畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌檢測三重?cái)?shù)字Detectionoftypicalpathogenicbacteriainlivest2024-07-01發(fā)布2024-09-01實(shí)施天津市市場監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布IDB12/T1328—2024本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測所、天津市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心、新疆農(nóng)墾科學(xué)院、天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：杜連柱、程深偉、張克強(qiáng)、梁雨、王健春、尹春博、劉福元、郜興亮、楊井泉、蘇蔡。1DB12/T1328—2024畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌檢測三重?cái)?shù)字PCR法本文件規(guī)定了畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌的三重?cái)?shù)字PCR檢測方法的原理、試劑和材料、儀器設(shè)備、操作步驟、結(jié)果分析與表述及生物安全措施。本文件適用于天津市畜禽養(yǎng)殖糞污中金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌0157:H7、沙門氏菌的快速定量檢測。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對(duì)應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改單)適用于本文件。GB/T6682—2008分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB19489—2008實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求GB/T25171—2023畜禽養(yǎng)殖環(huán)境與廢棄物管理術(shù)語GB/T27403—2008實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測GB/T27522—2023畜禽養(yǎng)殖污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范SN/T4853轉(zhuǎn)基因大米定量檢測數(shù)字PCR法SN/T5334.1—2020轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的數(shù)字PCR檢測方法第1部分：通用要求與定義3術(shù)語和定義GB/T25171—2023、SN/T5334.1—2020界定的術(shù)語和定義適用于本文件。微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)采用毛細(xì)通道網(wǎng)格將數(shù)萬個(gè)微滴離散進(jìn)入2D芯片，從而有效地實(shí)現(xiàn)反應(yīng)體系的精準(zhǔn)分割。該系統(tǒng)利用金黃色葡萄球菌的nue、大腸埃希氏菌0157:H7的rfbE以及沙門氏菌的Fiml特異性基因序列對(duì)畜禽養(yǎng)殖糞污中典型致病菌進(jìn)行檢測。在PCR擴(kuò)增后，通過泊松分布校正陽性微滴的數(shù)量和比例，可以準(zhǔn)確計(jì)算靶基因序列的起始拷貝數(shù)或濃度，從而同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)三種病原體的快速定量檢測。5儀器和設(shè)備所需儀器和設(shè)備如下：a)微滴生成系統(tǒng)；b)PCR儀；c)微滴閱讀分析系統(tǒng)；d)高速冷凍離心機(jī)：控溫4℃~8℃,離心力不小于12000g/min;e)分析天平：精度0.01g;2DB12/T1328—2024f)恒溫水浴箱：95℃±1℃;g)濕熱高壓蒸汽滅菌器；h)恒溫振蕩搖床：控溫28℃±1℃~37℃±1℃,轉(zhuǎn)速在125r/min~250r/min;i)生物安全柜；j)組織研磨儀；k)冰箱：控溫0℃~4℃;1)超低溫冰箱：控溫-20℃~-80℃;m)微量移液器：0.5μL~10μL,20μL~200μL,100μL~1000μL;n)超微量紫外分光光度計(jì)；o)無菌離心管：1.5mL,15mL,50mL。6試劑和材料6.1除另有規(guī)定外，所有試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682—2008規(guī)定的一級(jí)水。6.2所需試劑和材料如下：a)5×dPCR預(yù)混液；c)裂解液：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide,十六烷基三甲基溴化銨),100mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane,三羥甲基氨基甲烷),1.4mol/LNaCl,20mmol/LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacid,乙二胺四乙酸),用HCl調(diào)至pH8.0;d)無水乙醇；f)DNAoff防核酸污染用劑；g)熒光素鈉鹽。