動物實驗技術(shù)MCAO模型建立原理思前想后腦梗死Cerebralinfarction腦梗塞Cerebralinfarction缺血性腦卒中（cerebralischemicstroke）又稱腦梗死，舊稱腦梗塞，是指因腦部血液供應(yīng)障礙，缺血、缺氧所導(dǎo)致的局限性腦組織的缺血性壞死或軟化。缺血性腦卒中——中國發(fā)病率與死亡率均據(jù)世界首位認(rèn)識我國的“健康第一殺手”腦梗發(fā)病率死亡率持續(xù)居于榜首“健康第一殺手”“4高”特點·中國2010-2019年缺血性卒中的患病率由每10萬1100增長至1256人·中國慢性病前瞻性研究對近50萬名35-74歲既往無卒中或短暫性腦缺血發(fā)作的中國社區(qū)居民進(jìn)行了9年隨訪，期間近46000名發(fā)生了首次卒中特點·其中10％的患者在發(fā)病28天內(nèi)死亡，而存活的患者發(fā)病后5年內(nèi)的卒中復(fù)發(fā)率為41％“4高”特點特點在2010至2019年期間均呈增長態(tài)勢2019年出院患者人數(shù)約434萬人相比2010年增長了約4倍患者人均住院費用增長37%缺血性腦卒中動物模型的常用造模方法人類腦卒中疾病類型動物模型缺血性腦卒中發(fā)病占比：75%-90%出血性腦卒中局灶性缺血模型全腦缺血模型人類腦缺血性疾病發(fā)作的常見類型大腦中動脈

栓塞模型（MCAO）國際普遍采用廣泛認(rèn)可型線栓法（最為經(jīng)典）開顱電凝阻斷法血栓形成法缺血性腦卒中動物模型的常用造模方法缺血性腦卒中出血性腦卒中腦卒中分為兩類占比高達(dá)75%~90%缺血性腦卒中動物模型的常用造模方法全腦缺血模型局灶性腦缺血模型缺血性動物模型分為兩類人類腦缺血性疾病發(fā)作的常見類型缺血性腦卒中動物模型的常用造模方法全腦缺血模型大腦中動脈栓塞模型（MCAO）缺血性動物模型分為兩類國際普遍采用、廣泛認(rèn)可缺血性腦卒中動物模型的常用造模方法缺血性腦卒中出血性腦卒中腦卒中分為兩類占比高達(dá)75%~90%缺血性動物模型分為兩類全腦缺血模型局灶性腦缺血模型人類腦缺血性疾病發(fā)作的常見類型大腦中動脈栓塞模型大腦中動脈(Middlecerebralartery，MCA)是人群腦卒中的多發(fā)部位，MCA閉塞模型(MiddleCerebralArteryOcclusion，MCAO)被普遍認(rèn)為是局灶性腦缺血的標(biāo)準(zhǔn)動物模型。其發(fā)病機理與人類缺血性腦卒中表現(xiàn)相似，對于制作模擬人腦缺血模型對腦缺血發(fā)病機制及藥物篩選有重要意義。方法阻斷實驗動物腦血管：線栓法開顱電凝阻斷法血栓形成法線栓法的重要優(yōu)勢線栓法具有不開顱、效果肯定、可準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時間等優(yōu)點，用于研究神經(jīng)元對缺血的敏感性、耐受性，藥物療效觀察以及再灌注損害和治療時間窗較為理想，同時也具有對全身影響小、動物存活時間長的特點，適于慢性腦損傷的研究。本任務(wù)采用經(jīng)典線栓法制備MCAO模型?？偨Y(jié)通過上述動畫，相信大家可以清晰掌握MCAO模型制備原理好的動物模型對復(fù)刻、還原人類疾病、促進(jìn)醫(yī)藥健康領(lǐng)域的發(fā)展的重要意義。動物實驗技術(shù)組織冰凍切片的制備冰凍切片的制備一、走進(jìn)冰凍切片冷凍切片包埋劑（EmbeddingMatrixforFrozenSections），又稱OCT冰凍切片包埋劑，是一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，其用途是在冰凍切片時支撐組織，以增加組織的連續(xù)性，減少皺折及碎裂。冰凍切片的優(yōu)勢：1.操作簡便、快速；2.組織不經(jīng)有機溶劑的處理，不受浸蠟、包埋時高溫影響，所以能較好地保存各種酶、抗原的活性及脂肪、類脂的結(jié)構(gòu)。冰凍切片的缺點：組織中水份易形成冰晶，往往影響抗原定位；冰凍切片比石蠟切片要厚，一般8-10μm，其清晰度相對石蠟切片較差；切片過程中易碎爛，不能用于回顧性研究；切片標(biāo)本只能低溫短期保存。