生物化學技術(shù)原理總復習生物化學技術(shù)原理總復習生物化學技術(shù)原理總復習考試題型一、填空題〔每空0.5分，共10分〕二、選擇題〔每題1分，共10分)三、判斷正誤〔每題1分，共10分〕四、名詞解釋(每題3分，共12分)五、簡答題〔每題6分，共24分〕六、實驗分析及設(shè)計題〔3小題，共34分〕2020/12/32生物化學研究技術(shù)方法生物化學研究技術(shù)：別離技術(shù)沉淀、吸附、膜別離〔過濾、透析等〕、離心、層析、電泳等分析檢測技術(shù)電泳、層析、質(zhì)譜、光譜、電化學技術(shù)、分子標記等分子生物學研究技術(shù)基因重組、分子雜交、PCR與反轉(zhuǎn)錄、核酸測序、免疫技術(shù)、生物芯片等等2020/12/33生物大分子物質(zhì)在生物體內(nèi)具有各種生理活性，這些活性的產(chǎn)生與其構(gòu)造有著親密關(guān)系，因此，別離此類物質(zhì)不能用一般的化學別離方法，而是采用比較特殊的生化別離方法。生命大分子物質(zhì)通常是指：動物、植物和微生物在進展新陳代謝時所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(包括酶)和核酸等有機化合物的總稱。生物大分子物質(zhì)的制備第一章

生命大分子物質(zhì)的制備2020/12/34生物大分子物質(zhì)的制備

生物大分子的制備生物材料的選擇細胞的破碎生物分子的抽提生物分子的濃縮有效成分純度和性質(zhì)分析2020/12/35理化性質(zhì)分離及純化方法分子大小和形態(tài)差速離心、超濾、分子篩、透析溶解度鹽析、萃取、分配層析、結(jié)晶電荷差異電泳、等電聚焦、離子交換層析生物功能專一性親和層析生物大分子的理化性質(zhì)與別離純化方法的選擇制備方法的選擇生物大分子制備方法的選擇是以生物大分子的理化性質(zhì)為根據(jù)的。生物大分子物質(zhì)的制備2020/12/36第一節(jié)

材料的選擇與處理

一、材料的選擇

1.生物材料一般可以分為兩大類：

天然生物材料：一般是指在自然界易采集的、目的物含量較高的生物個體、器官或組織。

人工生物材料：又分為三種：新品種材料，組織培養(yǎng)材料，生物產(chǎn)品與生物制品材料。生物大分子物質(zhì)的制備2020/12/37有效成分在材料中存在的特點有效成分的含量一般較少如胰臟中胰島素的含量小于其鮮重的百萬分之一。有效成分穩(wěn)定性較差大多數(shù)對酸、堿、高溫和高濃度有機溶劑等因子較敏感，易被微生物分解變質(zhì)。選用的材料不同，有效成分的含量就不同選用的材料即使一樣，但是部位或生長期不同，有效成分的含量也不盡一樣。

有效成分是指欲純化的某種單一的生命大分子物質(zhì)。而有效成分以外的其他物質(zhì)則統(tǒng)稱雜質(zhì)。2020/12/38第二節(jié)

確立測定方法

一、目的與要求當純化的對象即某一有效成分選定后：哪些材料含有目的成分？哪些材料、組織含量豐富？提純過程中純度是否逐漸增加〔純化方法是否合理〕？

要確立專一、準確、靈敏和簡便的測定方法！

2020/12/39A.測定核酸含量構(gòu)成核酸的堿基組分是分光法測定核酸含量的根據(jù)。在測定過程中，DNA或RNA溶液濃度的增加或降低，會使其在波長260nm的消光值(A260)隨之增加或降低，二者之間成正比關(guān)系。用A260／A280比值可確定DNA和RNA的純度：純DNA比值為1.8純RNA的比值為2.0當比值小于1.8/2.0時，樣品污染了蛋白質(zhì)或酚類物質(zhì)＞1.8/2.0時，說明有RNA污染或有異硫氰酸殘存紫外光譜法2020/12/310一、機械破碎二、溶脹和自溶

三、化學處理四、生物酶降解1、研磨法2、組織搗碎器法3、超聲波法：4、壓榨法：5、凍融法第三節(jié)

細胞的破碎

2020/12/311第五節(jié)

濃

縮

常用的濃縮方法有下面幾種:沉淀法吸附法超過濾法透析法減壓蒸餾法冰凍枯燥法超速離心法2020/12/312濃縮樣品時應注意：保護樣品的生物活性，因此除了減壓蒸餾濃縮法外，其余的濃縮方法均應在4℃進展〔除例外〕；操作過程中要保持樣品有相對高的回收率；在盡可能短的時間內(nèi)完成；樣品的分子量與方法及工具要匹配。2020/12/313第六節(jié)

純化方案的設(shè)計與評價

純化方案：是指在純化某一物質(zhì)過程中，將幾種別離方法(如沉淀法、離子交換層析、葡聚糖凝膠過濾等)有機地互補結(jié)合、靈敏應用的總稱。2020/12/314純化方案的評價方法對純化過程中每一步搜集到的溶液要進展：有效成分的含量測定；并計算：比活力(活力單位數(shù)／毫克蛋白)純化倍數(shù)(每步的比活力／粗抽提液的比活力)得率[(每步的總活力/粗抽提液總活力〕×100％]

