納他霉素概述納他霉素早在1955年被Struyk等人發(fā)現(xiàn)，他們從南非納他州的土壤中分離到的納塔爾鏈霉菌（Streptomycesnatalensis）培養(yǎng)液中分離出了一種新的抗真菌物質(zhì)，當(dāng)時(shí)稱為Pimaricin（匹馬菌素）；4年后美國(guó)人Burns等從土壤中分離到了一株恰塔努加鏈霉菌Streptomyceschattanoogensis，并從其培養(yǎng)物中分離到了Tennecetin（田納西菌素）。此后的研究證明匹馬菌素和田納西菌素為同一物質(zhì)，并被世界衛(wèi)生組織WHO統(tǒng)一命名為納他霉素（Natamycin）。納他霉素的性質(zhì)一、納他霉素的分子結(jié)構(gòu)納他霉素為四烯大環(huán)內(nèi)酯，四烯系統(tǒng)呈全順式，內(nèi)酯環(huán)上C9－C13部位為半縮醛結(jié)構(gòu)，含有一個(gè)由糖苷鍵連接的碳水化合物基團(tuán)，即氨基二脫氧甘露糖（Mycosamine）。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1-1所示。納他霉素是兩性物質(zhì)，分子中含有一個(gè)堿性基團(tuán)和一個(gè)酸性基團(tuán)，其電離常數(shù)pKa值分別為8.35和4.6，等電點(diǎn)為6.5，熔點(diǎn)為280℃圖1-1納他霉素的分子結(jié)構(gòu)二、納他霉素的理化性質(zhì)納他霉素是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗真菌物質(zhì)，呈白色或乳白色結(jié)晶粉末，含3個(gè)結(jié)晶水，幾乎無(wú)臭無(wú)味。分子式為C33H47NO13，分子量為665.75。納他霉素的紫外光譜如圖1-2所顯示，分別在290nm、303nm、318nm處有強(qiáng)吸收峰，280nm處有峰肩，220nm處有寬峰。由于納他霉素含有四烯環(huán)，因此在280～320nm之間出現(xiàn)吸收峰，而在220nm的最大吸收是由于納他霉素含有發(fā)色團(tuán)。納他霉素的四烯發(fā)色團(tuán)給分子一種高不飽和特性，可與溴和含活性氧的化合物如高錳酸鉀、高硫酸鹽及過氧化物相互作用；另一方面，它以環(huán)氧族形式保持弱氧化性，納他霉素在冰醋酸中用熱的碘化物處理后會(huì)析出碘。納他霉素酸解可以釋放出海藻糖氨，內(nèi)酯可以通過圖1-2納他霉素的紫外光譜堿水解作用皂化。納他霉素在水中或低級(jí)醇中的溶解性隨著pH的降低或升高而增加，中性時(shí)溶解度最低，而在pH低于3或高于9時(shí)溶解度增大。納他霉素在各種常見溶劑中的溶解度如表1-1所示。表1-1納他霉素的溶解度溶劑溶解度%水0.005~0.01乙醇0.01乙醇80%+水20%0.07甲醇3.3丙二醇1.4~2.0甘油1.5二甲基亞砜5.0冰醋酸18.5納他霉素干粉在避光避潮下較穩(wěn)定，室溫下保存幾年只有很小一部分失活。其三水合物同樣穩(wěn)定，但其無(wú)水形式不穩(wěn)定，在室溫封閉的瓶子中保存48小時(shí)失去15%的活性。中性的納他霉素水溶液幾乎和干粉一樣穩(wěn)定。納他霉素的穩(wěn)定性受pH值、溫度、光照、氧化劑和重金屬等條件的影響。納他霉素在pH4.5～9之間非常穩(wěn)定，在極端pH值下納他霉素迅速失活，形成不同的分解產(chǎn)物。低pH值時(shí)其主要的裂解產(chǎn)物是海藻糖胺；高pH值時(shí)，如pH12，由于內(nèi)酯皂化可形成納他霉酸，用強(qiáng)堿處理導(dǎo)致進(jìn)一步分解，產(chǎn)生一系列的后醛醇反應(yīng)。pH對(duì)納他霉素的抗真菌活性沒有明顯的影響。納他霉素在pH5~7的范圍內(nèi)，30℃儲(chǔ)存三周，其活性仍保持100%，pH3.6時(shí)保持大約85%，pH9.0時(shí)大約為75%，但在大部分食品所在的pH納他霉素的穩(wěn)定性好，50℃放置幾天或100℃短時(shí)處理，其活性幾乎無(wú)損失。納他霉素在紫外光下分解，失去四烯結(jié)構(gòu)。γ輻射也能使納他霉素分解。納他霉素不宜與氧化劑如過氧化氫、漂白粉等接觸，否則抑菌活性會(huì)明顯下降。