合成生物元件、裝置和生物模塊Part,deviceandbioBrickinsyntheticbiology結(jié)構(gòu)與合成生物學(xué)李琬生物物理教研室分子生物學(xué)館212liwan@教學(xué)大綱掌握：元件，裝置，生物模塊連接方法，iGEM，基于基序合成蛋白質(zhì)元件，基于分子相互作用合成蛋白質(zhì)裝置了解：合成生物學(xué)定義，系統(tǒng)，生物模塊特征，生物模塊特征工程氨?；铣擅?，UAA蛋白質(zhì)定向進(jìn)化，基于結(jié)構(gòu)域合成蛋白質(zhì)裝置基本概念合成蛋白質(zhì)元件和裝置合成RNA元件和裝置合成DNA元件和裝置△※※△※△※基本概念合成生物學(xué)元件、裝置、系統(tǒng)生物模塊△※※合成生物學(xué)（syntheticbiology）按照一定的規(guī)律和已有的知識(shí)，設(shè)計(jì)和建造新的生物元件、裝置和系統(tǒng)；重新設(shè)計(jì)已有的天然生物系統(tǒng)為人類的特殊目的服務(wù)?；赪ebofScience的合成生物學(xué)文獻(xiàn)計(jì)量分析SCI-EXPANDED5012篇入庫(kù)時(shí)間為1992~2012年文章類型為論文(Article)檢索策略為TI=“syntheticbiology”O(jiān)R“genecircuit”O(jiān)R“genecircuits”O(jiān)R“geneticcircuit”O(jiān)R“geneticcircuits”O(jiān)R“geneticdevice”O(jiān)R“geneticdevices”O(jiān)R“synthetic1ife”O(jiān)R“syntheticlives”O(jiān)R“synthetictissue”O(jiān)R“synthetictissues”O(jiān)R“syntheticcell”O(jiān)R“syntheticcells”O(jiān)R“syntheticgenome”O(jiān)R“syntheticgenomes”O(jiān)R“syntheticgene”O(jiān)R“syntheticgenes”O(jiān)R“minimalgenome”O(jiān)R“minimalgenomes”O(jiān)R“essentialgene”O(jiān)R“essentialgenes”O(jiān)R“biology,synthetic”．合成生物學(xué)起源于工程應(yīng)用目的在于簡(jiǎn)化復(fù)雜的自然生物系統(tǒng)，將其變?yōu)楹?jiǎn)單、可靠、質(zhì)量可控的模塊或者零件。使用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)來進(jìn)行精確的預(yù)測(cè)和設(shè)計(jì)進(jìn)行不同的組合以獲得預(yù)期的功能在工業(yè)規(guī)模進(jìn)行生產(chǎn)制造元件、裝置、系統(tǒng)（1）元件（2）裝置（3）系統(tǒng)※DNA遺傳密碼——指揮控制生命的軟件細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)所有的生物機(jī)器——生命的硬件借助電子工程的研究方法、基本技術(shù)與工具，對(duì)生命系統(tǒng)軟件和硬件進(jìn)行深入了解。系統(tǒng)元件2元件3元件1裝置1裝置2裝置m元件n……（1）元件（part）具有某種特定功能的核酸或蛋白質(zhì)成分，行使基本功能。啟動(dòng)子編碼區(qū)終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域（2）裝置（device）一個(gè)或多個(gè)元件的組合，它們以確定的邏輯和物理連接，協(xié)調(diào)運(yùn)作，包含一系列生化反應(yīng)，行使規(guī)定的功能。蛋白質(zhì)生成裝置：產(chǎn)生具有一定功能蛋白質(zhì)的裝置。報(bào)告基因：編碼熒光蛋白的基因。（3）系統(tǒng)（system）實(shí)現(xiàn)最終應(yīng)用的各裝置按不同形式連接的組合。遺傳線路調(diào)控網(wǎng)絡(luò)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)生物模塊（bioBrick）經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化加工，具有標(biāo)準(zhǔn)的限制酶切割位點(diǎn)的元件、裝置和系統(tǒng)等。EcoRIXbaISpeIPstIEXSP△※（1）連接方法（2）iGEM（3）特征（1）連接方法S/X（2）iGEM