有應用價值純化倍數(shù)快速增大得率緩慢降低保持樣品活性理論中對純化倍數(shù)和收得率的要求是根據(jù)材料來源的難易而變化的。假設(shè)材料來源難，就希望進步得率；反之，則希望進步純化倍數(shù)。2020/12/315表1-7L-門冬酰胺酶的純化比活力=活力單位數(shù)／毫克蛋白純化倍數(shù)=每步的比活力／粗抽提液的比活力收得率=每步的總活力/粗抽提液總活力×100％步驟總蛋白

總活力

比活力

純化倍數(shù)收得率

/g/uu/mg%1.粗抽提液30210000.711002.氯化錳處理7.64150172.02.8723.冰凍融解5.58148722.73.8714.DEAE-纖維素層析0.113502544.563.5245.硫酸銨鹽析0.048336771.7102.0176.羥基磷灰石柱層析0.0163133200.0286.0157.PAGE0.0123100255.0365.0152020/12/316第二章沉淀法沉淀法是純化生命大分子物質(zhì)常用的一種經(jīng)典方法。該法操作簡單、本錢低廉。一般包括：鹽析沉淀有機溶劑沉淀選擇性沉淀等類型。沉淀是溶液中的溶質(zhì)由液相變成固相析出的過程2020/12/317沉淀法也稱溶解度法。其純化生物大分子的根本原理是：根據(jù)各種物質(zhì)構(gòu)造的差異〔如蛋白分子外表的疏水基團和親水基團之間比例的差異〕,通過改變?nèi)芤旱哪承┬再|(zhì)〔如pH、極性、離子強度、金屬離子等〕，能使抽提液中有效成分的溶解度發(fā)生變化而沉淀?？赏ㄟ^選擇適當?shù)某樘崛軇┦褂麆e離的有效成分最大溶解，而雜質(zhì)最小溶解；或者相反。從而到達別離的目的。一、根本原理2020/12/318二、蛋白質(zhì)沉淀法鹽析法有機溶劑沉淀法蛋白質(zhì)沉淀法聚乙二醇沉淀法選擇性沉淀法結(jié)晶沉淀法2020/12/319鹽析法原理：蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中溶解度會隨著鹽濃度的增高而上升〔鹽溶saltingin〕但當鹽濃度增高到一定數(shù)值時，其溶解度又逐漸下降，直至蛋白質(zhì)析出〔鹽析saltingout〕。鹽析的發(fā)生在于鹽濃度增高到一定數(shù)值時，使水活度降低，進而導致蛋白質(zhì)分子外表電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子之間互相聚集并從溶液中析出。鹽析的缺點：得到的樣品欲繼續(xù)純化時須脫鹽。2020/12/320鹽的選擇為什么選擇硫酸銨？(1)鹽分級沉淀溶解度大，對溫度不敏感溶解度：25℃時769g/L(4.1M)；0℃時679g/L(3.9M))分級效果好〔有的一步分級沉淀就可除去75％以上雜蛋白〕有穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)造的作用將硫酸銨鹽析的蛋白質(zhì)置低溫下保存一年，其性質(zhì)沒有變化價格低廉，廢液可以肥田2020/12/321硫酸銨鹽析固體法：使用固體硫酸銨，適用于大體積樣品飽和溶液法：較固體法溫和，但不適用于大體積樣品，會導致樣品體積大量增加。透析法：使用透析袋，通過透析作用改變蛋白質(zhì)溶液中的鹽濃度。該法較溫和，分級效果好；但僅用于準確、樣品體積小的試驗中。2020/12/322(4)脫鹽常用的脫鹽方法：凝膠過濾法、透析法。透析法脫鹽的原理是分子擴散運動。其詳細操作是：把待脫鹽溶液裝入有一定孔徑的透析袋，扎緊袋口(袋內(nèi)留有適當空間，以免引起透析袋脹裂)，漂在水或適當?shù)耐肝鲆褐校乐雇肝鲆簭拇谶M入。2020/12/323第三章吸附層析吸附層析(adsorptionchromatography)又稱色層法或色譜法。2020/12/3243．層析以基質(zhì)為固定相(柱狀或薄層狀)，以液體或氣體為流動相，有效成分和雜質(zhì)在這兩個相中連續(xù)屢次地進展分配、吸附或交換作用，最終使混合物得到別離的過程。2020/12/3254．操作容量〔或交換容量〕即在特定條件下，某種成分與基質(zhì)反響到達平衡時，存在于基質(zhì)上的飽和容量；一般以每克(或毫升)基質(zhì)結(jié)合某種成分的毫摩爾數(shù)或毫克數(shù)來表示。(mmol/g,mg/g,mmol/ml,mg/ml)其數(shù)值越大，說明基質(zhì)對該成分的結(jié)合力越強。2020/12/326

