僅需12步，助你做出完美免疫組化IHC片子溫故而知新今天翹仔將梳理免疫組化（IHC）實驗的12步經(jīng)典操作，逐個擊退IHC實驗道路上的“攔路虎”，讓萌新打好基礎，老手鞏固知識，帶著滿滿的干貨輕松愉快的搞定免疫組化。IHC作為免疫學實驗的“三件套”之一，廣泛用于基礎研究和臨床病理診斷。基礎研究中，IHC可確定細胞內(nèi)的抗原，及進行定位、定性和定量分析。臨床病理診斷，IHC可用于確定腫瘤的來源、分類和評估預后效果。老生常談：什么是IHC？做實驗就要銘記原理，做到胸有成竹。簡而言之，免疫組化IHC是利用抗原抗體反應確定組織細胞內(nèi)抗原，并通過染色實現(xiàn)可視化。IHC實驗原理IHC是一種能讓我們在組織切片中找到目的蛋白的超級強大技術(shù)。IHC技術(shù)為我們打開了一扇窗，直接觀察蛋白質(zhì)在細胞和組織中的精準定位。IHC看似簡單，操作過程中卻存在許多變量。每次開始實驗之前，我們都應該來一次“捫心自問”。IHC實驗必備根據(jù)不同的染色步驟、標記物和結(jié)合方式，IHC染色方法多樣，比較常用的有間接法、酶標法、免疫熒光法等。IHC實驗分類為了提高IHC檢測的靈敏度和特異性，操作步驟不斷更新?lián)Q代，但最主要的還是一抗的質(zhì)量。義翹神州推出近百種病理驗證免疫組化抗體，均為高特異性單克隆抗體。為助力IHC研究，義翹神特推出抗體免費試用限時活動，歡迎大家掃碼申請試用！老生暢談：怎么做IHC？操作繁瑣，只需靜下來慢下來，慢慢閱讀，總會做出滿意的結(jié)果！石蠟切片的IHC實驗一般包括12個步驟：取樣、固定、包埋、切片、脫蠟水化、抗原修復、滅活、封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯色、封片觀察。1、取樣正取的組織取樣是IHC成功的第一步。操作關鍵點：1）組織塊要大小適中，一般為1.5*1.5*0.5cm3，過大會影響固定液的滲透。2）刀要快手要穩(wěn)，取病理材料時勿擠壓（防止組織變形）、勿刮抹（以防缺損），避免機械損傷、化學損傷、組織風干等。3）初步處理：如果組織樣本帶有血液或其他體液，應先用生理鹽水或PBS進行沖洗，去除可能影響固定效果的物質(zhì)；大體積組織可在固定前適當切割，確保組織厚度小于0.5cm。4）病變組織取材：若有肉眼可視病變，取準標本病變部位，切勿漏?。蝗粲心[瘤，包括腫瘤轉(zhuǎn)移部位、切緣等全面描述病變狀況，由表及里觀察病變狀況測重量、記錄部位和臟器重量。5）根據(jù)實驗方法、目的、病變等盡量多取材，選取的組織材料要包括各臟器的主要結(jié)構(gòu)。為了檢查IHC實驗流程的有效性和排除假陰性，需要設置陽性組織對照，同樣為了檢查是否存在非特異性結(jié)合和去除假陽性，需要陰性組織對照。6）取材要及時，固定也要及時，建議組織取樣后立即固定。7）及時、準確的記錄每一個組織的名稱、種屬、類型、取材時間、臨床信息、組織塊數(shù)量等基本信息。2、固定目的：防止組織細胞自溶與腐敗，保存組織細胞的抗原不發(fā)生彌散和損失。10%中性福爾馬林固定是目前應用最廣泛且效果較好的固定方式。操作關鍵點：1）根據(jù)抗原類型選擇合適的固定液，如下表：-固定液大多數(shù)蛋白質(zhì)、肽和酶組織切片：10%中性福爾馬林細胞樣本：4%多聚甲醛大分子抗原（如免疫球蛋白）冰浴的丙酮或甲醇（100%）氨基酸等小分子4%多聚甲醛核酸Carnoy固定液細胞核形態(tài)福爾馬林-硫酸鋅溶液精細組織Bouin固定液造血器官（如肝、脾、骨髓）Zenker固定液2）確保組織完全浸入固定液中，固定液體積一般是組織的10-20倍。3）組織離體后盡快固定，最理想是在幾分鐘內(nèi)完成。