一、走進(jìn)冰凍切片腎組織中，小且少量冰晶腎組織中，大且多冰晶一、走進(jìn)冰凍切片驟冷：將組織轉(zhuǎn)移至液氮中數(shù)秒，在轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱中保存。冷凍速度緩慢溫度偏高細(xì)胞內(nèi)冷凍不均勻所致減少冰晶的形成二、實驗所需物品實驗設(shè)備：冰凍切片機實驗耗材：OTC固定劑；防脫載玻片三、冰凍切片制備流程與注意事項1.取材及包埋固定脫水后再行冰凍切片直接速凍切片再行后固定三、冰凍切片制備流程與注意事項1.取材及包埋冰凍切片的脫水方法與石蠟切片的脫水方法不同，使用的是蔗糖溶液。取新鮮組織常規(guī)固定后，采用20%和30%蔗糖溶液進(jìn)行脫水。三、冰凍切片制備流程與注意事項1.取材及包埋通常兩級濃度的蔗糖溶液進(jìn)行過夜脫水處理，這種方式是通過高滲溶液吸收組織中的水分，從而實現(xiàn)脫水的目的；然后迅速轉(zhuǎn)移至液氮中速凍，并于-80℃深凍冰箱中保存?zhèn)溆?。三、冰凍切片制備流程與注意事項1.取材及包埋取新鮮組織，吸干周邊水分，直接進(jìn)行OCT包埋，并置于液氮中驟冷。切片后再經(jīng)固定后使用，該種方式操作時間更短。三、冰凍切片制備流程與注意事項2.組織預(yù)凍（1）提前開啟冰凍切片機降至工作溫度（15~-20℃）。（2）取出組織支承器，放平擺好組織，周邊滴上包埋劑，速放于冷凍臺上冰凍，至包埋劑與組織凍結(jié)成白色冰體即可切片（1~3分鐘）。三、冰凍切片制備流程與注意事項2.組織預(yù)凍常用的包埋劑有OCT、B超耦合劑包埋劑的種類直接影響冰凍切片質(zhì)量，包埋劑的用量也會影響標(biāo)本冷凍質(zhì)量。B超藕合劑適用于細(xì)胞豐富質(zhì)地較嫩的組織OCT劑適用于纖維豐富質(zhì)地偏硬組織OCT包埋劑是一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，其用途是在冰凍切片時支撐組織，以增加組織的連續(xù)性，減少皺折及碎裂。三、冰凍切片制備流程與注意事項2.組織預(yù)凍切片機冷凍箱及冷凍頭溫度高低要根據(jù)不同組織樣本而定：溫度過低會導(dǎo)致組織塊過硬，切片碎裂，出現(xiàn)梯田狀薄厚不均或空洞；溫度過高,組織塊硬度不夠,切片不易成形或成皺褶，切片時應(yīng)及時進(jìn)行調(diào)整。三、冰凍切片制備流程與注意事項3.切片（1）將冷凍好的組織塊，夾緊于切片機持承器上，啟動粗進(jìn)退鍵，轉(zhuǎn)動旋鈕，將組織修平；（2）調(diào)好欲切的厚度，根據(jù)不同的組織而定，原則上是細(xì)胞密集的薄切，纖維多、細(xì)胞稀的可稍為厚切，一般在10～20μm；三、冰凍切片制備流程與注意事項3.切片（3）調(diào)好防卷板、制作冰凍切片；切片關(guān)鍵點在于防卷板的調(diào)節(jié)，要求操作者要細(xì)心，準(zhǔn)確調(diào)校至適當(dāng)位置；切片時，以切出完整、平滑的切片為準(zhǔn)。切好的組織在干凈的玻片上黏附時順著一個方向稍微用力一帶,可避免組織攤片過程中皺折,保證組織結(jié)構(gòu)的完整及切片的美觀。四、課程目標(biāo)與任務(wù)對比石蠟切片技術(shù)內(nèi)容，了解并掌握冰凍切片技術(shù)的重要性與廣泛應(yīng)用·知識目標(biāo)對比石蠟切片技術(shù)內(nèi)容，了解并掌握冰凍切片技術(shù)的重要性與廣泛應(yīng)用·能力目標(biāo)培養(yǎng)勤思考、愛鉆研的職業(yè)精神·素質(zhì)目標(biāo)動物實驗技術(shù)MCAO模型評價-動物行為學(xué)評價思前想后任務(wù)一：實驗動物抓取、保定技術(shù)任務(wù)二：實驗動物編號、標(biāo)記技術(shù)任務(wù)一：實驗動物經(jīng)口給藥技術(shù)任務(wù)二：實驗動物注射給藥技術(shù)項目一：實驗動物抓取、保定與編號、標(biāo)記技術(shù)項目二：實驗動