表述contents目錄9.1結(jié)果分析9.2結(jié)果表述10防污染措施附錄A(規(guī)范性附錄)探針序列附錄B(規(guī)范性附錄)人工DNA011范圍該標(biāo)準(zhǔn)適用于植物及其產(chǎn)品中的外源基因和轉(zhuǎn)基因品系的定性檢測。適用對象包括對外源基因和轉(zhuǎn)基因品系的測定，通過目標(biāo)序列測序法來實現(xiàn)。檢測內(nèi)容此標(biāo)準(zhǔn)不僅限于特定植物種類，而是具有廣泛的適用性，可針對不同植物進(jìn)行檢測。應(yīng)用廣泛性1.范圍010203022規(guī)范性引用文件《轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測抽樣和制樣方法》《分子生物學(xué)實驗室安全規(guī)范》《中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)制定程序》主要引用的文件010203《轉(zhuǎn)基因生物安全評價與管理技術(shù)規(guī)范》《植物新品種特異性、一致性和穩(wěn)定性測試指南》其他相關(guān)的國家和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、技術(shù)規(guī)范和指南輔助引用的文件引用文件的作用010203確保測定方法的科學(xué)性和規(guī)范性，提高測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。為實驗室人員提供操作指南，保障實驗過程的安全性和有效性。促進(jìn)植物轉(zhuǎn)基因成分測定的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化，推動相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)步和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。033術(shù)語和定義3.1轉(zhuǎn)基因植物通過基因工程技術(shù)將外源基因?qū)?，并能在植物體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)和遺傳的植物。這類植物可能具有抗蟲、抗病、抗逆等優(yōu)良性狀，或者能夠改善植物的營養(yǎng)成分。3.2目標(biāo)序列測序法一種基于高通量測序技術(shù)，對特定目標(biāo)序列進(jìn)行測序分析的方法。該方法能夠準(zhǔn)確、高效地檢測出植物中的轉(zhuǎn)基因成分，為轉(zhuǎn)基因植物的標(biāo)識和管理提供有力支持。3.3外源基因非植物自身基因組中的基因，而是通過基因工程技術(shù)導(dǎo)入植物體內(nèi)的基因。外源基因可能來自其他植物、微生物或動物等，用于賦予轉(zhuǎn)基因植物特定的優(yōu)良性狀。通過實驗方法確定樣品中是否存在轉(zhuǎn)基因成分的檢測方式。定性檢測的結(jié)果通常以“是”或“否”來表示，即判斷樣品是否為轉(zhuǎn)基因植物或其產(chǎn)品。3.4定性檢測044原理高靈敏度該方法具有較高的靈敏度，能夠檢測出樣本中極低含量的轉(zhuǎn)基因成分。這得益于高通量測序技術(shù)的高深度和高精度。高通量測序技術(shù)該方法主要利用高通量測序技術(shù)，對植物樣本中的DNA進(jìn)行深度測序。通過測序，可以獲得樣本中所有的DNA序列信息，包括轉(zhuǎn)基因成分。生物信息學(xué)分析測序完成后，利用生物信息學(xué)方法對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。通過比對已知的外源基因序列，可以準(zhǔn)確地檢測出樣本中的轉(zhuǎn)基因成分。定性檢測該方法主要用于定性檢測，即判斷樣本中是否存在轉(zhuǎn)基因成分，而非定量測定轉(zhuǎn)基因成分的含量。目標(biāo)序列測序法測定原理055試劑或材料用于從植物樣品中提取DNA，可能包括裂解緩沖液、蛋白酶K、RNA酶等，以確保高效、純凈的DNA提取。DNA提取試劑5.1試劑包括PCR引物、dNTPs（脫氧核苷三磷酸）、DNA聚合酶等，用于目標(biāo)序列的特異性擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增試劑如測序引物、測序酶等，用于擴(kuò)增產(chǎn)物的高通量測序。測序試劑待測的轉(zhuǎn)基因植物或其產(chǎn)品，應(yīng)確保樣品的代表性、新鮮度和無污染。植物樣品已知轉(zhuǎn)基因成分和非轉(zhuǎn)基因成分的對照樣品，用于方法的驗證和結(jié)果的比對。