4）固定時間視組織類型和實驗要求定，一般為室溫6-48h。固定時間不宜過長，防止組織過度硬化和抗原損失。5）固定的容器要干凈、無雜質(zhì)，避免污染組織。6）固定完成后，將組織從固定液中取出，用流水沖洗數(shù)分鐘，去除殘留的固定液和可能產(chǎn)生的結(jié)晶。3、包埋目的將組織樣本浸入固體介質(zhì)（常用石蠟）中，保存組織形態(tài)，在切片時保存完整性，制作厚度合適的薄切片。操作關鍵點：脫水：常用不同濃度的酒精進行脫水。不同的實驗室根據(jù)操作經(jīng)驗選擇不同的乙醇濃度及處理時間，如表中所示，為義翹神州常用的梯度脫水體系，供大家參考：脫水梯度處理時間50%乙醇1h70%乙醇1h80%乙醇1h95%乙醇2h100%乙醇1h100%乙醇1h2）透明：脫水后樣本中會含有酒精或其他溶劑，變得不透明，需要使用透明劑（如二甲苯）處理。一般選擇二甲苯浸泡2次，每次30min。3）浸蠟：將樣本放入熔化的石蠟中，充分滲透。為了充分去除樣本中的二甲苯，可以間隔1-2h換一次石蠟。4）包埋：將組織塊轉(zhuǎn)移至已倒入熔化石蠟的模具中，在烘箱中放置30min，使組織塊內(nèi)的石蠟與包埋中的石蠟互溶。對組織塊立樣，確保包埋面滿足實驗需求。然后將模具置于室溫，使其完全冷卻凝固。取出石蠟塊，并做好標記。確定包埋面：操作關鍵點：1、基本要求：包埋水平面應高低一致，排列方向一致。矩形組織塊其邊緣應與包埋模具平行。多數(shù)組織通常放置于模具中央，最大橫徑與蠟塊最多橫徑保持一致。2、碎組織應聚攏平鋪包埋，排列方向應一致且在同一水平面。3、皮膚、腸、膽囊和其他上皮組織，上皮層垂直包埋面放置，組織切面向下，使切片能顯示各層組織結(jié)構(gòu)。羊膜等長膜狀組織制成卷狀放置。4、診刮獲得的子宮內(nèi)膜等同一類型的多個組織應中央放置。5、動脈、靜脈、輸卵管、輸精管等管狀組織橫切面向下放置。6、線性長組織應對角線方向放置。穿刺標本每條展開，整齊排列且留有空隙。7、肌肉活檢組織需要橫線和縱向均有放置。8、實質(zhì)性臟器組織或腫瘤組織一般按最大面進行包埋，有特殊要求的組織需按取材時預先標記面進行包埋。4、切片注意事項：控制好切片機速度和刀片的鋒利度，以獲得高質(zhì)量切片；切片厚度一般為3-5微米；要及時對切片進行處理，避免抗原損失和組織變性。操作關鍵點：1）確保包埋后的組織塊已充分冷卻凝固。修整蠟塊為標準大小，室溫高時可將蠟塊置于冰盒，使其保持合適的硬度。2）需對刀片進行處理：非一次性刀片應在使用前磨刀10-15分鐘，手觸刀片有針刺感。一次性刀片要注意更換，一般超過6-8個蠟塊或切片出現(xiàn)刀痕時進行更換。3）切片：將組織塊固定在切片機樣本夾上，調(diào)整切片機的切片厚度。切片時要及時清潔刀口、除去蠟屑，否則易引起破碎。操作切片機應用力均勻平穩(wěn)，轉(zhuǎn)移以40-60r/min為宜。4）展片：使用刷子或毛筆輕輕地將切好的組織切片從刀上取下，并放在溫水（40-45℃）中展開。5）貼片：待切片充分推開展平后，將載玻片垂直插入水中以毛面輕靠切片，并用毛筆將切片一邊披于玻片上，隨即快速將玻片直立提起，避免產(chǎn)生氣泡。組織最好居于載玻片中間位置，太靠下不利于后面掃片，太高修復時容易干片。6）烤片：烤片機或恒溫箱，60-65℃烤片1-2h。5、脫蠟水化注意事項：脫蠟要徹底、干凈。脫蠟不全會出現(xiàn)非特異性背景著色。在整個脫蠟水化過程中，切片應始終保持濕潤狀態(tài)，避免干燥，干燥同樣會出現(xiàn)高背景染色。操作關鍵點：1）脫蠟：將從烤片機中取出的切片置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除其上的石蠟。