物給藥技術(shù)缺血性腦卒中MCAO模型模型建立原理手術(shù)流程與注意事項模型的評價與檢測動物行為學(xué)觀察與評價：Longa評分法病理組織學(xué)分析：TTC染色缺血性腦卒中MCAO模型模型建立原理手術(shù)流程與注意事項模型的評價與檢測動物行為學(xué)觀察與評價：Longa評分法病理組織學(xué)分析：TTC染色缺血性腦卒中MCAO模型模型建立原理手術(shù)流程與注意事項模型的評價與檢測動物行為學(xué)觀察與評價：Longa評分法病理組織學(xué)分析：TTC染色SD大鼠MCAO模型動物行為學(xué)檢測與評價一、動物行為學(xué)檢測與評價動物行為學(xué)檢測作為動物整體生理和心理狀態(tài)綜合、全面和實時效應(yīng)的反應(yīng)，是研究人類疾病發(fā)病機制、新藥效果評價、動物模型造模效果評估、基因功能等研究的一種重要技術(shù)手段；一、動物行為學(xué)檢測與評價在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、心理學(xué)等研究領(lǐng)域具有不可替代的地位。一、動物行為學(xué)檢測與評價項目一：玩轉(zhuǎn)“基因”的實驗動物模塊五：實驗動物技術(shù)前沿資訊項目二：動物行為學(xué)檢查項目三：腫瘤治療中的“透視眼”-小動物活體成像技術(shù)項目四：動物實驗技術(shù)行業(yè)發(fā)展趨勢與動物實驗技術(shù)員崗位介紹二、神經(jīng)功能及行為學(xué)評價SD大鼠腦部局灶性缺血海馬紋狀體皮層導(dǎo)致感覺運動功能的障礙神經(jīng)元損傷或死亡二、神經(jīng)功能及行為學(xué)評價神經(jīng)功能包括意識狀態(tài)、運動、感覺、視覺、共濟和神經(jīng)反射等多方面，MCAO動物研究中，可根據(jù)動物的生理病理特點，從運動、感覺、意識、神經(jīng)反射等方面檢測動物的神經(jīng)功能損傷和恢復(fù)程度。神經(jīng)功能及行為學(xué)學(xué)評價不僅是判斷模型成功與否的指標(biāo)，也為觀測病理生理發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程、模型規(guī)范化及藥物干預(yù)的研究提供了一定的依據(jù)。Longa評分法MCAO模型評價二、神經(jīng)功能及行為學(xué)評價三、Longa評分標(biāo)準(zhǔn)目標(biāo)模型為1-3分最佳不能完全伸展對策前爪向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈向?qū)?cè)傾倒四、Bederson評分法0分1分2分3分抓起動物的尾巴，使動物離臺面10cm高。此時，正常大鼠的前爪處于伸直狀態(tài)，而存在神經(jīng)功能病變的動物則可出現(xiàn)如下表現(xiàn)：01.無神經(jīng)功能缺陷：0分；02.動物尾巴提起后，癱瘓側(cè)前肢回收并屈于腹下，而正常側(cè)肢體伸向臺面：1分；03.除第二條表現(xiàn)以外，俯臥于臺面時向癱瘓側(cè)側(cè)推動物的阻力較正常側(cè)明顯降低：2分；04.除第一條和第二條以外，動物行走時向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)：3分。Bederson評分在1-3分，48小時內(nèi)沒有死亡，就認(rèn)為模型成功。五、靶向定位、綜合提升了解大鼠行為學(xué)評價應(yīng)用范圍與重要意義，為第五模塊“動物行為學(xué)檢測”項目的學(xué)習(xí)奠定基礎(chǔ)·知識目標(biāo)在了解神經(jīng)功能學(xué)眾多評價方法的基礎(chǔ)上，重點掌握Longa評分與Bederson評分具體打分指標(biāo)，并能熟練對本組及全班MCAO模型大鼠進(jìn)行評分、評價·能力目標(biāo)通過基本技能培訓(xùn)到復(fù)雜模型建立過程中，逐漸了解常用實驗動物行為學(xué)特點，能敏銳辨別實驗動物的常態(tài)、異態(tài)和病態(tài)，培養(yǎng)動物實驗員“膽大心細(xì)”的優(yōu)良品質(zhì)·素質(zhì)目標(biāo)任務(wù)驗收要點1.