第十二章RNA的合成

重點:

RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄過程轉(zhuǎn)錄后加工轉(zhuǎn)錄的調(diào)控

羅杰·科恩伯格

RNA合成的兩種方式：轉(zhuǎn)錄和復(fù)制(某些RNA病毒)

轉(zhuǎn)錄（transcription）：在RNA聚合酶作用下，以DNA為模板指導(dǎo)合成RNA的過程。

轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物：mRNA、rRNA、tRNA、小RNA

第一節(jié)Transcription

RNA鏈的轉(zhuǎn)錄，起始于DNA模板的一個特定位點，并終止于另一特定位點。此轉(zhuǎn)錄區(qū)域稱為一個轉(zhuǎn)錄單位。一個轉(zhuǎn)錄單位可以是一個gene，也可以是多個gene。Gene是遺傳物質(zhì)的最小功能單位，只相當(dāng)于DNA的一個片斷。基因表達包括：RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)翻譯轉(zhuǎn)錄是基因表達的第一步，也是最關(guān)鍵的一步。

轉(zhuǎn)錄的特點：1）基因的轉(zhuǎn)錄是局部轉(zhuǎn)錄2）基因的轉(zhuǎn)錄有選擇性細胞不同生長發(fā)育階段和細胞環(huán)境條件的改變，將轉(zhuǎn)錄不同的基因。3）

轉(zhuǎn)錄是不對稱性的不對稱轉(zhuǎn)錄有兩方面的含義：一是

DNA一條單鏈可轉(zhuǎn)錄，另一條單鏈不轉(zhuǎn)錄；二是

模板鏈并非永遠在同一單鏈上。Fig.Templatestrands反義鏈（無意義鏈，負(fù)鏈）：在RNA的轉(zhuǎn)錄中，用作模板的DNA鏈稱為反義鏈。有義鏈（編碼鏈，正鏈）：在RNA的轉(zhuǎn)錄中，不作為模板的DNA鏈稱為有義鏈。（與mRNA序列相同,僅T、U互換）一、RNA聚合酶RNA合成的基本要求：需要DNA模板底物4種NTP不需要引物RNA聚合酶（RNA鏈延伸方向5’3’），無5’3’及3’5’外切活性1.原核生物RNA聚合酶只有一種RNA聚合酶合成各種RNA（mRNA、tRNA、rRNA）。

RNA聚合酶全酶由5種亞基α2ββ’

σ

組成，σ因子與其它部分的結(jié)合不是十分緊密，它易于與β’βα2分離。

β’βα2亞基組成的酶稱為核心酶——只催化鏈的延長，對起始無作用。五種亞基的功能分別為：

α亞基：與啟動子結(jié)合功能。

β亞基：結(jié)合NTP和新生RNA鏈，含催化部位，起催化作用，催化形成磷酸二酯鍵。

β’亞基：與DNA模板結(jié)合功能。

亞基：在全酶中存在，功能不清楚。

σ亞基：識別起始位點。

不同的原核生物，都具有相同的核心酶，但σ亞基有所差別，識別不同的啟動子(promoter)，從而表達不同的基因，這決定了原核基因表達的選擇性。圖RNA聚合酶圖：RNA聚合酶的催化活性

核心酶覆蓋60bp的DNA區(qū)域，其中解鏈部分17bp左右，RNA-DNA雜合鏈約12bp。RNA聚合酶，還可在酶的前端解螺旋，在后端以相反方向重新螺旋化。

2.真核生物RNA聚合酶真核生物的轉(zhuǎn)錄機制要復(fù)雜得多，三種RNA

聚合酶，在細胞核中起不同的作用。真核生物RNA

聚合酶分類、分布及各自的功能如下表：

真核細胞的RNA聚合酶酶類分布功能α-鵝膏蕈堿對酶的作用ⅡI

Ⅲ核仁核質(zhì)核質(zhì)rRNAmRNAtRNA5SrRNA不抑制低濃度抑制高濃度抑制1.起始（initiation）

RNA聚合酶全酶掃描，與啟動子結(jié)合，局部解鏈區(qū)，找到起始點，然后結(jié)合第一個核苷酸，即啟動子、全酶和核苷酸形成三元起始復(fù)合物。加入的第一個核苷酸常是GTP或ATP，很少是CTP，不用UTP。第一個核苷酸一旦摻入到轉(zhuǎn)錄起始點，σ亞基就會被釋放脫離核心酶。因子僅與起始有關(guān)，RNA的合成一旦開始，因子便被釋放。