床體積(Vt)床體積是指膨脹后的基質(zhì)在層析柱中所占有的體積(Vt)。

Vt是基質(zhì)的外水體積(V0)和內(nèi)水體積(Vi)以及自身體積(Vg)的總和，即:Vt=V0+Vi+Vg外水體積(V0)：指基質(zhì)顆粒之間體積的總和內(nèi)水體積(Vi)：指基質(zhì)顆粒內(nèi)部體積的總和基質(zhì)體積(Vg)：指基質(zhì)自身所具有的體積都隨床體積和基質(zhì)性質(zhì)變化而變化洗脫體積(Ve)：洗脫體積是指某一成分從柱頂部到底部的洗脫液中出現(xiàn)濃度到達最大值時的流動相體積。2020/12/32711．分配系數(shù)〔K〕指某一組分在固定相與流動相中含量的比值。常用K表示。K=Cs/CmCs:固定相中的濃度Cm:流動相中的濃度。K為熱力學常數(shù)：與組分性質(zhì)、固定相性質(zhì)、流動相性質(zhì)及溫度有關(guān)。實驗條件固定，K僅與組分性質(zhì)有關(guān)，是層析中別離純化物質(zhì)的主要根據(jù)。2020/12/32812.遷移率〔或比移值〕:指在一定條件下，某一組分在一樣時間內(nèi)，在固定相中挪動的間隔與流動相中挪動間隔之比值〔Rf〕。Rf≤1。K增加，Rf減少；反之，K減少，Rf增加。Rf＝在固定相中移動的距離在流動相中移動的距離2020/12/329正相色譜〔normalphasepartitionchromatography，NPC〕指固定相的極性高于流動相的極性，因此，在這種層析過程中非極性分子或極性小的分子比極性大的分子挪動的速度快，先從柱中流出來。反相色譜〔reversedphasepartitionchromatography，RPC〕是指固定相的極性低于流動相的極性，在這種層析過程中，極性大的分子比極性小的分子挪動的速度快而先從柱中流出。一般來說，別離純化極性大的分子〔帶電離子等〕采用正相色譜〔或正相柱〕，而別離純化極性小的有機分子〔有機酸、醇、酚等〕多采用反相色譜〔或反相柱〕。正相色譜與反相色譜2020/12/330柱長L樣品高度H踏板理論數(shù)N＝樣品高度H柱長L最正確加樣量與踏板理論踏板理論是把整個層析柱長〔L〕比喻為蒸餾塔，在某一段柱長范圍內(nèi)溶質(zhì)在固定相和流動相之間到達平衡，這一段柱長便相當于一個理論踏板的高度〔H〕，踏板理論數(shù)〔Ｎ〕便表示柱內(nèi)溶質(zhì)譜帶的分布。2020/12/331第一節(jié)

吸附柱層析

根本原理在吸附層析中，使用的固定相基質(zhì)是顆粒狀的吸附劑。在吸附劑的外表存在著許多隨機分布的吸附位點；吸附位點通過范德華力(中性分子彼此間隔非常近時，產(chǎn)生的一種微弱電磁引力)和靜電引力與蛋白質(zhì)和核酸等生物分子結(jié)合；其結(jié)合力的大小與各種生物分子的構(gòu)造和吸附劑的性質(zhì)有親密關(guān)系。

2020/12/332常用的吸附劑極性的：羥基磷灰石、硅膠、氧化鋁、人造沸石等非極性的：活性炭等2020/12/333第四章疏水層析疏水層析和反相層析〔reversedphasechromatography〕別離生命物質(zhì)的根據(jù)是一致的，即視有效成分和固定相之間互相作用的疏水力差異性大小，進而設(shè)法將有效成分別離出來。 極性大的組份先出峰，極性小的組份后出峰，恰好與正相法相反，故稱反相層析。2020/12/334

正相色譜與反相色譜的比較〔聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相〕2020/12/335

二、吸附劑在疏水層析過程中，所使用的固定相一般是由基質(zhì)和配體〔疏水性基團〕兩部分構(gòu)成，其配體對疏水性物質(zhì)具有一定的吸附力，而基質(zhì)則有親水性和非親水性之分。通常由親水性或疏水性基質(zhì)與吸附疏水性物質(zhì)的配體構(gòu)成的固定相又稱親水性或疏水性吸附劑。固定相＝基質(zhì)+配體親水性基質(zhì)疏水性基質(zhì)親水性吸附劑疏水性吸附劑基質(zhì)2020/12/3361．親水性吸附劑基質(zhì)主要是：交聯(lián)瓊脂糖(SepharoseCL-4B)配體是：苯基或辛基化合物基質(zhì)與配體通過耦合方法構(gòu)成穩(wěn)定的苯基(或辛基)-SepharoseCl-4B吸附劑2．非親水性吸附劑基質(zhì)有：硅膠、樹脂(苯乙烯、二乙烯聚合物)等配體為：苯基、辛基、烷基(C4、C8、C18)等。二者通過共價結(jié)合構(gòu)成非親水性吸附劑。2020/12/337第五章離子交換層析離子交換層析的概念離子交換層析是利用離子交換劑上的可交換離子與別離物〔蛋白質(zhì)〕外表的荷電的離子或基團間的親和力不同，經(jīng)過可逆的交換平衡到達別離目的的一種柱層析法。具有靈敏度高，重復性、選擇性好，分析速度快等優(yōu)點，是當前最常用的層析法之一。2020/12/338