對照樣品用于承載測序反應(yīng)，確保測序的高通量和準(zhǔn)確性。測序芯片/測序板5.2材料010203066儀器設(shè)備用于對目標(biāo)序列進(jìn)行高通量測序，確?？焖佟?zhǔn)確地獲取測序數(shù)據(jù)。測序儀用于擴(kuò)增特定的DNA片段，是準(zhǔn)備測序樣本的重要設(shè)備。PCR儀用于觀察和記錄凝膠電泳結(jié)果，輔助驗證測序樣本的質(zhì)量。凝膠成像系統(tǒng)6.1儀器設(shè)備概述選擇依據(jù)根據(jù)實驗室的具體需求和預(yù)算，選擇性能穩(wěn)定、操作簡便、維護(hù)方便的儀器設(shè)備。配置要求確保儀器設(shè)備能夠滿足測定方法的精度和靈敏度要求，同時考慮設(shè)備的可擴(kuò)展性和兼容性。6.2儀器設(shè)備的選擇與配置制定詳細(xì)的儀器設(shè)備操作規(guī)程，確保實驗人員能夠正確、安全地使用設(shè)備。操作規(guī)范定期對儀器設(shè)備進(jìn)行維護(hù)保養(yǎng)，確保其處于良好的工作狀態(tài)，延長使用壽命。維護(hù)保養(yǎng)6.3儀器設(shè)備的操作與維護(hù)高質(zhì)量的儀器設(shè)備能夠提供更準(zhǔn)確、更可靠的測序數(shù)據(jù)，從而提高轉(zhuǎn)基因成分測定的準(zhǔn)確性。提高測定準(zhǔn)確性自動化、智能化的儀器設(shè)備能夠大大縮短實驗周期，提高工作效率。提升工作效率性能穩(wěn)定的儀器設(shè)備能夠降低實驗過程中的安全風(fēng)險，保障實驗人員的安全。保障實驗安全6.4儀器設(shè)備在測定方法中的重要性077測定步驟收集植物樣品根據(jù)實驗需求，收集適當(dāng)數(shù)量和類型的植物樣品。樣品處理7.1樣品準(zhǔn)備對收集到的樣品進(jìn)行必要的處理，如清洗、干燥、粉碎等，以便于后續(xù)的DNA提取。0102DNA提取采用適當(dāng)?shù)姆椒◤奶幚砗蟮臉悠分刑崛NA，確保提取效率和純度。DNA純化對提取到的DNA進(jìn)行純化，去除其中的雜質(zhì)和污染物，以獲得高質(zhì)量的DNA模板。7.2DNA提取與純化設(shè)計引物根據(jù)目標(biāo)序列的特點，設(shè)計特異性引物用于擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增采用PCR技術(shù)對目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，確保擴(kuò)增的特異性和效率。7.3目標(biāo)序列擴(kuò)增文庫構(gòu)建將擴(kuò)增后的目標(biāo)序列構(gòu)建成測序文庫，以便于后續(xù)的測序操作。測序采用高通量測序技術(shù)對文庫進(jìn)行測序，獲得大量的測序數(shù)據(jù)。7.4測序文庫構(gòu)建與測序?qū)y序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制，去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)和測序錯誤。數(shù)據(jù)質(zhì)量控制將測序數(shù)據(jù)與已知的外源基因序列進(jìn)行比對，識別并定量樣品中的外源基因成分。數(shù)據(jù)比對與分析7.5數(shù)據(jù)處理與分析結(jié)果報告根據(jù)數(shù)據(jù)處理與分析的結(jié)果，生成詳細(xì)的測定報告。結(jié)果解讀對測定報告進(jìn)行解讀，明確樣品中轉(zhuǎn)基因成分的種類、含量等信息，為后續(xù)的決策提供依據(jù)。7.6結(jié)果報告與解讀087.1抽樣和制樣7.1抽樣和制樣抽樣方法根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，抽樣應(yīng)確保樣品的代表性和一致性。在抽樣過程中，需要遵循隨機(jī)、公正、科學(xué)的原則，從可能含有轉(zhuǎn)基因成分的植物或其產(chǎn)品中抽取適量樣品，以供后續(xù)檢測使用。制樣流程制樣是確保檢測準(zhǔn)確性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在取得樣品后，應(yīng)按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的流程進(jìn)行制樣，包括樣品的破碎、混合、縮分等步驟，以獲得具有代表性的檢測樣品。同時，制樣過程中應(yīng)避免交叉污染，確保樣品的原始性和準(zhǔn)確性。