RegistryiGEM(InternationalGeneticallyEngineeredMachine)/Main_Page元件庫(kù)/Main_Page包括生物模塊的示意圖、堿基順序、功能等信息。圖標(biāo)啟動(dòng)子核糖體結(jié)合位點(diǎn)編碼區(qū)終止子蛋白質(zhì)生成裝置？設(shè)計(jì)和構(gòu)建的生物模塊需要植入合適的載體細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。大腸桿菌（3）生物模塊特征行為可預(yù)測(cè)有相對(duì)獨(dú)立的子功能同現(xiàn)有系統(tǒng)產(chǎn)生最小的相互作用便于移動(dòng)，或再生產(chǎn)和可交換。合成蛋白質(zhì)元件和裝置※△合成蛋白質(zhì)元件合成蛋白質(zhì)裝置生產(chǎn)非天然氨基酸（UnnaturalAminoAcid，UAA）賦予蛋白質(zhì)元件以新功能和新性質(zhì)，如高穩(wěn)定性和蛋白酶抗性等。天然蛋白質(zhì)改造合成蛋白質(zhì)元件※自然界UAA硒代半胱氨酸存在于少數(shù)一些酶中吡咯賴氨酸存在于甲胺甲基轉(zhuǎn)移酶中硒代半胱氨酸插入序列吡咯賴氨酸插入序列（1）工程氨?；铣擅福?）UAA蛋白質(zhì)定向進(jìn)化（3）基于基序合成蛋白質(zhì)元件（1）工程氨?；铣擅福╝minoacyl-tRNAsynthetase，aaRS）專一性地辨認(rèn)氨基酸的側(cè)鏈和tRNA，催化特定氨基酸或其前體與對(duì)應(yīng)tRNA發(fā)生酯化反應(yīng)而形成氨酰tRNA的酶。是接受或拒絕與tRNA偶聯(lián)的特殊氨基酸的“關(guān)卡”，可以使UAA摻入蛋白質(zhì)中。（2）UAA蛋白質(zhì)定向進(jìn)化（directedevolution）定向進(jìn)化在實(shí)驗(yàn)室條件下創(chuàng)造突變，并對(duì)突變文庫(kù)施加篩選壓力，從而篩選出具有期望表型的突變體。隨機(jī)突變+正向重組+選擇不需要事先了解蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)，人為地創(chuàng)造特殊的進(jìn)化條件，模擬自然進(jìn)化機(jī)制，在體外改造基因，定向選擇出所需功能和性質(zhì)的蛋白質(zhì)。提高UAA摻入蛋白質(zhì)的速度和能力通過易錯(cuò)PCR或DNA改組產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)突變庫(kù)，根據(jù)功能進(jìn)行篩選。（3）基于基序（motif）合成蛋白質(zhì)元件基序是與運(yùn)動(dòng)或活性有關(guān)的單元。序列基序：序列中重復(fù)出現(xiàn)的氨基酸殘基；結(jié)構(gòu)基序：三級(jí)結(jié)構(gòu)中功能獨(dú)立的短序列模塊；網(wǎng)絡(luò)基序：網(wǎng)絡(luò)中內(nèi)在聯(lián)系的簡(jiǎn)單模式?；诨蚺c它的功能之間的聯(lián)系，可以合理地編程具有所需功能的人工蛋白質(zhì)。把具有不同功能的基序連接起來。在微基因單元之間的接合處插入或缺失突變串聯(lián)BH基序是Bcl-2族蛋白質(zhì)公用基序，涉及線粒體依賴的程序性細(xì)胞死亡。PTD是一個(gè)定位在HIV

tat蛋白質(zhì)中的11個(gè)氨基酸殘基的肽基序。能穿越細(xì)胞質(zhì)膜，與外源分子融合或結(jié)合，可以把蛋白質(zhì)、核酸或其他分子引入細(xì)胞。BH3PTD雙功能蛋白質(zhì)參數(shù)結(jié)構(gòu)域類型結(jié)構(gòu)域-配體相互作用長(zhǎng)度結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)鑒定蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法合成蛋白質(zhì)裝置△（1）基于分子相互作用合成蛋白質(zhì)裝置（2）基于結(jié)構(gòu)域合成蛋白質(zhì)裝置（1）基于分子相互作用（moleculeinteraction）合成蛋白質(zhì)裝置蛋白質(zhì)-DNA相互作用雙穩(wěn)態(tài)開關(guān)（Bistableswitch）開關(guān)是指某種化學(xué)誘導(dǎo)物存在或缺乏時(shí)，或者在兩個(gè)獨(dú)立的外源刺激作用下，蛋白質(zhì)處于兩種可能狀態(tài)中的一種的系統(tǒng)。通過人為調(diào)控實(shí)現(xiàn)在兩種不同穩(wěn)定狀態(tài)間的切換蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用肌支蛋白調(diào)節(jié)蛋白進(jìn)行肌動(dòng)蛋白聚合磷酸化構(gòu)建模塊蛋白質(zhì)開關(guān)自動(dòng)抑制開關(guān)自動(dòng)抑制結(jié)構(gòu)域建立分子內(nèi)相互作用，其阻斷同一分子內(nèi)另一結(jié)構(gòu)域的活性在立體上封閉激酶結(jié)構(gòu)域的活性部位，或者由于構(gòu)象張力失活它的催化活性。