每組成員分別對本組MCAO模型大鼠與全班其他組MCAO模型大鼠、假手術(shù)組大鼠、正常組大鼠模型進(jìn)行Longa評分；分別計算每只大鼠求組內(nèi)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差與班級平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；記錄實驗數(shù)據(jù)、填寫任務(wù)工單。2.以組為單位，查閱實驗動物神經(jīng)功能學(xué)評價方法（每組至少提交一種），包含但不局限與該神經(jīng)功能學(xué)評價應(yīng)用范圍、必備儀器設(shè)備、評價方法與指標(biāo)、數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計等內(nèi)容，上傳至學(xué)習(xí)通平臺，進(jìn)行分享交流；同時要求每位同學(xué)至少查閱一組有其他組同學(xué)上傳的總結(jié)材料，并進(jìn)行點評與學(xué)習(xí)分享。3.小組同學(xué)拍攝經(jīng)全班投票、Longa評分在2-3分、MCAO模型建立較好的大鼠評分視頻，上傳至學(xué)習(xí)通平臺供大家學(xué)習(xí)交流與分享，同時對該組同學(xué)本項目任務(wù)一成績進(jìn)行加分，以資鼓勵。動物實驗技術(shù)MCAO模型評價-組織學(xué)觀察（TTC染色法）思前想后任務(wù)三：SD大鼠MCAO模型腦組織大體染色與分析（TTC法）項目四SD大鼠缺血性腦卒中模型（MCAO模型）的評價缺血性腦卒中MCAO模型模型建立原理手術(shù)流程與注意事項模型的評價與檢測動物行為學(xué)觀察與評價：Longa評分法病理組織學(xué)分析：TTC染色SD大鼠MCAO模型腦組織大體染色與分析（TTC法）不能完全伸展對策前爪向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈腦缺血究竟發(fā)生在大腦哪個部位？模型動物腦組織發(fā)生了哪些病理變化？SD大鼠MCAO模型腦組織大體染色與分析（TTC法）一、TTC染液與染色原理

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-TriphenyltetrazoliumChloride,TTC)，是脂溶性光敏感復(fù)合物，常用于檢測種子的生存能力以及檢測哺乳動物組織的缺血梗塞?！と旧鞹TC是呼吸鏈中吡啶—核苷結(jié)構(gòu)酶系統(tǒng)的質(zhì)子受體，能與正常組織中的脫氫酶反應(yīng)而呈紅色。一、TTC染液與染色原理

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-TriphenyltetrazoliumChloride,TTC)，是脂溶性光敏感復(fù)合物，常用于檢測種子的生存能力以及檢測哺乳動物組織的缺血梗塞。正常組織細(xì)胞中的脫氫酶可以將TTC還原成不溶性的紅色穩(wěn)定的三苯基甲臢(TTF)。·染色原理一、TTC染液與染色原理

2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-TriphenyltetrazoliumChloride,TTC)，是脂溶性光敏感復(fù)合物，常用于檢測種子的生存能力以及檢測哺乳動物組織的缺血梗塞。缺血組織中細(xì)胞內(nèi)脫氫酶活性下降，則不能被染色或染色較淺；因此可以根據(jù)染色部位和染色深淺程度來分析、統(tǒng)計腦組織梗死面積?！と旧順淞⒛繕?biāo)了解TTC染色劑性質(zhì)與染色原理，掌握TTC染色流程與注意事項。知識目標(biāo)能獨立、標(biāo)準(zhǔn)完成大鼠處死、組織取材、腦片制備等工作任務(wù)；在掌握TTC染液特點與染色注意事項的基礎(chǔ)上，能熟練運用TT