樣品保存與標(biāo)識制樣完成后，應(yīng)對樣品進(jìn)行妥善保存，并附上清晰的標(biāo)識，包括樣品名稱、來源、抽樣日期等信息，以便于后續(xù)的檢測和追溯。7.1抽樣和制樣質(zhì)量控制：在抽樣和制樣過程中，應(yīng)嚴(yán)格遵守質(zhì)量控制要求，確保樣品的真實性和可靠性。必要時，可對抽樣和制樣過程進(jìn)行監(jiān)督和檢查，以確保整個流程的規(guī)范性和準(zhǔn)確性。通過嚴(yán)格的抽樣和制樣流程，可以確保后續(xù)轉(zhuǎn)基因成分測定的準(zhǔn)確性和可靠性，為植物轉(zhuǎn)基因成分的檢測提供有力支持。097.2DNA提取與純化提取方法采用適合植物組織的DNA提取方法，確保高效、穩(wěn)定地提取出DNA。提取過程中要注意避免DNA的降解和污染，以保證后續(xù)測序的準(zhǔn)確性。純化步驟去除提取液中的雜質(zhì)，如蛋白質(zhì)、RNA和多糖等，以獲取高純度的DNA。使用合適的純化試劑和柱式純化方法，確保DNA的完整性和純度。對提取和純化后的DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測，包括濃度、純度和完整性的評估。采用適當(dāng)?shù)臋z測方法，如紫外分光光度法、凝膠電泳等，確保DNA質(zhì)量符合測序要求。質(zhì)量控制注意事項在提取和純化過程中，要嚴(yán)格遵守實驗室安全規(guī)范，確保人員和環(huán)境的安全。對于不同種類的植物組織，可能需要調(diào)整提取和純化的條件，以獲得最佳的效果?！啊?07.3文庫構(gòu)建文庫構(gòu)建的目的文庫構(gòu)建是目標(biāo)序列測序法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其目的是將待測樣本的DNA片段化、連接接頭、并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從而構(gòu)建一個代表原始樣本DNA的文庫，以便進(jìn)行后續(xù)的高通量測序。7.3文庫構(gòu)建“步驟概述：2.**連接接頭**：片段化的DNA兩端會連接上特定的接頭序列，這些接頭將在后續(xù)的PCR擴(kuò)增和測序過程中起到關(guān)鍵作用。1.**DNA片段化**：首先，需要將樣本DNA進(jìn)行片段化，這通常通過物理方法（如超聲波破碎）或酶切來實現(xiàn)，以獲得適當(dāng)大小的DNA片段。7.3文庫構(gòu)建7.3文庫構(gòu)建3.**PCR擴(kuò)增**通過PCR技術(shù)，對連接了接頭的DNA片段進(jìn)行擴(kuò)增，以增加文庫中DNA的數(shù)量，確保測序時有足夠的模板。關(guān)鍵參數(shù)與質(zhì)量控制在文庫構(gòu)建過程中，需要嚴(yán)格控制各個步驟的條件和時間，以確保文庫的質(zhì)量和代表性。此外，還需要對文庫進(jìn)行質(zhì)量檢測，如使用生物分析儀或QPCR等方法來評估文庫的大小分布和濃度。對測序結(jié)果的影響文庫構(gòu)建的質(zhì)量直接影響到后續(xù)的測序結(jié)果。一個優(yōu)質(zhì)的文庫能夠確保測序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可靠性，從而提高轉(zhuǎn)基因成分檢測的靈敏度和特異性。117.4高通量測序技術(shù)應(yīng)用高通量測序技術(shù)在該標(biāo)準(zhǔn)中扮演著核心角色，它使得對植物轉(zhuǎn)基因成分的精確測定成為可能。通過高通量測序，可以一次性對大量DNA分子進(jìn)行序列測定，從而高效地檢測出植物中的外源基因和轉(zhuǎn)基因品系。操作流程在進(jìn)行高通量測序前，需要對待測樣品進(jìn)行DNA提取和純化，確保獲得高質(zhì)量的DNA模板。隨后，利用特定的引物對目標(biāo)序列進(jìn)行擴(kuò)增，以富集目標(biāo)DNA片段。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過純化后，即可進(jìn)行高通量測序。測序完成后，通過對測序數(shù)據(jù)的生物信息學(xué)分析，可以準(zhǔn)確識別出植物中的轉(zhuǎn)基因成分。7.4高通量測序優(yōu)勢與特點高通量測序技術(shù)具有高靈敏度、高分辨率和高通量的特點，能夠同時檢測多個樣品，大大提高了檢測效率。此外，該技術(shù)還可以提供豐富的遺傳信息，有助于更深入地了解轉(zhuǎn)基因植物的遺傳背景和潛在風(fēng)險。