ICS65.120B25DB22備案號：56301-2017吉林省地方標準DB22/T2688.1—2017飼料中三種致病菌檢測微滴數(shù)字PCR法第1部分：沙門氏菌DeterminationofthreepathogenicbacteriainfeedbydropletdigitalPCRmethod吉林省質(zhì)量技術監(jiān)督局發(fā)布DB22/T2688.1—2017前言本標準按照GB/T1.1-2009和GB/T20001.4-2015給出的規(guī)則起草。DB22/T2688《飼料中三種致病菌檢測微滴數(shù)字PCR法》分為3個部分：——第1部分：沙門氏菌；——第2部分：單核細胞增生李斯特氏菌；——第3部分：產(chǎn)氣莢膜梭菌。本部分為DB22/T2688的第1部分。本部分中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局提出并歸口。本部分起草單位：中華人民共和國吉林出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心。本部分主要起草人：王準、聶丹丹、李文君、楊帆、王瑋琳、李忠起、彭勃、羅雁非、劉金華、劉韜。IDB22/T2688.1—2017飼料中三種致病菌檢測微滴數(shù)字PCR法第1部分：沙門氏菌警示——使用本標準的人員應有正規(guī)實驗室工作的實踐經(jīng)驗。本標準并未指出所有可能的安全問題。使用者有責任采取適當?shù)陌踩徒】荡胧?，并保證符合國家有關法規(guī)規(guī)定的條件。1范圍本標準規(guī)定了飼料中沙門氏菌檢測微滴數(shù)字PCR法的試劑和材料、儀器和設備、樣品、試驗步驟和試驗數(shù)據(jù)處理。本標準適用于飼料中沙門氏菌檢測的微滴數(shù)字PCR法。2規(guī)范性引用文件下列文件對于本文件的應用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB4789.1食品安全國家標準食品微生物學檢驗總則GB4789.4-2016食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法WS/T230-2002臨床診斷中聚合酶鏈反應（PCR）技術的應用微滴式數(shù)字PCR平臺通過產(chǎn)生微小油包水體系實現(xiàn)反應體系的分割。經(jīng)PCR擴增后，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。本標準通針特異性引物和探針進行數(shù)字PCR擴增，從而對飼料中沙門氏菌進行快速檢測。4.4裂解液：2%CTAB(cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化銨)，100mmol/LTris(trishydroxymethylaminomethane，三羥甲基氨基甲烷)，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(ethylenediaminetetraaceticacid，乙二胺四乙酸)，用HCl調(diào)至pH8.0。1DB22/T2688.1—20174.6氯仿。4.7異戊醇。4.8無水乙醇。4.9異丙醇。4.104.1170％乙醇。引物和探針上有引物-5＇-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3＇下游引物-5＇-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3＇探針-5＇-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3＇5儀器和設備5.1天平：感量0.01g。5.2恒溫水浴鍋：46℃±1℃。5.3微量移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。5.4離心機：離心轉速≥12000r/min。5.5渦旋振蕩器。5.6核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計。5.7微滴生成儀。5.8PCR儀。5.9微滴讀數(shù)系統(tǒng)。按照GB/T14699.1對飼料進行采樣（6.1），沙門氏菌樣品的增菌培養(yǎng)（6.2）按照GB4789.4進行。7試驗步驟吸取沙門氏菌增菌液1mL（6.3），加到1.5mL無菌離心管中，12000r/min離心（6.4）10min，吸棄上清；加入50μLDNA提取液（使用前室溫解凍并充分混勻，快速吸?。?，混勻（6.5）后沸水浴5min，12000r/min離心5min。取上清保存于-20℃?zhèn)溆靡源龣z測。取適量DNA溶液原液加雙蒸水稀釋一定倍數(shù)后，使用核酸蛋白分析儀或紫外分光光度計（6.6）測260nm和280nm處的吸收值，從而確定DNA濃度最優(yōu)濃度范圍，以便PCR擴增。2DB22/T2688.1—2017體積μL101試劑成分2×ddPCR預混液上游引物（10μmol/L）下游引物(10μmol/L）1探針(10μmol/L）1模板DNA（1~100ng/μL）4雙蒸水3注1：空白對照實驗時，用雙蒸水替代樣品DNA。注2：陰性對照實驗時，用非目標源性成分替代樣品DNA。注3：陽性對照實驗時，用沙門氏菌陽性成分DNA。7.4微滴生成利用微滴生成儀完成20μL反應體系的分割（6.7）。7.5PCR反應反應條件：95℃/5min，1個循環(huán)；95℃/15s，60℃/1min，40個循環(huán)；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反應產(chǎn)物。體系完成后，進行數(shù)字PCR反應。熒光分析步驟采用FAM單熒光通道。7.6微滴讀數(shù)根據(jù)數(shù)字PCR體系中陰性分割體系的終點熒光值設定熒光的閾值限。閾值限需要對空白和陽性擴增結果進行明顯的區(qū)分。樣品基因沒有得到擴增，擴增終點熒光信號小于閾值，可判定樣品結果為陰性，可報告未檢出樣品基因