（2）基于結(jié)構(gòu)域（domain）合成蛋白質(zhì)裝置基于結(jié)構(gòu)域相互作用合成蛋白質(zhì)裝置一個(gè)典型的裝置由兩個(gè)不連接的元件構(gòu)成，元件彼此之間或者產(chǎn)生或者對(duì)物理相互作用應(yīng)答。與另一裝置的功能連接是通過蛋白質(zhì)整合配對(duì)來實(shí)現(xiàn)的。相互作用輸入裝置（傳感器）：轉(zhuǎn)化某種信號(hào)為一種相互作用變化。雷帕霉素相互作用輸出裝置（調(diào)節(jié)器）：把一種連接輸入裝置的相互作的變化轉(zhuǎn)化為一種有效的生物作用。相互作用傳遞裝置：輸入和輸出相互作用變化。支架蛋白（scaffoldingprotein）或接合體重構(gòu)途徑支架蛋白信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中一種沒有酶活性的蛋白質(zhì)。含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域，能同時(shí)與多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)合，通過輔助蛋白激酶和磷酸酶與他們各自的底物結(jié)合而起作用，將構(gòu)成信號(hào)通路的蛋白質(zhì)分子組裝成接合體。支架接合體作用回路的集散中心，調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的活性并執(zhí)行蛋白質(zhì)重新組裝。因此，在信號(hào)網(wǎng)絡(luò)中起關(guān)鍵作用，保證了信號(hào)傳遞的專一性和高效性。酵母有絲分裂原活化蛋白激酶MAPK信號(hào)重構(gòu)支架作用的順式模型支架作用的反式或簇模型教學(xué)大綱掌握：傳感器和調(diào)節(jié)器元件直接偶聯(lián)的RNA裝置，不同信息傳遞功能整合的RNA裝置，功能組成骨架結(jié)構(gòu)——模塊組裝裝置了解：RNA傳感器，RNA調(diào)節(jié)器，RNA傳遞器，天然核開關(guān)，合成RNA裝置的各種技術(shù)，應(yīng)用合成RNA元件合成RNA裝置合成RNA元件及裝置△※由RNA分子組成的遺傳成分行使基本生物功能基因調(diào)節(jié)指導(dǎo)構(gòu)象改變配體結(jié)合合成RNA元件（1）RNA傳感器（2）RNA調(diào)節(jié)器（3）RNA傳遞器（1）RNA傳感器（sensor）檢驗(yàn)信號(hào)的元件溫度配體與其他RNA元件偶聯(lián)溫度（temperature）傳感器對(duì)溫度改變敏感通過選擇/篩選和合理設(shè)計(jì)途徑產(chǎn)生。同各種RNA調(diào)節(jié)器元件組合，可以把溫度同基因調(diào)節(jié)聯(lián)系起來。適體（aptamer）傳感器核酸適體一種能夠與蛋白質(zhì)、小分子、離子、核酸、甚至整個(gè)細(xì)胞等目標(biāo)分子結(jié)合的寡聚核苷酸。高親和性專一性通過同靶分子定向結(jié)合相互作用傳感分子信號(hào)。應(yīng)用體外選擇策略或配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)從頭產(chǎn)生。（2）RNA調(diào)節(jié)器（Actuator）控制生物過程的元件基因表達(dá)調(diào)節(jié)后轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)定向定位控制其他生物分子的活性，影響生命和系統(tǒng)的反應(yīng)。轉(zhuǎn)錄終止調(diào)節(jié)器（transcriptionterminator）終止密碼子天然的，位于編碼區(qū)下游。組成/選擇剪接（splicing）調(diào)節(jié)器通過結(jié)合剪接體成分或其他輔助蛋白因子指導(dǎo)剪接事件。5’和3’剪接位點(diǎn)分支點(diǎn)增強(qiáng)子沉默子翻譯起始調(diào)節(jié)器核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）翻譯起始位點(diǎn)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（Internalribosomeentrysequence，IRES）一段核酸序列，它的存在能夠使蛋白質(zhì)翻譯起始不依賴于起始位點(diǎn)，從而使直接從mRNA中間起始翻譯成為可能。催化調(diào)節(jié)器核酶（ribozyme）具有催化功能的RNA分子，可降解mRNA序列。催化效率較低，是一種較為原始的催化酶。核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子?