一般會依次在二甲苯I、II、III各浸泡5-10min。2）水化：將切片從二甲苯中取出后，進行乙醇梯度水化，依次置于100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、85%乙醇和70%乙醇中，每次5min，再放入純化水中浸泡5min，不能直接對著切片沖洗。切片脫蠟水化的具體步驟和時間可根據(jù)樣本性質(zhì)和實驗室條件進行微調(diào)。義翹神州結(jié)合多年IHC操作經(jīng)驗，形成一套獨有的實驗體系，希望能對大家的操作提供參考。義翹神州脫蠟水化步驟：a.將切片放入二甲苯洗液中孵育2次，每次15min；b.將切片放入100%乙醇中孵育2min；c.將切片放入95%乙醇中孵育2min；d.將切片放入80%乙醇中孵育2min；e.將切片放入70%乙醇中孵育2min；f.用dH2O浸泡5min。6、抗原修復注意事項：使細胞內(nèi)抗原決定簇重新暴露，“滿血復活”，提高抗原檢測率。常用的抗原修復液有檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）、EDTA緩沖液（pH8.0-9.0）、Tris-EDTA緩沖液（pH9.0-10.0）及胰酶。操作關鍵點：組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中，部分抗原發(fā)生蛋白之間的交聯(lián)及醛基的封閉，從而失去抗原活性?？乖迯湍軌蛱岣逫HC實驗中抗體與抗原結(jié)合率，增強信號和特異性，是免疫組化中不可忽略的關鍵步驟。沒有一種抗原修復液可以適用于所有抗原，同一組織用不同pH值修復液獲得染色結(jié)果強度不一樣。建議測試多種方案以選擇最合適的抗原修復液?？乖迯头椒煞譃闊嵴T導修復和酶誘導修復，前者包括高壓修復、微波修復、煮沸修復。組織類型不同選擇的修復方法有差別，如質(zhì)地較脆、高溫高壓易脫片的骨或軟骨組織，及組織本身切面較小的坐骨神經(jīng)，一般選擇微波修復。不同修復方法在不同實驗室的具體操作過程中會存在差異，以下僅供參考：1）高壓修復：將抗原修復液倒入高壓鍋中，先加熱煮沸（不加蓋氣閥），然后將切片放入，蓋好高壓鍋蓋并加蓋氣閥，加熱至啟發(fā)升起。計時3-5min后，停止加熱。高壓結(jié)束后，將高壓鍋置于水槽的水流下降溫，待降到室溫后打開蓋子，取出載玻片架。注意整個修復過程，切片始終浸泡在修復液中。2）微波修復：將抗原修復液倒入切片盒中，在組織修復前置于微波爐中高檔加熱至沸騰。將處理好的切片放入熱的修復液中，微波爐調(diào)至中檔，持續(xù)加熱15min。期間注意觀察切片盒中修復液損失情況，保證切片全部浸泡其中。修復完成后將切片盒從微波爐取出，冷卻至室溫。3）煮沸修復：先將抗原修復液倒入切片盒中，放入沸騰的水浴鍋中預熱。然后放入切片，維持沸騰狀態(tài)40-60min，修復完成后室溫冷卻。酶修復：常用的消化酶有胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K等。在載玻片置于酶液中，37°C，處理20min。具體反應溫度和時間需要摸索。7、滅活內(nèi)源性酶和活性物質(zhì)會造成背景噪音，降低反應特異性。一般用3%的H2O2溶液處理切片10min，以消除細胞或組織中內(nèi)源性酶的影響。注意事項：滅活后用PBS或TBS緩沖液洗滌切片、浸泡2次，5min/次。H2O2需現(xiàn)用現(xiàn)配，且4℃避光保存。H2O2孵育時間不宜過長，否則容易脫片。