免疫沉淀和免疫印跡在細胞生物學研究中，有時要對細胞膜分子、胞內(nèi)分子或表達產(chǎn)物進行定性或/和定量。但由于靶蛋白表達水平不太高，用細胞裂解液或表達上清進行SDS電泳、免疫印跡（Westernblot）檢測很難達到實驗目的。為此可用特異性識別靶蛋白的抗體進行免疫沉淀，純化和富集靶抗原。免疫沉淀所獲得的蛋白可進行SDS電泳，經(jīng)考馬斯亮藍染色或銀染后觀察目的蛋白條帶。如果免疫沉淀得到的目的蛋白量低于考馬斯亮藍染色或銀染的檢測下限，可采用Westernblot檢測方法，提高檢測的靈敏度，達到實驗目的。免疫沉淀原理免疫沉淀是利用抗原抗體特異性反應純化富集目的蛋白的一種方法?？贵w與細胞裂解液或表達上清中響應的蛋白結(jié)合后，再與蛋白A/G（proteinA/G）或二抗偶聯(lián)的agarose或Sepharose珠子孵育，通過離心得到珠子蛋白A/G或二抗目的蛋白符合物，沉淀經(jīng)洗滌后，重懸于電泳上樣緩沖液，煮沸5~10分鐘，在高溫及還原劑的作用下，抗原與抗體解離，離心收集上清，上清中包括抗體、目的蛋白和少量的雜蛋白。試劑1、PBS：8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4、0.24gKH2PO4溶于800mL雙蒸水中，用HCl調(diào)pH至7.4，再補加水至1L，高壓滅菌后保存于室溫。2、NaCl：5.8gNaCl溶于80mL雙蒸水中，再補加水至100mL，高壓滅菌。3、1MTris(pH7.5)：12.1gTris堿，溶于80mL雙蒸水中，用HCl調(diào)pH至7.4，再補加水至100mL。4、蛋白酶抑制劑：Aprotinin和Leupeptin溶于雙蒸水，PMSF溶于異丙醇，濃度均為10mg/mL。5、NP-40:10%(W/V).6、脫氧膽酸鈉：10%（W/V），溶于10mLHEPES（pH8.0）。7、細胞裂解液：50mMTris(pH7.5)、150mMNaCl、0.1mg/mLPMSF、1μg/mLAprotinin、1μg/mLLeupeptin、1%NP-40、0.5%脫氧膽酸鈉。8、稀釋液：50mMTris(pH7.5)、150mMNaCl、0.1mg/mLPMSF、1μg/mLAprotinin、1μg/mLLeupeptin、0.1%NP-40。9、洗滌液1：50mMTris(pH7.5)、150mMNaCl、0.1%NP-40.10、洗滌液2：10mMTris(pH7.5)。11、ProteinA/G-Agarose。12、2XSDS電泳上樣緩沖液：100mMTris(pH6.8)、200mMDTT、4%SDS、0.2%溴酚藍、20%甘油。操作步驟1、離心收集細胞，PBS洗滌2次。細胞用量根據(jù)目的蛋白的表達水平而定，一般用1X107~5X107細胞。2、按1X107細胞/mL加入細胞裂解液，于冰浴上超聲破碎，然后再冰浴30分鐘。3、4℃4、往上清中加入50μL的蛋白A/G-Agarose，于4℃在搖床上溫和搖1~35、12000轉(zhuǎn)離心20秒，取上清。6、將上清等分為兩份，補加稀釋液至1mL，其中一份加入1~10μg識別目的蛋白的抗體，另一份加入等量的對照抗體，于4℃在搖床上溫和搖2小時，然后加入50μL的蛋白A/G-Agarose于4℃7、離心棄上清，用洗滌液1洗滌沉淀4次，洗滌液2洗滌2次，每次洗滌于4℃在搖床上溫和搖8、離心棄上清，用4號針頭盡可能移去液體。9、加入20~50μL的電泳上樣緩沖液，于100℃注意事項不同種屬來源及不同亞類的抗體與蛋白A和蛋白G的結(jié)合力不同，有的甚至不能結(jié)合。PMSF對身體有害，注意防護。根據(jù)免疫沉淀的結(jié)果，洗滌液1的鹽離子濃度可作一定的調(diào)整，如果沉淀的雜蛋白較多可適當增加鹽濃度，如果抗體與目的蛋白的結(jié)合力較弱則適當減低鹽濃度。免疫印跡原理Westernblot是一種在PVDF或硝酸纖維素（NC）膜上進行的抗原抗體反應。蛋白電泳后，將蛋白轉(zhuǎn)移至膜上，再與特異性抗體孵育，洗去游離的抗體，然后和酶標記的二抗孵愚，再進行底物顯色。由于抗原抗體反應的特異性好，親和力高，Westernblot檢測的靈敏度較高，尤其是采用酶促增強化學發(fā)光的方法（ECL）后，檢測的下限可達到pg水平。ECL是指酶催化底物發(fā)熒光，熒光可使X光片曝光。由于酶標記在二抗上，二抗與一抗結(jié)合，而一抗特異性結(jié)合在目的蛋白條帶處，因此顯影、定迎后觀察到的條帶即為目的蛋白帶。試劑和器材PVDF膜或NC膜。電泳緩沖液：25mMTris堿、250mM甘氨酸、0.1%SDS。轉(zhuǎn)移緩沖液：實驗所用的PVDF或NC膜不同，轉(zhuǎn)移緩沖液也可能不同，因此請自選商場參閱PVDF或NC膜說明書。TBS（pH7.5）：6.05gTris(50mM)、8.76gNaCl(159mM)溶于800mL雙蒸水，用HCl調(diào)pH至7.5，補加水至1L。TBST：TBS+0.1%（v/v）Tween20。封閉液：1%試劑盒中的封閉液或5%脫脂奶粉，溶于TBS中。解離液：100mM二巰基乙醇、2%SDS?；瘜W發(fā)光Westernblot試劑盒：生產(chǎn)這類試劑盒的公司包括Roche、Pierce、Amersham等。試劑盒中一般包括酶標記二抗、發(fā)光液A和B。操作步驟灌制SDS電泳膠，方法參見一般的分子生物學實驗方法。取免疫沉淀最后所得上清，上樣，電泳。用電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF或NC膜上。電轉(zhuǎn)移完畢后，取出膜，用TBA洗滌1次。將膜放入封閉液，于室溫封閉1小時，或4℃用封閉液稀釋識別蛋白的抗體至1~10μg/mL，與含目的蛋白條帶膜在室溫作用于小時。TBST洗膜4次，每次15分鐘。按試劑盒說明書稀釋酶標二抗，與膜于室溫作用30分鐘。TBST洗膜4次，每次15分鐘。按試劑盒說明書混合發(fā)光液A和B，與膜作用1分鐘后進行X光片曝光。X光片顯影和定影后觀察結(jié)果。如果結(jié)果不理想或要用相同的膜檢測另一種靶蛋白，可將膜與解離液于50℃作用30分鐘，去除結(jié)合于膜上的抗體，TBST洗2次，封閉后可重新檢測（即重復6~11注意事項用于Westernblot和免疫沉淀的抗體最好不同，否則將出現(xiàn)很多非特異性條帶。Westernblot中，轉(zhuǎn)移在膜上的蛋白處于變性狀態(tài)，其空間結(jié)構(gòu)被改變，因此那些識別空間表位的抗體不能用于Westernblot檢測。這種情