一些金屬離子可以促進(jìn)納他霉素的氧化失活，尤其是鐵、鎳、鉛、汞等重金屬。因此，納他霉素適宜存放在玻璃、塑料或不銹鋼容器中，也可以添加EDTA或聚磷酸鹽來(lái)防止失活。納他霉素的生理功能和毒理性一、納他霉素的抑菌功能納他霉素是一種廣譜抗生素，對(duì)霉菌、酵母菌、某些原生動(dòng)物和某些藻類有抑制作用（表1－2），但對(duì)細(xì)菌沒有抑制。納他霉素的抑菌機(jī)理一般認(rèn)為是：真菌的細(xì)胞膜含有麥角固醇，而細(xì)菌細(xì)胞膜中不含這種物質(zhì)，多烯大環(huán)內(nèi)酯類抗生素能有選擇的和固醇結(jié)合，結(jié)合的程度與膜的固醇含量成正比，結(jié)合后形成膜-多烯化合物，引起細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致細(xì)胞膜滲透性的改變，造成細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏。納他霉素對(duì)于抑制正在繁殖的活細(xì)胞效果很好，而對(duì)于休眠細(xì)胞則需要較高的濃度。納他霉素對(duì)真菌孢子也有一定的抑制效果。有人測(cè)試過納他霉素對(duì)500種霉菌的抗性，所有菌種都被1～10mg/L的納他霉素抑制。Klis比較了納他霉素、山梨酸、放線菌酮、制霉菌素、龜裂霉素等的抑菌效果，發(fā)現(xiàn)納他霉素對(duì)16種在肉湯和瓊脂中培養(yǎng)的霉菌是最有效的抑制劑，絕大多數(shù)霉菌在0.5～6mg/L的納他霉素濃度下被抑制，極個(gè)別霉菌在10～25mg/L的納他霉素濃度下被抑制，1.0～5.0mg/L的納他霉素能抑制多數(shù)酵母。表1-2納他霉素對(duì)常見微生物的抑制作用微生物名稱MIC（mg/L）梨頭霉菌25.0鏈格孢菌10.0黑曲霉5.0灰質(zhì)葡萄孢菌1.0pimAPimA602轉(zhuǎn)運(yùn)ABCpimBPimB626轉(zhuǎn)運(yùn)ABCpimCPimC352氨基轉(zhuǎn)移酶pimDPimD397細(xì)胞色素P—450單氧化酶pimEPimE549膽固醇氧化酶pimFPimF63鐵氧還蛋白pimGPimG398細(xì)胞色素P—450單氧化酶pimHPimH432流量泵pimIPimI255硫酯酶pimJPimJ343糖脫氫酶pimKPimK458糖基轉(zhuǎn)移酶第二章納他霉素的發(fā)酵生產(chǎn)第一節(jié)納他霉素的生物合成途徑多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素的生物合成途徑可以分為三個(gè)步驟：活化前體的生成（乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A）、內(nèi)酯大環(huán)的生物合成（多聚乙酰途徑）和氨基糖的形成。如圖1-3所示。由于納他霉素生物合成代謝調(diào)控以及前體物質(zhì)在其合成中的作用方面的報(bào)道甚少，因此，已有的報(bào)道更多的是基于多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素生物合成途徑來(lái)進(jìn)行代謝調(diào)控。第二節(jié)納他霉素發(fā)酵及菌種選育一、納他霉素發(fā)酵微生物圖1-3多烯大環(huán)內(nèi)酯抗生素的生物合成途徑納他霉素產(chǎn)生菌為鏈霉菌,鏈霉菌的基內(nèi)菌絲通常發(fā)育良好,多分枝、無(wú)隔膜而連貫，氣生菌絲茁壯，較基內(nèi)菌絲粗，顏色較深,當(dāng)菌絲逐步成熟時(shí),大部分氣生菌絲分化成孢子絲,產(chǎn)生呈長(zhǎng)鏈的孢子，孢子被外鞘所包，鞘表面平滑或帶各種裝飾物,在電子顯微鏡下表現(xiàn)為雙短桿鑲嵌狀,有鱗片或形狀和大小不同的突起、刺或毛發(fā)等；孢子的分裂方式也有差異，有的沿橫膈中央平切，有的兩端渾圓，由殘余的鞘相連。目前，報(bào)道的納他霉素生產(chǎn)菌有三種：1、恰塔努加鏈霉菌Streptomyceschattanovgensis，ATCC13358，其形態(tài)特征為孢子絲圈至螺旋形，有時(shí)柔曲；孢子呈球形或橢圓形，表面帶細(xì)刺。2、納塔爾鏈霉菌Streptomycesnatalensis，ISP5357，其形態(tài)特征為孢子絲2～5圈松敞螺旋形；孢子呈球形或卵圓形，表面帶小刺。