纖維素－O－CH2－COO一—

Na+

載體電荷基團反離子

羧甲基纖維素離子交換劑組成示意圖一、離子交換劑離子交換劑：即是通過化學鍵合的方法向惰性支持物上連接可解離的化學基團后的產(chǎn)物。由載體、電荷基團(或功能基團)和反離子構(gòu)成。在水中呈不溶解狀態(tài)，能釋放出反離子。它能與溶液中的其他離子或離子化合物互相結(jié)合，結(jié)合后不改變本身和被結(jié)合離子或離子化合物的理化性質(zhì)。特性2020/12/339平衡常數(shù)(K)：[A

][B

]AB[RB][RA]++K=假設(shè)K>1，則[RB]>[RA]，離子交換劑對B+的結(jié)合力大于A+假設(shè)K>1，則[RB]<[RA]，離子交換劑對B+的結(jié)合力小于A+假設(shè)K=1，則[RB]=[RA]，離子交換劑對B+/A+的結(jié)合力一樣BABABA當溶液中[A+]=[B+]時，則表示離子交換劑對溶液中不同離子的親和力。2020/12/340三、離子交換層析的原理

樣品物質(zhì)依其所帶電荷的不同，與離子交換劑具有不同的親和力，從而以不同牢度被吸附于離子交換劑上，通過改變離子強度或(和)

pH使樣品物質(zhì)再從離子交換劑上先后被洗脫下來的過程。離子交換層析的原理〔根據(jù)〕：離子交換劑對各種離子或離子化合物有不同結(jié)合力2020/12/341一、離子交換劑的分類〔一〕疏水性離子交換劑〔二〕親水性離子交換劑1.陽離子交換劑2.陰離子交換劑1.纖維素離子交換劑2.交聯(lián)葡聚糖離子交換劑3.瓊脂糖離子交換劑第二節(jié)離子交換劑的分類與性質(zhì)2020/12/342其載體是一種人工合成的、與水結(jié)合力較小的物質(zhì)，稱為樹脂。樹脂型離子交換劑一般呈網(wǎng)絡(luò)構(gòu)造的珠狀體，其大小在20~400目之間〔目數(shù)越大，顆粒越細，樹脂的分辨率和交換容量就越高〕。常用的樹脂〔如聚乙烯苯〕的化學本質(zhì)是以苯乙烯為單體，二乙烯苯為交聯(lián)劑聚合而成的網(wǎng)狀聚合體；然后在此根底上，以共價鍵引入不同的電荷基團。〔一〕疏水性離子交換劑_一、離子交換劑的分類2020/12/3431.陽離子交換劑電荷基團帶負電，反離子帶正電強酸型：帶磺酸基團的樹脂〔R-SO3H〕中強酸型：帶磷酸基團或亞磷酸基團的樹脂〔R-PO3H2〕弱酸型：帶羧基或酚羥基的樹脂〔R-COOH或R-ph-OH〕據(jù)電荷基團的強弱分為這類樹脂合適于別離等電點在中性以上的蛋白質(zhì)。在不溶性的樹脂中引入帶負電的羧甲基或磺丙基基團后構(gòu)成的。一、離子交換劑的分類2020/12/3442.陰離子交換劑是在樹脂中分別引入季胺[-N(CH3)3]、叔胺[-N(CH3)2]、仲胺[-NCH3]和伯胺[-NH2]基團后構(gòu)成的。電荷基團帶正電，反離子帶負電陰離子交換劑的官能團〔二乙氨乙基DEAE或季氨堿QAE〕樹脂在中性pH條件帶正電荷，釋放的反離子帶負電荷，在中性pH時能與酸性蛋白質(zhì)互相作用。一、離子交換劑的分類2020/12/345〔二〕親水性離子交換劑其基質(zhì)是一類天然的或人工合成的、與水結(jié)合力較大的物質(zhì)，如纖維素〔Sephacel〕、交聯(lián)纖維素、交聯(lián)葡聚糖〔Sephadex〕及交聯(lián)瓊脂糖〔Sepharose〕等。1.纖維素離子交換劑2.交聯(lián)葡聚糖離子交換劑3.瓊脂糖離子交換劑2020/12/346一、離子交換劑的分類2020/12/347一、離子交換劑的選擇離子交換劑的選擇的原則★別離生物大分子一般采用親水性基質(zhì)。具有可人工控制的分子篩，及較多的可交換的基團；★別離酶、核酸、蛋白質(zhì)等采用弱性的離子交換劑。其交換容量大，親水性，對生物樣品的穩(wěn)定性好，易發(fā)生結(jié)合；★洗脫液的pH與被別離物的pI至少相差一個pH值，才能將各種成份分開。pH﹥pI一個單位時選擇陰離子交換劑；pH﹤pI一個單位時選擇陽離子交換劑。2020/12/348考慮題1.離子交換劑由哪幾部分組成？何為陽離子和陰離子交換劑？2.在離子交換層析中，假設(shè)以0-0.5mol/LNaCl為梯度的Tris-HCl緩沖液作洗脫液〔總體積200ml，梯度瓶直徑一樣〕，求此液通過層析柱75ml時，NaCl濃度是多少？3.如何利用離子交換劑別離pI4.0，6.0，7.5，9.0的四種蛋白混合物？2020/12/349