E-35-10pppG或pppA5‘5‘3‘3‘模板鏈二、RNA聚合酶催化的轉(zhuǎn)錄過程

2.延長(elongation)

σ亞基釋放，離開核心酶，使核心酶的β’亞基構(gòu)象變化，與DNA模板親和力下降，（σ亞基與β’結(jié)合時，β’亞基的構(gòu)象有利于核心酶與啟動子緊密結(jié)合）在DNA上移動速度加快，使RNA

鏈不斷延長。3.終止（termination）RNA聚合酶到達轉(zhuǎn)錄終止點時，在終止輔助因子的幫助下，RNA鏈和聚合酶脫離DNA鏈。轉(zhuǎn)

錄

過

程三、啟動子和轉(zhuǎn)錄因子啟動子（promoter）：RNA聚合酶識別、結(jié)合并開始轉(zhuǎn)錄所必需的一段DNA序列。轉(zhuǎn)錄因子：RNA聚合酶在進行轉(zhuǎn)錄時，常需要一些輔助因子（蛋白質(zhì)）參與作用，此類蛋白質(zhì)稱為轉(zhuǎn)錄因子。

1.原核啟動子結(jié)構(gòu)與功能啟動子上有保守的共同序列，包括RNA聚合酶識別位點和結(jié)合位點。

（1）-10序列（Pribnowbox）在轉(zhuǎn)錄起點上游約-10處，有一個6bp的保守序列TATAAT，稱Pribnowbox。

保守性：T89A89T50A65A65T100目前認(rèn)為，Pribnowbox決定轉(zhuǎn)錄方向。酶在此部位與DNA結(jié)合形成穩(wěn)定的復(fù)合物，是RNA聚合酶牢固的結(jié)合位點，是啟動子的關(guān)鍵部位。RNA聚合酶結(jié)合后，誘導(dǎo)富含AT的Pribnowbox的雙鏈解開，然后進一步擴大成17個核苷酸長度的泡狀物，在泡狀物中RNA聚合酶從模板鏈開始轉(zhuǎn)錄RNA產(chǎn)物。

（2）-35序列（Sextamabox）（識別區(qū)域）只含-10序列的DNA不能轉(zhuǎn)錄，在-10序列上游還有一個保守序列，其中心在-35位置，稱為-35序列(TTGACA)，此序列為RNA聚合酶識別區(qū)域。各堿基出現(xiàn)頻率：T85T83G81A61C69A52。其中TTG十分保守。

-35序列的功能：它是σ因子的初始識別位點。因此，-35序列對RNA聚合酶全酶有很高的親和性。-35序列的核苷酸結(jié)構(gòu)，在很大程度上決定了啟動子的強度，RNA聚合酶易識別強的啟動子。

圖：啟動子共有序列的功能

Pribnowbox（-10區(qū)）：RNA聚合酶牢固結(jié)合位點，此處AT含量多，是DNA雙鏈局部解開位點。

Sextamabox(-35區(qū))：RNA聚合酶識別位點，該序列提供了RNA聚合酶識別的信號。2.真核啟動子

真核基因的轉(zhuǎn)錄十分復(fù)雜，對啟動子的分析要比原核基因的困難得多。真核生物中有三種不同的RNA聚合酶，因此也有三種不同的啟動子，其中以啟動子Ⅱ最為復(fù)雜。

RNApolⅡ轉(zhuǎn)錄mRNARNApolⅡ的啟動子:

A.TATAbox（Hognessbox）

中心在-25至-30，長度7bp左右。堿基頻率：T82A97A85A63（T37）A83A50（T37）功能：DNA雙鏈解開，并決定轉(zhuǎn)錄的起點位置，失去TATAbox，轉(zhuǎn)錄將可能在許多位點上開始。因此，TATA是大多數(shù)真核基因正確表達所必需的。B.CAAT

box

中心在-75處，9bp，共有序列GGT（G）CAATCT

功能：與RNA聚合酶結(jié)合；可與CTF結(jié)合，控制轉(zhuǎn)錄起始活性。CTF:CAAT-bindingtranscriptionfactorC.GCbox（GCisland）在CAAT框上游，序列GGGCGG，與某些轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，CAAT和GCbox均為上游因子，對轉(zhuǎn)錄的起始效率有較大影響。圖真核啟動子區(qū)元件四、終止子和終止因子