3、褐黃孢鏈霉菌Streptomycesgilvosporeus，ATCC13326，其形態(tài)特征為孢子絲螺旋形；孢子呈球形或卵圓形，孢子表面帶刺。二、納他霉素發(fā)酵菌種選育1、菌種篩選與誘變鏈霉菌可產(chǎn)生大多數(shù)已知的抗生素、動(dòng)物生長(zhǎng)促進(jìn)劑等生物活性物質(zhì)。由于鏈霉菌的抗生素生物合成基因趨于成簇排列，共同控制鏈霉菌的抗生素生物合成，因而利用基因技術(shù)很難將全部抗生素生物合成基因克隆表達(dá)出來(lái)。采用傳統(tǒng)的育種方法，即利用各種理化因子對(duì)鏈霉菌進(jìn)行誘發(fā)突變，可以使其抗生素產(chǎn)量得到提高。但由于誘變所產(chǎn)生的突變是隨機(jī)的，并且突變頻率低，只有10-3～10-6，在突變株中，多數(shù)為負(fù)向變異，生產(chǎn)需用的正變株的突變頻率更低。由于基因突變是不定向的，如果盲目上搖瓶進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)式篩選，必然導(dǎo)致目標(biāo)菌株篩選工作量大，直接影響了誘變育種的效率。因此，在誘變完成后，如何定向篩選出正向突變株則是一項(xiàng)更重要的工作。納他霉素產(chǎn)生菌鏈霉菌的產(chǎn)抗生素能力與鏈霉素抗性基因之間的對(duì)應(yīng)關(guān)系是目前抗生素科研領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)。Ochi等人從多種鏈霉菌中獲得rel突變株，rel突變株的共同特點(diǎn)是其產(chǎn)抗生素能力消失，并且菌體內(nèi)積累鳥苷四磷酸（ppGpp）的能力明顯下降。而在同種鏈霉菌的正常菌株中菌體形態(tài)分化和產(chǎn)抗生素的開始往往伴隨ppGpp的激增。這表明ppGpp是次級(jí)代謝起始的優(yōu)勢(shì)信號(hào)因子，對(duì)抗生素生產(chǎn)的啟動(dòng)具有重要作用。1996年，Shima等人通過抗性突變使原本不產(chǎn)放線菌紫素的S.lividans產(chǎn)生放線菌紫素。DNA測(cè)序顯示該鏈霉素抗性突變株中編碼核糖體蛋白S12的rpsL基因中Lys-88突變?yōu)镚lu。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)表明這種鏈霉素抗性基因突變可以使rel突變株恢復(fù)抗生素的生產(chǎn)，而沒有伴隨ppGpp的積累。這些研究證明鏈霉素抗性突變株能夠在無(wú)需ppGpp的情況下，經(jīng)過一個(gè)尚不明確的途徑最終恢復(fù)次級(jí)代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)。1997年，Hesketh等人提出了一種提高S.coelicolor生產(chǎn)放線菌紫素的育種新方法。該方法利用鏈霉素抗性突變作為篩選手段進(jìn)行誘變育種，極大的提高了工作效率。2001年，Haifeng等人發(fā)現(xiàn)慶大霉素和利福平都可以代替鏈霉素作為抗性篩選條件，并獲得同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這些研究使這一方法具有了普遍性意義。2、菌種保藏與分離復(fù)壯對(duì)于生產(chǎn)納他霉素的放線菌來(lái)說，可以采用定期移植保藏法或冷凍真空干燥保藏法，這兩種方法操作簡(jiǎn)便，效果較好。定期移植保藏法一般使用高氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基或察氏瓊脂培養(yǎng)基等，培養(yǎng)溫度28℃左右，保藏溫度4℃～6℃，保藏濕度在50%～70%以下為宜。每三個(gè)月移植一次。如果采用冷凍真空干燥保藏法，凍干的菌株能在更長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持著生命力，并能相對(duì)減少經(jīng)常移植引起的變異。只不過凍干保藏法要求操作技術(shù)比較熟練。