第六章凝膠過濾凝膠層析的特點是:1〕填料是具有一定范圍篩孔尺寸的凝膠，被別離物按分子量的差異在流動相推動下,大分子被凝膠的篩孔排阻而先流出層析柱，小分子在孔中擴散而后流出；2〕凝膠不帶電荷、吸附力弱，與被別離物不發(fā)生任何化學結(jié)合,不會引起蛋白質(zhì)的損失和失活；3〕快速純化大分子，目的物在洗脫峰中，雜質(zhì)留柱。2020/12/350X數(shù)字可代表交聯(lián)度：X數(shù)字越小，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔越小，適用于別離低分子質(zhì)量生化產(chǎn)品。X數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔越大，適用于別離高分子生化產(chǎn)品。X數(shù)字也代表凝膠的持水量：如G-25表示1g干膠持水2.5mL；G-100表示1g干膠持水10mL，依次類推。SephadexG-X一、葡聚糖凝膠(Sephadex)葡聚糖凝膠的網(wǎng)孔大小可通過調(diào)節(jié)交聯(lián)度來控制；交聯(lián)度是通過交聯(lián)劑的加量及反響條件來控制的。2020/12/351二、瓊脂糖類凝膠〔Sepharose〕瓊脂糖凝膠特點：1、沒有共價鍵的交聯(lián)。2、孔徑依賴于瓊脂糖的濃度。3、瓊脂糖凝膠的化學穩(wěn)定性較差。4、非特異性吸附力低。5、別離范圍大。6、顆粒強度差。2020/12/352對生物樣品來說，經(jīng)常遇到的是兩種別離形式：

將分子量極為懸殊的兩類物質(zhì)分開，如蛋白質(zhì)與鹽類，稱作類別離或組別離。將分子量相差不大的大分子物質(zhì)加以別離，如別離血清球蛋白與白蛋白，這叫做分級別離。后者對實驗條件和操作要求都比較高。2020/12/353親和力根據(jù)生物體中高分子化合物能與之相對應的專一分子特異識別和可逆結(jié)合的特征,將生物分子間的這種結(jié)合才能稱為親和力.親和層析法利用生物大分子和固定相外表存在某種特異性吸附而進展選擇性別離的一種生物大分子別離的層析方法。親和層析法的本質(zhì)是在載體的外表先鍵合一種具有一般反響性能的間隔臂，隨后再連接配體〔酶、抗原、激素等〕組成固定相，通過配體高選擇地吸附與其有生物特性的大分子，非特異的分子不被吸附先流出層析柱，保存在柱上的特異分子將以純品形態(tài)洗脫下來。第七章親和層析2020/12/354親和層析具備的三要素介質(zhì)(基質(zhì))—具有活化基團間隔臂—連接介質(zhì)與配體的分子配體—具有識別才能反配體〔別離物〕—與配體進展可逆結(jié)合

配體Ligand：能被某一生物大分子識別和可逆結(jié)合的生物專一性物質(zhì)。2020/12/355引入間隔臂親和層析中經(jīng)常使用小分子化合物作為配體，但小分子配體直接連接于瓊脂糖上易產(chǎn)生無效吸附劑－－由于載體的空間位阻關(guān)系，使大分子化合物〔親和物〕不能直接接觸到配體。通過在載體與配體之間引入適當長度的“手臂〞減少載體的空間位阻，增加配體的活動度。常見的間隔臂是6～8個碳原子的碳氫鏈，基質(zhì)到配體的長度為0.5～1nm。2020/12/356優(yōu)良的配體必須具備兩個條件：具有與載體共價結(jié)合的基團和較好的穩(wěn)定性與生物大分子有適宜的親和力和較強的特異性解離常數(shù)Ka范圍在10-5～10-8

Mol與載體的結(jié)合不影響與生物大分子之間的親和力當解離常數(shù)﹥10-3時，配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合力較弱，在層析過程中拉不牢目的蛋白，選擇性過低；當解離常數(shù)＜10-15時，親和力太大，洗脫時得用劇烈、苛刻、乃至變性的條件。這對別離生物活性樣品是忌諱的。2020/12/357載體孔徑及空間障礙的影響間隔臂長短、離子性、極性配體的親和力與濃度〔理想配基濃度為1-10umol/L〕配體偶聯(lián)的位置配體的類型配體分子的大小影響配體親和力的因素小分子配體可供識別、互補的特殊構(gòu)造較少，一旦偶聯(lián)到載體上后，這種識別的構(gòu)造更少，且酶的活性中心常在構(gòu)造的內(nèi)部，影響其與生物分子的結(jié)合。2020/12/358洗脫條件比形成復合物時的條件要更劇烈。親和力較小時，連續(xù)用平衡緩沖液洗脫親和力一般時，主要靠改變緩沖液的性質(zhì)〔pH或離子強度〕，以減小親和力來使之別離親和力較大時，可用與配體競爭的洗脫液或用含蛋白質(zhì)變性劑的溶液進展洗脫A.競爭性洗脫劑→特異性洗脫B.蛋白質(zhì)變性劑→非特異性洗脫洗脫方法2020/12/359與其他層析技術(shù)比較2020/12/360聚焦層析是Sluyterman等在等電點聚焦方法的根底上開展起來的。聚焦層析是利用樣品中各組分等電點的差異和離子交換行為的不同建立的別離純化方法；既有聚焦作用的性能，又有濃縮和別離樣品的作用。聚焦層析既具有等電點性質(zhì)的高分辨率，又具有離子交換層析別離的大容量的特點，而且不需要特殊實驗設(shè)備，因此，它是一種純化制備蛋白質(zhì)、核酸的好方法。第八章聚焦層析2020/12/361聚焦層析也是一種柱層析流動相為多緩沖劑固定相為多緩沖交換劑