；赗NA干擾（RNAinterference，RNAi）的調(diào)節(jié)器RNAi一種分子生物學(xué)上由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，其機(jī)制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達(dá)。核酸內(nèi)切酶具有特定長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)的siRNA（約21～23bp）在細(xì)胞內(nèi)RNA解旋酶的作用下解鏈與體內(nèi)一些酶結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物RISCRISC與mRNA的同源區(qū)進(jìn)行特異性結(jié)合，在結(jié)合部位切割mRNA，mRNA隨即降解。siRNA（SmallinterferingRNA）miRNAshRNA（shorthairpinRNA）通過RNAi途徑沉默基因表達(dá)。基于反義（antisense）的調(diào)節(jié)器反義RNA單股RNA通過雜交控制RNA功能同終止子雜交形成反終止子，抑制轉(zhuǎn)錄終止。Rnase（核糖核酸酶，Ribonuclease）活性調(diào)節(jié)器Rnase識(shí)別和加工特異的RNA元件通過水解核苷酸活性作用于RNA。通過序列和結(jié)構(gòu)修飾產(chǎn)生基于適體的翻譯調(diào)節(jié)器位于5’UTR區(qū)。與配體在結(jié)合上采取一定的構(gòu)象，抑制核糖體滑動(dòng)，因此以依賴配體的方式降低表達(dá)水平。同配體功能活性的重要化學(xué)成分相互作用，抑制或提高翻譯后分子的活性。定位（zip-code）調(diào)節(jié)器結(jié)合負(fù)責(zé)定位的蛋白質(zhì)因子的序列指導(dǎo)各種分子、細(xì)胞區(qū)室或特殊細(xì)胞的定位?？勺鳛轫樖阶饔枚ㄎ辉?。mRNA實(shí)現(xiàn)較高的局部蛋白質(zhì)濃度基因調(diào)節(jié)RNA和轉(zhuǎn)錄物實(shí)現(xiàn)基因調(diào)節(jié)功能的條件或提高控制支架（scaffold）調(diào)節(jié)器將多個(gè)靶分子聚集在一起，增強(qiáng)它們的功能聯(lián)系。（3）RNA傳遞器(transmitter)在不同成分之間發(fā)送或轉(zhuǎn)換信號(hào)的元件。通過構(gòu)象改變將信息由一個(gè)RNA元件傳到另一個(gè)元件。通訊模塊(communicationmodule)元件以一種以上的方式與部分互補(bǔ)的靶鏈結(jié)合的單一序列。鏈結(jié)合的動(dòng)能打開螺旋，允許元件在不同的結(jié)合狀態(tài)之間移動(dòng)。鏈轉(zhuǎn)換(stranddisplacement)元件與互補(bǔ)的鏈競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的兩種序列。通過競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合，每種結(jié)合的動(dòng)能允許元件在不同狀態(tài)之間移動(dòng)。ArenaissanceinRNAsyntheticbiologynewmechanisms,applicationsandtoolsforthefutureSmalltranscriptionactivatingRNAs合成RNA裝置由一個(gè)以上不同功能的RNA元件組成能夠行使生物功能△※（1）傳感器和調(diào)節(jié)器元件直接偶聯(lián)的RNA裝置（2）不同信息傳遞功能整合的RNA裝置（3）功能組成骨架結(jié)構(gòu)——模塊組裝裝置（4）天然核開關(guān)（5）合成RNA裝置的各種技術(shù)（6）應(yīng)用（1）傳感器和調(diào)節(jié)器元件直接偶聯(lián)的RNA裝置直接把傳感器和調(diào)節(jié)器元件連接在一起。信息在兩個(gè)元件之間傳遞shRNA茶堿適體茶堿適體茶堿是甲基嘌呤類藥物。具有強(qiáng)心、利尿、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、松弛支氣管平滑肌和興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等作用。主要用于治療支氣管哮喘、肺氣腫、支氣管炎、心臟性呼吸困難。茶堿將調(diào)節(jié)器的一部分用傳感器取代。適體取代基因內(nèi)含子中的一個(gè)莖（2）不同信息傳遞功能整合的RNA裝置通過傳遞器元件把傳感器和調(diào)節(jié)器連接起來。通過傳遞器元件二級(jí)結(jié)構(gòu)改變傳遞傳感器和調(diào)節(jié)器之間的信息。鏈節(jié)序列RBS的一部分同適體堿基配對(duì)多個(gè)調(diào)節(jié)器偶聯(lián)到單個(gè)裝置中。