6.3引物和探針6.3.1金黃色葡萄球菌nuc基因引物和探針nuc上游引物：5'-CCTGAAGCAAGTGCATTTACGA-3'nuc下游引物：5'-CTTTAGCCAAGCCTTGACGAACT-3'nuc探針：5'-(HEX)-TGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATG-(BHQ1)-3'6.3.2大腸埃希氏菌0157:H7rfbE基因引物和探針rfbE上游引物：5'-TCAAAAGGAAACTATATTCAGAAGTTTGA-3'rfbE下游引物：5'-CGATATACCTAACGCTAACAAAGCTAA-3'rfbE探針：5'-(CY5)-AATAAATTTGCGGAACAAAACCATGTGCAA-(BHQ3)-3'6.3.3沙門氏菌的FimY基因引物和探針FimY上游引物：5'-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3'FimY下游引物：5'-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3'FimY探針：5'-(FAM)-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-(BHQ1)-3'7操作步驟3DB12/T1328—20247.1采樣物品采樣容器應(yīng)經(jīng)121℃、20min高壓滅菌或使用一次性無菌器具。其余采用所用工具、文具和安全防護(hù)用品等應(yīng)按照GB/T27522—2023中第7章規(guī)定執(zhí)行。7.2采樣方法參照GB/T36197進(jìn)行畜禽養(yǎng)殖糞污樣品的采集。7.3樣品運(yùn)輸與保存樣品在運(yùn)輸過程中應(yīng)4℃以下保存并及時(shí)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室檢測。如當(dāng)日送樣不能及時(shí)檢測，應(yīng)將樣品放入0℃~4℃冰箱保存，放置時(shí)間不超過24h。若長期保存，應(yīng)放置于-80℃凍存。保存期間避免反復(fù)凍融。7.4DNA的制備按照7.1-7.3采集的畜禽養(yǎng)殖糞污，稱取3.0g,加入到含有5mL裂解液的15mL無菌離心管中，并使用組織研磨儀充分混勻。將離心管移至95℃恒溫水浴鍋中孵育15min,孵育期間振蕩2次~3次。12000g/min,4℃~8℃低溫離心10min,轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中。加入等體積氯仿，混勻后，12000g/min,4℃~8℃低溫離心5min。吸取上清至新的無菌離心管中，加入0.6倍體積預(yù)冷的異丙醇，混勻。12000g/min,4℃~8℃低溫離心5min,輕輕倒去上清液，倒置于吸水紙上，吸干液體。加入500μL75%乙醇，顛倒洗滌，12000g/min,4℃~8℃低溫離心5min棄去上清，晾干。沉淀溶于20μL一級(jí)水中，保存在-20℃?zhèn)溆谩ｊ栃詫?duì)照樣品也應(yīng)采取上述DNA制備形式。整體操作步驟也可以使用等效商品化DNA提取試劑盒并按其說明書制備模板DNA。7.5DNA濃度的測量DNA濃度的測量方法和對(duì)DNA模板濃度的要求應(yīng)符合SN/T4853的規(guī)定。7.6三重?cái)?shù)字PCR反應(yīng)體系在試劑配制區(qū)進(jìn)行ddPCR體系配置。畜禽養(yǎng)殖糞污中同時(shí)檢測金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌0157:H7、沙門氏菌的三重?cái)?shù)字PCR檢測體系見表1(25μL反應(yīng)體系):表1數(shù)字PCR反應(yīng)體系試劑成分體積(μL)5×dPCR預(yù)混液nuc上游引物(10μmol/L)nuc下游引物(10μmol/L)nuc探針(10μmol/L)0.5rfbE上游引物(10μmol/L)rfbE下游引物(10μmol/L)rfbE探針(10μmol/L)0.5FimY上游引物(10μmol/L)4DB12/T1328—2024FimY下游引物(10μmol/L)FimY探針(10μmol/L)0.5DNA模板(1~100ng/μL)一級(jí)水熒光素鈉鹽(1μmol/L)2.57.7對(duì)照和平行每次檢測應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照和陽性對(duì)照。空白對(duì)照(陰性對(duì)照)用一級(jí)水替代樣品DNA。陽性對(duì)照采用陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。每個(gè)待檢樣品提取的DNA溶液以及空白和陽性對(duì)照都應(yīng)進(jìn)行3個(gè)平行樣本的檢測。陽性標(biāo)準(zhǔn)品：含有金黃色葡萄球菌nuc基因、大腸埃希氏菌rfbE基因和沙門氏菌FimY基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。