第一節(jié)根本原理2020/12/362聚焦層析介質(zhì)聚焦層析介質(zhì)種類較少，主要以交聯(lián)瓊脂糖為載體，通過共價鍵將多氨基多羧基化合物偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠載體上，這類介質(zhì)具有瓊脂糖介質(zhì)的親水性和大孔性的根本特征，具有兩性電解質(zhì)的聚焦作用和離子交換才能。

洗脫緩沖液聚焦層析的緩沖液也稱多聚緩沖液，是一種兩性電解質(zhì)緩沖液，其性質(zhì)與載體兩性電解質(zhì)相似，由分子量不等、多種組分的多羧基多氨基脂肪族同系物組成。2020/12/363二、聚焦層析原理在聚焦層析過程中，固定相首先通過較高的pH緩沖液平衡，在一定pH范圍內(nèi)形成一個連續(xù)的pH梯度，然后上樣、聚焦、解聚焦等完成別離。pH梯度溶液的形成蛋白質(zhì)的行為聚焦效應聚焦層析原理可以從以下三方面來闡述2020/12/364蛋白質(zhì)的行為蛋白質(zhì)所帶電荷取決于它的pI和層析柱的pH值pH環(huán)境

pH＜pIpH＞pIpH＜PIPro帶電性+-+吸附情況不吸附吸附解吸附如此反復進展，各種蛋白質(zhì)就按等電點大小不同分別被洗脫下來，從而到達別離的目的不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結(jié)合以前，挪動之間隔是不同的，洗脫的先后次序是按等電點大小排列的〔大先小后〕。2020/12/365測定樣品的等電點選擇適當?shù)亩嗑彌_劑和交換劑用起始緩沖液平的交換劑裝入柱中所需裝置UV儀pH儀記錄儀部分搜集器泵調(diào)節(jié)起始緩沖液至梯度的上限讓5~10ml緩沖液流過柱體加樣多緩沖劑洗脫起始緩沖液(上限)重新平衡洗脫液別離分析柱再生調(diào)節(jié)起始緩沖液至梯度的下限根本操作2020/12/366第九章高效液相色譜HPLC與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻。小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)。又因分析速度快而稱為高速液相色譜法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLP)。2020/12/367一、HPLC的特點高壓——壓力可達150-300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為75Kg/cm2以上。高速——流速為0.1-10.0ml/min。高效——可達5000塔板每米。在一根柱中同時別離成份可達100種。高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。高可重復性2020/12/368速度快——通常分析一個樣品在15-30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。分辨率高——可選擇固定相和流動相以到達最正確別離效果。靈敏度高——紫外檢測器可達0.01ng，熒光和電化學檢測器可達0.1pg。柱子可反復使用——用一根色譜柱可別離不同的化合物。樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以搜集單一組分或做制備。HPLC與經(jīng)典液相比有以下優(yōu)點2020/12/369應用最普遍的是反相色譜，

占整個HPLC應用的80%左右

反相色譜：基于分子的極性別離洗脫次序：極性高的先被洗脫常用固定相：C18、C8、苯基等基團反相色譜固定相多為鍵合相常用的流動相：水和有機溶劑如甲醇、乙腈應用添加劑，成為離子對、離子抑制方法2020/12/370柱效參數(shù)理論塔板數(shù)(theoreticalplatenumber，N)——用于定量表示色譜柱的別離效率〔簡稱柱效〕N取決于固定相的種類、性質(zhì)〔粒度、粒徑分布等〕、填充狀況、柱長、流動相的種類和流速及測定柱效所用物質(zhì)的性質(zhì)。N與柱長成正比，柱越長，N越大。用N表示柱效時應注明柱長，假如未注明，則表示柱長為1米時的理論塔板數(shù)。〔一般HPLC柱的N在1000以上〕2020/12/371標記：探針：雜交：標記物〔示蹤物〕：以共價鍵的方式將某些放射性元素或非放射性物質(zhì)〔示蹤物〕結(jié)合到生物分子上，成為示蹤復合物〔探針〕的過程。指帶有示蹤物的生物分子，也稱某物的標記。探針與相應的物質(zhì)發(fā)生的識別反響。放射性同位素、化學發(fā)光物、生色基團、熒光物質(zhì)等。第十章標記2020/12/372第一節(jié)核酸標記〔制備核酸探針〕核酸探針〔probe〕：指含有示蹤物的核酸片段(DNA或RNA)，能與特定核酸序列(靶序列)發(fā)生特異性互補〔核酸雜交〕反響。用于檢測樣品中特定的基因序列。根據(jù)核酸探針的來源及性質(zhì)有雙鏈DNA、單鏈DNA、單鏈RNA和人工合成的寡核苷酸探針等。用于分子雜交的核酸探針均須進展標記，帶有示蹤物，與靶基因雜交后，才能檢測顯示出雜交體信號。2020/12/373一、標記物的制備及類型以標記物分類：以制備方法分類：雙鏈DNA探針標記法；單鏈DNA探針標記法；