提供轉(zhuǎn)錄終止信號的一段DNA序列，稱為終止子(terminator)

。

協(xié)助RNA聚合酶識別終止子的輔助因子稱為終止因子。

有些終止子的作用可被特異的抗終止因子所阻止，使RNA聚合酶越過終止子繼續(xù)轉(zhuǎn)錄，此為通讀(readthrough)。

終止子位于已轉(zhuǎn)錄的序列中，終止子可被RNA聚合酶或其輔助因子識別。（1）不依賴于ρ的終止子（強終止子）不依賴于ρ因子。強終止子序列有兩個明顯的特征：1）在終止點之前具有一段富含G-C的回文區(qū)域(發(fā)夾結(jié)構(gòu)）；2）富含G-C的區(qū)域之后是一連串U序列（連續(xù)6個）。寡聚U序列可能提供信號使RNA聚合酶脫離模板。（2）依賴ρ的終止子（弱終止子）

依賴ρ的終止子，必需在ρ因子存在時，才發(fā)生終止作用，回文結(jié)構(gòu)不富含G.C，終點前無寡聚U結(jié)構(gòu)。

ρ因子能與RNA聚合酶結(jié)合但不是酶的組分，它的作用是阻止RNA聚合酶向前移動，于是轉(zhuǎn)錄終止，并釋放出已轉(zhuǎn)錄完成的RNA鏈。

通讀往往發(fā)生在強啟動子、弱終止子的基因上。圖：終止子圖：Transcriptionterminationpre-RNAcappingtailingsplicingmethylationediting

生物學(xué)意義：matureRNA

●

preventpre-RNAfromdigestedbyRNase

astemplate(proteintranslation)l

interruptedRNAremoveintrons第二節(jié)RNA轉(zhuǎn)錄后的加工(processing)

RNA聚合酶合成的原初轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，經(jīng)過剪切、修飾、拼接等過程，轉(zhuǎn)變成成熟的RNA分子，此過程稱RNA轉(zhuǎn)錄后的加工。1、mRNA前體的加工：

原核生物mRNA轉(zhuǎn)錄后一般不需要加工，轉(zhuǎn)錄的同時即進行翻譯（半壽期短）。亦有少數(shù)多順反子的mRNA需要核酸酶切成小單位，然后再翻譯。真核生物mRNA（半壽期較長）原初產(chǎn)物很大，被稱為核內(nèi)不均一RNA（heterogeneousnuclearRNA，hnRNA)，需要進一步進行加工修飾轉(zhuǎn)化為mRNA。真核生物mRNA加工順序：5’端連接“帽子”結(jié)構(gòu)3’端切除，添加polyA“尾巴”

hnRNA被剪接，剪掉introns，拼接exons分子內(nèi)部的核苷酸甲基化修飾RNA編輯（RNAediting）

1.CPSF(cleavageandpolyadenylationspecificityfactor)&CstF(cleavagestimulationfactor)bindtothepoly-Asignal,leadingtotheRNAcleavage2.Poly-Apolymerase(PAP)adds~200Asatthe3’endoftheRNA,usingATPasasubstratemRNA的剪接（Splicing)

多數(shù)真核基因是不連續(xù)的、斷裂基因（interruptedgene)，其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物需要剪接。mRNA的剪接包括3種類型：

mRNA前體的剪接類型I自我剪接類型II自我剪接GT-AG規(guī)則RNA的編輯（Editing）RNA的編輯：mRNA轉(zhuǎn)錄后通過插入或刪除核苷酸，或者通過脫氨和氨基化改變堿基的方式，改變和擴大原來模板DNA的遺傳信息的過程。例如：人的載脂蛋白B（ApoB）有兩種形式：ApoB-100和ApoB-48

。ApoB-48是由ApoB-100

mRNA第2153位密碼子CAA（Gln）UAA（終止子）所致。由于催化C變成U的脫氨酶只存在于小腸，故ApoB-48只在小腸合成。RNA編輯極大地增加了mRNA的遺傳信息量。

RNA的編輯的信息來自gRNA（guideRNA）或被編輯RNA自身。2、tRNA前體的加工：原核與真核生物的tRNA轉(zhuǎn)錄后都需要加工。包括：（1）由核酸內(nèi)切酶（RNaseP)將tRNA前體3