偶聯(lián)RBS和核酶調(diào)節(jié)器（3）功能組成骨架結(jié)構(gòu)（functionalcompositionframework）——模塊組裝裝置通過各種元件模塊組裝成裝置。由基本的傳感、調(diào)節(jié)和信息傳遞元件全面編程信息加工及控制功能是支持許多信息加工、轉(zhuǎn)導(dǎo)和控制裝置的組合組裝。核酶自身分裂失活，降低基因表達(dá)的效率。與靶基因3’UTR偶聯(lián)延展性：更復(fù)雜裝置的組裝核開關(guān)RNA通過結(jié)合代謝產(chǎn)物發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平調(diào)控基因的表達(dá)。（4）天然核開關(guān)(riboswitch)具有天然適體的RNA遺傳控制單元，把分子傳感和基因調(diào)節(jié)功能聯(lián)系起來，通過自身構(gòu)象變化對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控。細(xì)菌——mRNA的5’UTR真核生物——3’UTR或內(nèi)含子區(qū)。維生素B12核開關(guān)黃素單核酸核開關(guān)賴氨酸核開關(guān)鳥嘌呤核開關(guān)腺嘌呤核開關(guān)甘氨酸核開關(guān)組成適體結(jié)構(gòu)域：直接結(jié)合小分子代謝物；表達(dá)結(jié)構(gòu)域：與每一個(gè)天然適體專一地匹配，在序列和結(jié)構(gòu)上可有明顯變化。適體結(jié)構(gòu)域與表達(dá)結(jié)構(gòu)域之間有一轉(zhuǎn)換序列。適體結(jié)構(gòu)域與代謝物結(jié)合后引起適體結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化，導(dǎo)致表達(dá)結(jié)構(gòu)域構(gòu)象改變，通過變構(gòu)效應(yīng)調(diào)節(jié)基因表達(dá)摻入多個(gè)傳感器和調(diào)節(jié)器結(jié)構(gòu)域的核開關(guān)可以行使高級(jí)調(diào)節(jié)功能。類型激活型：底物存在時(shí)基因開始表達(dá)；腺嘌呤核開關(guān)抑制型：底物存在時(shí)抑制基因表達(dá)。反開關(guān)模塊化結(jié)合配體的反式作用RNA裝置。由DNA結(jié)合位點(diǎn)、一個(gè)小分子誘導(dǎo)物結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)鏈節(jié)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。在小分子配體結(jié)合后發(fā)生構(gòu)象改變，影響具有反式互補(bǔ)序列的RNA翻譯。在天然系統(tǒng)中日益增加的復(fù)雜行為是通過RNA控制模塊的各種組合完成的。兩個(gè)串聯(lián)的核開關(guān)或具有多個(gè)代謝物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的單一核開關(guān)——協(xié)調(diào)控制天然基因的表達(dá)（5）合成RNA裝置的各種技術(shù)合成RNA裝置需要幾種技術(shù)的整合。RNA傳感器——天然，體外進(jìn)化RNA調(diào)節(jié)器——稍加修飾的天然元件，基于相對(duì)簡(jiǎn)單的雜交規(guī)則再設(shè)計(jì)，體外進(jìn)化合成RNA元件的高通量產(chǎn)生、設(shè)計(jì)和表征是合成RNA裝置的關(guān)鍵。功能組成骨架結(jié)構(gòu)可能是更有效的、更可靠的RNA裝置設(shè)計(jì)策略和技術(shù)。需要對(duì)RNA的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的深入了解。In

silico工具裝置設(shè)計(jì)的關(guān)鍵技術(shù)可以描述序列與結(jié)構(gòu)的計(jì)算骨架結(jié)構(gòu)以指導(dǎo)和最佳化RNA裝置設(shè)計(jì)。需要進(jìn)一步了解RNA結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系、RNA折疊動(dòng)力學(xué)，以及改進(jìn)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。（6）應(yīng)用RNase調(diào)節(jié)器整合到大腸桿菌多順子轉(zhuǎn)錄物的基因間隔區(qū)，造成多個(gè)靶基因的差異表達(dá)?？刂坪铣珊}卜素途徑基于RNase調(diào)節(jié)器組合庫(kù)，通過FACS篩選出所希望的表達(dá)率。合成甲羥戊酸途徑整合到大腸桿菌遺傳線路中的一種RNA裝置檢驗(yàn)、跟蹤和精確定位分子信號(hào)。由適體和反義元件組成的RNA裝置可作為控制治療劑，其中凝血?jiǎng)┑倪m體作為拮抗劑，反義RNA作為解