PCR合成DNA探針；寡聚核苷酸探針；

RNA探針。放射性同位素標記〔3H、14C、32P、35S、125I〕非放射性同位素標記〔地高辛、生物素、酶、熒光素〕2020/12/37432Por33P可取代dNTP或NTP不同磷酸位上的P原子，35S可取代核酸中磷酸分子上的一個O原子，3H取代H原子。dCMP32Por33P35S3H2020/12/375五、探針的鑒定制備好了的探針應對其長度〔堿基數(shù)〕、示蹤物的摻入率、特異性等進展鑒定。1、雜交法2、發(fā)光法3、酸沉淀法4、層析法5、比色法2020/12/376通常由印跡、雜交和檢測分析等步驟組成。分子印跡：將各種生物大分子從凝膠轉(zhuǎn)移到一種固定基質(zhì)上的過程稱為印跡〔blotting，Southern1975〕。分子雜交：標記探針DNA變性后與變性后的靶DNA/RNA通過堿基互補配對結(jié)合，形成雜種分子的過程。1、雜交法

分子雜交包括：DNA-DNA雜交(Southernblotting)DNA-RNA雜交(Northernblotting)蛋白雜交(Westernblotting)斑點雜交(Dotblotting)分子雜交目的：

運用特異的探針鑒定復雜的靶DNA中同源的DNA片段。2020/12/377第二節(jié)蛋白質(zhì)標記抗體-抗原，酶-底物，激素-受體蛋白等特異性的反響無法直觀表現(xiàn)與判斷，只有借助發(fā)色、發(fā)光試劑；或者同位素、酶試劑標記產(chǎn)生高度專一性的探針，利用其作為靶標，又能發(fā)出檢測信號的特點，提供判斷根據(jù)。2020/12/378一、標記方法〔一〕非核素標記酶標記法熒光試劑標記生物素標記金標記〔二〕核素〔同位素〕標記2020/12/379免疫印跡法(Westernbloting)免疫印跡：將被檢測蛋白質(zhì)〔即電泳別離的非標記蛋白質(zhì)〕轉(zhuǎn)移到固相載體上，用特異的抗體對蛋白質(zhì)進展鑒定及定量的方法。主要步驟：蛋白質(zhì)樣品的制備SDS電泳蛋白質(zhì)的電轉(zhuǎn)移：NC膜靶蛋白的免疫學檢測靶蛋白于第一抗體〔一抗〕反響與標記的第二抗體〔酶標二抗〕反響顯色反響：酶促反響2020/12/380第十一章生物芯片何為生物芯片？生物芯片是通過平面微細加工技術(shù)在固體芯片外表構(gòu)建的微流體分析單元和系統(tǒng)，以實現(xiàn)對細胞、蛋白、核酸以及其他生物組分的準確、快捷、大信息量的檢測。2020/12/381根據(jù)用處還可以把生物芯片分為兩類：信息生物芯片〔information-biochip〕功能生物芯片〔function-biochip〕2020/12/382基因芯片技術(shù)的概念基因芯片(Genechip)技術(shù)是指通過微陣列(Microarray)技術(shù)將高密度DNA片段陣列通過高速機器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在如玻片等固相外表，以熒光標記的DNA探針，借助堿基互補雜交原理，進展大量的基因表達及監(jiān)測等方面研究的最新革命性技術(shù)。基因芯片又稱DNA芯片或DNA微陣列。第一節(jié)基因芯片2020/12/383一、根本原理基因芯片的工作原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法〔southern