標(biāo)準(zhǔn)中的規(guī)定在《植物轉(zhuǎn)基因成分測定目標(biāo)序列測序法GB/T38570-2020》中，對高通量測序技術(shù)的操作流程、數(shù)據(jù)分析方法和結(jié)果解讀等方面都進(jìn)行了詳細(xì)的規(guī)定。這些規(guī)定確保了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，為轉(zhuǎn)基因植物的安全評估和監(jiān)管提供了有力支持。7.4高通量測序“128質(zhì)量控制樣品代表性確保所采集的樣品具有代表性，能夠真實反映被檢測植物及其產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因成分情況。樣品處理按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的方法對樣品進(jìn)行處理，包括破碎、研磨、提取等步驟，以保證后續(xù)檢測的準(zhǔn)確性。8.1樣品采集與處理試劑純度使用高純度的試劑，減少雜質(zhì)對檢測結(jié)果的影響。材料來源確保所使用的材料來源可靠，避免使用受污染或變質(zhì)的材料。8.2試劑與材料的質(zhì)量控制8.3儀器設(shè)備的質(zhì)量控制設(shè)備維護(hù)做好儀器設(shè)備的日常維護(hù)和保養(yǎng)工作，延長其使用壽命并保證檢測精度。儀器校準(zhǔn)定期對檢測儀器進(jìn)行校準(zhǔn)，確保其準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。采用高準(zhǔn)確度的測序技術(shù)，確保測序結(jié)果的可靠性。測序準(zhǔn)確性保證足夠的測序深度，以捕獲低豐度的轉(zhuǎn)基因成分。測序深度8.4測序過程的質(zhì)量控制數(shù)據(jù)分析方法采用科學(xué)、合理的數(shù)據(jù)分析方法，對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行準(zhǔn)確解讀。結(jié)果復(fù)核對檢測結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信度。同時，對于陽性結(jié)果或疑似陽性結(jié)果，應(yīng)采取進(jìn)一步的確認(rèn)措施，如使用其他方法進(jìn)行驗證或送交專業(yè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行復(fù)核。8.5數(shù)據(jù)分析與結(jié)果解讀的質(zhì)量控制139結(jié)果分析與表述轉(zhuǎn)基因成分判定根據(jù)比對和驗證結(jié)果，判定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，以及含有哪些轉(zhuǎn)基因元件。序列比對將測序得到的序列與已知的轉(zhuǎn)基因元件序列進(jìn)行比對，確定是否存在匹配。序列驗證對于比對上的序列，需要進(jìn)一步驗證其準(zhǔn)確性，包括PCR擴(kuò)增和Sanger測序等方法。9.1結(jié)果分析9.2結(jié)果表述轉(zhuǎn)基因成分信息在結(jié)果中應(yīng)明確表述檢測到的轉(zhuǎn)基因成分，包括轉(zhuǎn)基因元件的名稱、來源以及其在樣品中的具體情況。檢測結(jié)果概述對檢測結(jié)果進(jìn)行簡要概述，說明樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，以及這些成分可能對環(huán)境和健康的影響。報告格式結(jié)果報告應(yīng)按照規(guī)定的格式進(jìn)行編寫，包括標(biāo)題、檢測單位、樣品信息、檢測方法、檢測結(jié)果、結(jié)論以及建議等內(nèi)容。同時，報告應(yīng)清晰、簡潔、易于理解，方便使用者閱讀和參考。149.1結(jié)果分析確定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分通過目標(biāo)序列測序法，可以準(zhǔn)確地檢測出植物樣品中是否含有外源基因或轉(zhuǎn)基因品系，從而進(jìn)行定性分析。判定轉(zhuǎn)基因品系根據(jù)測序結(jié)果，可以確定樣品中含有的轉(zhuǎn)基因品系類型，有助于對轉(zhuǎn)基因作物進(jìn)行標(biāo)識和管理。9.1.1定性分析VS通過計算外源基因與內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)基因間的拷貝數(shù)比，可以了解轉(zhuǎn)基因成分在樣品中的含量，該方法的定性檢出低限（LOD）為0.1%。