和5

端上多余的序列切斷（cutting）；（2）由核酸外切酶(RNaseD)逐個在3

端切去附加序列，進行修剪（trimming）。（3）3’端添加CCAOH序列，有些生物自身帶有CCAOH。（接受活化AA）

（4）核苷的一些特定的堿基和戊糖進行修飾（modifying）。

原核與真核生物的rRNA轉(zhuǎn)錄后也都需要進行加工。E.coli共有三種rRNA（23S、16S和5S）。剛轉(zhuǎn)錄的rRNA為30S，先在特定的堿基上進行甲基化（核糖2

-羥基）修飾，后逐步裂解（核酸酶的切割）。原核rRNA基因與tRNA基因混排在一個操縱子中。

P16P23P516S23S5S（一般不含甲基化）3、rRNA前體的加工：rRNA30S圖：大腸桿菌rRNA加工過程

真核rRNA前體的加工：真核rRNA基因拷貝數(shù)較多，幾十至幾千個之間。哺乳動物：45SrRNA前體，含18S、5.8S、28SrRNA。

果蠅：38SrRNA前體，含18S、5.8S、28SrRNA。

酵母：37SrRNA前體，含17S、5.8S、26SrRNA。以上均由RNApolⅠ轉(zhuǎn)錄。5SrRNA由RNApolⅢ轉(zhuǎn)錄。

rRNA在成熟過程中可被甲基化，位點主要在核糖2’-OH上。真核rRNA甲基化程度比原核的高，約1-2%的核苷酸被甲基化。真核生物的核仁是rRNA合成、加工和裝配成核糖體的場所。第三節(jié)轉(zhuǎn)錄的調(diào)控基因組：cell或病毒所攜帶的全部遺傳信息或整套基因。

細胞的全能性:

生物體的每一個細胞都包含該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)。

基因表達的時間特異性（階段特異性）與空間特異性（又稱細胞特異性或組織特異性）基因表達的調(diào)節(jié)：⑴轉(zhuǎn)錄水平⑵轉(zhuǎn)錄后加工⑶翻澤水平⑷翻譯后加工轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是關(guān)鍵。

cis-actingelementsthestructureofgeneineukaryote,cis-actingelementandtransorcis-actingfactorexonintronATGTAAPolyAsiteAATAAA,30bpdownstreamenhancerterminatordownstreamsilencerinitiationsitepromoterupstreamsilencerupstreamenhancercodingstrandtemplatestrand5’3’12n12n-1TATAboxCAATboxGCbox

transorcis-actingfactors1、順式作用元件調(diào)控作用：順式作用元件：是指DNA分子中具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)功能的特異DNA序列。按功能特性，真核基因順式作用元件分為啟動子、增強子及沉默子。a.

啟動子：決定轉(zhuǎn)錄起始點和轉(zhuǎn)錄頻率。如：TATAbox，GCbox和CAATbox。

b.增強子：由若干機能組件組成，為增強啟動子轉(zhuǎn)錄活性的DNA序列，位于轉(zhuǎn)錄起始點上游（多數(shù)）、下游、內(nèi)含子，長度1~30kb。與轉(zhuǎn)錄激活子結(jié)合，在合適轉(zhuǎn)錄因子存在時表達某一基因，決定基因的時間、空間特異性表達。c.沉默子：某些基因含有的一種負(fù)性調(diào)節(jié)元件，當(dāng)其結(jié)合特異蛋白因子時，對基因轉(zhuǎn)錄起阻遏作用。TATAboxEnhencer-1-200Enhancer-3+10kbto+50kbEnhancer-2-10kbto-50kbGeneregulatoryproteinsGeneregulatoryproteinsgene5’3’RNApolIItranscriptioninitiationcomplexgenecodingregionenhancersilencerenhancersilencerpromoter3’5’exonintronexon

RNApolymerase

Theeukaryoticgenesaremonocistron.

therearenottheoperonsstructureineukaryoticgenomestuctureoflactoseoperonCregulatoryregionInhibitorgeneGeneZGeneYGeneAstructuralgenesregionOp3’5’igeneregion1000bp100bp3520bp760bp810bpbasepair:peptide:(MWkDa)37repressor(4polymer)3230135

-galactosidase(4polymer)

lactosecellgalactose+acetylCoAacetylgalactose+glucosegalactoselactose

-galactosidetransacetyla