、northern〕相似。核酸印跡：將待測樣品DNA〔靶基因〕固定于支持物上，用序列DNA片段制作探針，二者按堿基互補配對原理雜交，檢測出欲鑒定的基因?；蛐酒簩⒋罅炕蚱我晕㈥嚵蟹绞焦潭ㄔ谥С治锷希郎y樣品用熒光標記成探針，當探針與芯片上的靶基因雜交后，通過信號檢測進展定性定量分析。基因芯片在一微小的基片外表集成了大量的DNA分子，可以在同一時間內(nèi)平行分析大量的基因，進展大信息量的挑選與檢測分析。2020/12/384固定于載體上的蛋白質(zhì)樣品〔靶蛋白〕以陣列方式構(gòu)成，待測樣品用熒光染料或同位素標記制備成探針與芯片雜交，雜交信號用激光掃描儀或放射自顯影檢測及計算機分析檢測結(jié)果。蛋白質(zhì)芯片合適于蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)－核酸〔DNA、RNA〕、蛋白質(zhì)－小分子之間的互相作用分析；合適功能基因組、蛋白組研究。第二節(jié)蛋白質(zhì)芯片2020/12/385第十二章電泳技術(shù)(Electrophoresis,EP)帶電顆粒在電場作用下，由于所帶電荷及顆粒形狀大小等不同，向與其電性相反的電極挪動的速度不同，從而到達別離目的一種方法稱為電泳。電泳技術(shù)已被廣泛應用于蛋白質(zhì)、核酸和氨基酸等物質(zhì)的別離鑒定。2020/12/386第一節(jié)電泳根本原理在一定pH條件下，每種分子都具有特定的電荷、大小和形狀，在一定時間內(nèi)它們在一樣電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成嚴密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術(shù)進展別離、分析和鑒定的根本原理。2020/12/387第一節(jié)電泳根本原理帶電顆粒在電場中泳動的速度稱遷移率或泳動度。電泳時，帶電顆粒在介質(zhì)中受力平衡勻速運動則：v=FE/f=F阻/f=E·q/f=E·q/(6π·r·η)E—電場強度q—顆粒所帶電荷r—顆粒半徑η—介質(zhì)黏度v—泳動度F阻—顆粒所受阻力FE—顆粒所受電場力f—摩擦系數(shù)可見泳動度與顆粒所帶電荷、顆粒半徑、介質(zhì)黏度以及電場強度有關(guān)。泳動度2020/12/388染色后，量出指示劑挪動的間隔和酶帶挪動的間隔。Rf＝譜帶遷移間隔/指示劑遷移間隔 相對遷移率〔Rf〕測量遷移率時，應以譜帶的中部位置為準；

電泳時多種因素會影響帶電顆粒的遷移速度。為了使試驗重復性好，這些因子都應盡可能保持恒定。第一節(jié)電泳根本原理2020/12/3891.電場強度：電場強度越高，則帶電顆粒泳動越快。2.溶液pH溶液pH值決定帶電顆粒的解離程度，亦即決定其所帶電荷的多少。對蛋白質(zhì)而言，溶液pH值離等電點越遠，則顆粒所帶凈電荷越多，泳動速度也越快；反之，則越慢。3.溶液的離子強度緩沖液離子強度越高，則顆粒的電動電勢越小，泳動度越小。一般最合適的離子強度在0.02-0.2之間。第一節(jié)電泳根本原理影響泳動度的因素：2020/12/390第一節(jié)電泳根本原理影響泳動度的因素：4.電滲電泳緩沖液相對于固體支持物的挪動稱電滲。如紙電泳時，濾紙吸附OH-離子帶負電荷，與紙接觸的緩沖液帶正電荷向負極挪動，會對顆粒的挪動造成不良影響，故電泳時，電滲小些為好。5.溫度/焦耳熱:電泳時會生熱，使介質(zhì)粘度下降，分子運動加快，遷移率增加，同時溫度過高會使樣品中的生物大分子變性失活，因此電泳時，要控制電壓或電流，或安裝冷卻散熱裝置。6.支持物:支持物性質(zhì)不同也會影響泳動速率，如瓊脂、聚丙烯酰胺凝膠都有大小不同的篩孔，在篩孔大的凝膠中溶質(zhì)顆粒的泳動速率快，反之則慢。2020/12/3914.瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳對核酸的別離作用主要根據(jù)它們的相對分子質(zhì)量及分子構(gòu)型，以及凝膠的濃度。核酸分子大小與瓊脂糖濃度的關(guān)系DNA分子的大?。涵傊堑臐舛龋弘娪驹诘蜐舛取⒌碗妷合?，別離效果較好。溫度對于DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳行為沒有顯著的影響。通常在室溫下進展電泳，只有當凝膠濃度低于0.5%時，為增加凝膠硬度，可在4℃，進展電泳。2020/12/3925.聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠是由單體丙烯酰胺〔Acr〕和交聯(lián)劑甲叉雙丙烯酰胺〔Bis〕在加速劑和催化劑的作用下聚合并聯(lián)成三維網(wǎng)狀構(gòu)造的凝膠，以此凝膠為支持物的電泳稱為聚丙烯酰胺凝膠電泳〔簡稱PAGE〕。2020/12/3935.1.1.聚合反響聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺(Acr)和甲叉雙丙烯酰胺(Bis)在催化劑作用下合成的。催化系統(tǒng)常用有兩種：過硫酸氨—TEMED化學催化聚合系統(tǒng)此系統(tǒng)中，四甲基乙二胺〔TEMED〕為加速劑，微量TEMED的參加，可使過硫酸氨〔APS，催化劑〕形成自由基。這些自由基的產(chǎn)生可以引發(fā)丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺的交聯(lián)反響，形成具有一定孔徑的聚丙烯酰胺凝膠。核黃素—TEMED光聚合催化系統(tǒng)此系統(tǒng)中，核黃素經(jīng)紫外線光解形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反響。TEMED的存在，可以加速聚合，本催化系統(tǒng)主要用用于大孔濃縮膠的配置。5.聚丙烯酰胺凝膠電泳2020/12/3945.1.2