也可使用自行提取的陽性標(biāo)準(zhǔn)菌株核酸。7.8微滴生成和PCR反應(yīng)在樣本制備區(qū)進(jìn)行，利用微滴生成擴(kuò)增系統(tǒng)完成25μL反應(yīng)體系分割和PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件：95℃,5min,1個(gè)循環(huán)；95℃,15s,60℃,1min,45個(gè)循環(huán)；98℃,5min,1個(gè)循環(huán)；4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。整體反應(yīng)期間升降溫度速度均為1℃/s。7.9微滴讀數(shù)利用微滴閱讀分析系統(tǒng)對(duì)數(shù)字PCR反應(yīng)進(jìn)行熒光信息采集和分析。8結(jié)果分析與表述8.1閾值設(shè)定根據(jù)數(shù)字PCR結(jié)果中陰性分割體系的終點(diǎn)熒光值設(shè)定熒光的閾值限。閾值限需要對(duì)陰性和陽性擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行明顯的區(qū)分。8.2質(zhì)量控制同時(shí)滿足以下條件，實(shí)驗(yàn)為有效：a)數(shù)字PCR有效分割體系數(shù)不低于理論分割體系數(shù)的60%;b)空白對(duì)照(陰性對(duì)照):三個(gè)通道(分別代表金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌0157:H7和腸炎沙門氏菌)均無擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號(hào)小于閾值，且每個(gè)通道的陽性微滴數(shù)<1;c)陽性對(duì)照：三個(gè)通道(分別代表金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌0157:H7和腸炎沙門氏菌)有明顯的擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號(hào)大于閾值，且每個(gè)通道的陽性微滴數(shù)都≥1;d)每份樣品的3個(gè)平行重復(fù)檢測結(jié)果相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過25%。8.3結(jié)果換算樣品典型致病菌濃度換算見公式(1):5…………(1)C——畜禽糞污樣品中某一典型致病菌含量(拷貝數(shù)/mL);Nmean——25μL反應(yīng)體系中測得核酸拷貝值的平均值(拷貝數(shù));V?——提取DNA的終體積(μL);V?——ddPCR反應(yīng)體系中加入的DNA模板體積(μL);V?——提取DNA時(shí)吸取的樣品體積(mL);d——用于提取畜禽糞污DNA樣品的稀釋倍數(shù)，如樣品稀釋10倍則為10?1;M——DNA模板的稀釋倍數(shù)8.4結(jié)果判斷樣品FAM通道(沙門氏菌)未得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號(hào)小于閾值，判定樣品檢測結(jié)果為陰性，報(bào)告未檢出沙門氏菌。樣品FAM通道得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號(hào)大于閾值，判定樣品檢測結(jié)果為陽性，報(bào)告檢出沙門氏菌核酸。根據(jù)公式(1)計(jì)算樣品中沙門氏菌含量，報(bào)告為XXX拷貝數(shù)/mL。樣品HEX通道(金黃色葡萄球菌)未得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號(hào)小于閾值，判定樣品檢測結(jié)果為陰性，報(bào)告未檢出金黃色葡萄球菌。樣品HEX通道得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號(hào)大于閾值，判定樣品檢測結(jié)果為陽性，報(bào)告檢出金黃色葡萄球菌。根據(jù)公式(1)計(jì)算樣品中金黃色葡萄球菌含量，報(bào)告為XXX拷貝數(shù)/mL。樣品CY5通道(大腸埃希氏菌0157:H7)未得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號(hào)小于閾值，判定樣品檢測結(jié)果為陰性，報(bào)告未檢出大腸埃希氏菌0157:H7。樣品CY5通道得到擴(kuò)增，擴(kuò)增終點(diǎn)熒光信號(hào)大于閾值，判定樣品檢測結(jié)果為陽性，報(bào)告檢出大腸埃希氏菌0157:H7核酸。根據(jù)(1)計(jì)算樣品中大腸埃希氏菌0157:H7含量，報(bào)告為XXX拷貝數(shù)/mL。9生物安全措施檢測過程中防止交叉污染的措施應(yīng)按照GB/T27403—2008中附錄D的規(guī)定執(zhí)行。應(yīng)由具備資格的工作人員進(jìn)行檢測，并按照GB19489中的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。與樣品接觸過的容器和廢棄物經(jīng)121℃高壓滅菌20min進(jìn)行無害化處理。10定量限和檢出限三重微滴式數(shù)字PCR檢測三種致病菌的定量方法檢測限分別為：沙門氏菌6.97c