肝臟、胎盤、血管瘤、急性炎癥組織等含有的過氧化物豐富，需要3%的H2O2溶液處理10min后，再用0.5%的高碘酸溶液阻斷10min。部分組織含有內(nèi)源性堿性磷酸酶，可用左旋咪唑進行滅活。8、封閉為降低背景信號及減少假陽性，需對切片進行封閉。一般選用血清、BSA等封閉非特異性結(jié)合位點。操作關鍵點：可用“祖?zhèn)鳌钡挠托怨P畫圈方法，將血清滴加到圈內(nèi)的組織上，室溫或37°C孵育10-30min，使封閉液與組織切片充分反應。最后用濾紙吸去多余的血清。注意事項：血清需與二抗同源，不能與一抗同源，如二抗是山羊抗兔，就要選擇非免疫羊血清。根據(jù)二抗系統(tǒng)中是否含有生物素選擇封閉劑，如無生物素可以不封閉。封閉時間要合適。封閉過長會導致陽性信息減弱甚至出現(xiàn)假陰性，不足會導致背景增強甚至出現(xiàn)假陽性。9、一抗孵育免疫組化實驗成功的關鍵在于一抗的選擇?；驹瓌t是選擇特異性強、靈敏度高、背景低的抗體，經(jīng)過IHC驗證的抗體?？贵w特異性包括組織特異性、細胞特異性、亞定位特異性。一般單抗特異性強，但親和力相對小，而多抗特異性弱，親和力強。操作關鍵點：1）一抗選擇：需根據(jù)實驗目的選擇一抗，一抗應與靶抗原的種屬、類型一致。2）一抗稀釋：根據(jù)抗體說明書及實驗要求，選擇合適的工作濃度，并選擇適當?shù)南♂屢哼M行稀釋。3）一抗孵育：取50-100μl稀釋好的一抗滴加到“圈內(nèi)”組織，37℃孵育1小時或4℃過夜。建議在濕盒中進行抗體孵育，防止干片。小提示：4℃過夜可以使低親和力抗原更好的結(jié)合到抗體。一般過夜后需將切片室溫放置復溫45min，可以防止脫片及抗原抗體結(jié)合更穩(wěn)定。充分洗滌組織切片，去除未結(jié)合的一抗和其他雜質(zhì)，減少背景染色。義翹神州選擇用PBS溫柔沖洗8分鐘。10、二抗孵育二抗與一抗結(jié)合，增強信號和特異性。二抗會帶有酶標記（如HRP、AP等）、熒光素標記（如FITC、Alexa-Fluor?等）或生物素標記（Biotin），標記物便于在顯微鏡下觀察靶抗原在組織中的分布和表達情況。操作關鍵點：1）二抗稀釋：按照二抗說明書進行稀釋。2）二抗孵育：將二抗滴加到組織切片上，室溫或37℃孵育20-60min。3）充分洗滌切片：為防止一抗、二抗等試劑殘留造成非特異性染色，需要適當加強清洗，如延長時間和增加次數(shù)。義翹神州一般選擇用PBS清洗8次，每次1min。11、顯色底物在酶作用下形成有色沉淀，通常為棕色（HRP-DAB體系）或藍色（AP-BCIP體系）。顯色時應在顯微鏡下觀察切片，及時終止顯色反應。注意事項：A.DAB顯色時間不固定，由顯微鏡下觀察控制，在出現(xiàn)淺棕色時即可進行沖洗。B.如果DAB顯色幾秒或幾十秒就出現(xiàn)很深的棕褐色，可能是抗體濃度過高或抗體孵育時間太長造成，需要降低抗體濃度或縮短孵育時間。C.如果在很短時間內(nèi)出現(xiàn)很深背景，可能是封閉做的不到位，需要延長封閉時間。D.如果DAB顯色超過10分鐘才出現(xiàn)陽性染色，可能是抗體濃度低或孵育時間短，也可能是封閉時間太長。E.注意防護：DAB為聯(lián)苯偶氨化合物，可誘發(fā)皮膚癌或膀胱癥，在顯色操作過程中做好防護。12、封片觀察封片觀察是IHC實驗操作的最后步驟。為了觀察到細胞輪廓，更好定位靶蛋白，可在封片之前進行復染。操作關鍵點：1）復染：義翹神州采用蘇木精復染4分鐘，自來水洗，鹽酸酒精分化2秒，返藍20-40分鐘。2）脫水：一般選擇乙醇梯度脫水，由低到高依次為50%、70%、95%、100%各2min，二甲苯5min使切片透明化。義翹神州摸索出一套簡便步驟，供大家參考：無水乙醇2次，每次2min，二甲苯2次，每