轉(zhuǎn)基因成分含量評估根據(jù)定量分析的結(jié)果，可以評估轉(zhuǎn)基因成分在植物樣品中的具體含量，為轉(zhuǎn)基因作物的安全性和標(biāo)注提供重要依據(jù)。外源基因拷貝數(shù)比9.1.2定量分析嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作流程為確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，實驗人員需嚴(yán)格遵循GB/T38570-2020標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的操作流程。9.1.3結(jié)果解讀注意事項注意實驗室質(zhì)量控制實驗室應(yīng)建立完善的質(zhì)量控制體系，確保實驗結(jié)果的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。結(jié)合其他檢測方法目標(biāo)序列測序法雖然具有較高的靈敏度和特異性，但在實際應(yīng)用中，仍建議結(jié)合其他檢測方法，如PCR、Southern印跡等，以獲得更為全面和準(zhǔn)確的檢測結(jié)果。159.2結(jié)果表述測序結(jié)果應(yīng)準(zhǔn)確反映目標(biāo)序列的堿基組成，確保無誤差或遺漏。序列準(zhǔn)確性測序結(jié)果應(yīng)覆蓋整個目標(biāo)序列，確保信息的全面性和可靠性。序列完整性測序結(jié)果應(yīng)能夠明確區(qū)分目標(biāo)序列與非目標(biāo)序列，避免混淆或誤判。序列特異性9.2.1序列測定結(jié)果010203根據(jù)測序結(jié)果，識別并判定樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分。轉(zhuǎn)基因成分識別確定樣品中含有的轉(zhuǎn)基因種類，為后續(xù)研究和分析提供依據(jù)。轉(zhuǎn)基因種類鑒定根據(jù)測序數(shù)據(jù)的豐度信息，估算樣品中轉(zhuǎn)基因成分的含量。轉(zhuǎn)基因含量估算9.2.2結(jié)果解讀與判定結(jié)果報告內(nèi)容記錄應(yīng)詳細(xì)、完整，包括實驗過程、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果解讀等，以便后續(xù)追溯和復(fù)查。結(jié)果記錄要求結(jié)果保密性對于涉及商業(yè)機(jī)密或個人隱私的結(jié)果，應(yīng)嚴(yán)格保密，確保信息安全。報告應(yīng)包括測序結(jié)果、解讀與判定、含量估算等關(guān)鍵信息，確保結(jié)果的清晰易懂。9.2.3結(jié)果報告與記錄1610防污染措施10防污染措施實驗室環(huán)境控制為確保測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，實驗室應(yīng)采取嚴(yán)格的環(huán)境控制措施。這包括定期清潔和消毒實驗室空間，以及控制實驗室內(nèi)的溫度、濕度和塵埃等環(huán)境因素，以減少外部污染對實驗結(jié)果的影響。實驗器材和試劑的管理實驗過程中使用的所有器材和試劑都應(yīng)進(jìn)行嚴(yán)格的管理。器材應(yīng)經(jīng)過徹底的清洗和消毒，確保無殘留物；試劑則應(yīng)儲存在適當(dāng)?shù)臈l件下，避免受潮、污染或變質(zhì)。操作人員的培訓(xùn)實驗操作人員應(yīng)接受專業(yè)的培訓(xùn)，了解并遵循實驗室的防污染措施。這包括正確穿戴實驗服、手套和護(hù)目鏡等防護(hù)裝備，以及掌握正確的實驗操作技巧，避免在操作過程中引入污染。在樣品的采集、處理和保存過程中，應(yīng)特別注意防止污染。樣品應(yīng)存放在無菌容器中，并盡快進(jìn)行分析，以減少與外界的接觸時間和污染風(fēng)險。樣品的處理和保存實驗過程中產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)妥善處理，以防止對環(huán)境造成污染。廢棄物應(yīng)分類收集，并按照相關(guān)規(guī)定進(jìn)行無害化處理或回收利用。廢棄物的處理10防污染措施17附錄A(規(guī)范性附錄)探針序列探針序列的重要性探針序列在目標(biāo)序列測序法中起著至關(guān)重要的作用，它們是特定設(shè)計的寡核苷酸片段，能夠與目標(biāo)DNA序列特異性結(jié)合，從而實現(xiàn)對特定基因序列的準(zhǔn)確檢測。探針序列的設(shè)計原則探針序列的設(shè)計需遵循一定的原則，包括序