冷凍真空干燥保藏法保藏的菌株可在室溫存放，也可在低溫（4℃～凍干的菌種經(jīng)貯藏后，需用時(shí)可在無(wú)菌室內(nèi)開啟安培管進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng)。其步驟如下：先用銼刀將安培上部橫銼一道痕跡，用燒熱的玻璃棒置痕跡處，安培壁上立即出現(xiàn)裂紋，當(dāng)空氣進(jìn)入后再行打開，用無(wú)菌吸管將液體培養(yǎng)基如營(yíng)養(yǎng)肉汁、麥牙汁加入安培管中，溶化干燥的樣品，搖勻，再用無(wú)菌吸管吸取溶化的液體并移入適宜的培養(yǎng)基上，在最適溫度下培養(yǎng)。第三節(jié)納他霉素發(fā)酵工藝一、發(fā)酵碳源、氮源及營(yíng)養(yǎng)條件納他霉素發(fā)酵所采用的原材料主要為大豆蛋白抽提物，酵母抽提物，葡萄糖，原料的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為通用發(fā)酵用標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)表明，原材料的產(chǎn)地和質(zhì)量對(duì)發(fā)酵有較大影響，原材料的確定除了其他化驗(yàn)指標(biāo)外，搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果是極為重要的依據(jù)。有人認(rèn)為用非酵母蛋白和酵母蛋白的混合物作為培養(yǎng)基中的氮源，可提高納他霉素的發(fā)酵效價(jià)。研究了豆油、淀粉、木糖、糊精、甘油、乳糖、蔗糖、菜籽油和葡萄糖等不同碳源對(duì)納他霉素發(fā)酵的影響，結(jié)果表明葡萄糖是最適碳源，并且當(dāng)葡萄糖濃度為36.0g/L時(shí)，納他霉素產(chǎn)量最高。同時(shí)，選擇大豆蛋白胨和酵母粉為復(fù)合氮源，會(huì)進(jìn)一步以高納他霉素發(fā)酵單位。優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成為：種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨6，酵母粉6，NaCl10，pH7.0。發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：大豆蛋白分離物20，酵母粉4.5，葡萄糖（50％葡萄糖單獨(dú)滅菌）40，pH7.0。也有研究認(rèn)為僅采用能夠促進(jìn)菌體快速增長(zhǎng)的葡萄糖為唯一碳源，效果并不好，并且，隨其濃度的增加會(huì)產(chǎn)生“葡萄糖效應(yīng)”。針對(duì)這種情況，可采用復(fù)合碳源，即采用可快速利用碳氮源加慢效碳氮源的方法。這樣，有可能消除“葡萄糖效應(yīng)”。Eisenschink等人報(bào)道了流加碳、氮源進(jìn)行納他霉素發(fā)酵的過程。指出發(fā)酵培養(yǎng)基中至少應(yīng)有15g/L的蛋白氮源，其中碳源要不斷流加，使碳源濃度保持在5～30g/L，納他霉素產(chǎn)量可達(dá)至少5g/L。三、發(fā)酵工藝條件影響納他霉素發(fā)酵的因素主要是溫度和pH。選擇了23℃~35℃之間共7個(gè)溫度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，菌體量和納他霉素產(chǎn)量在25℃~29℃溫度范圍內(nèi)隨著溫度的升高而增大，29℃時(shí)達(dá)到最大值。當(dāng)溫度高于29℃時(shí)，納他霉素隨著溫度升高而減小，特別是溫度高于31℃后，菌體量和納他霉素的值都迅速下降。將初始pH值分別調(diào)為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，發(fā)酵96h測(cè)定納他霉素產(chǎn)量，結(jié)果表明，當(dāng)初始pH值在7.5～8.0之間時(shí)，納他霉素的產(chǎn)量最高。也有報(bào)道認(rèn)為發(fā)酵過程中通過添加NaOH或KOH或Ca(OH)2四、種子和接種量獲得菌種后首先要進(jìn)行菌種的活化，從安培管中接種一環(huán)于裝有50mL液體活化培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，29℃，200r/min振蕩培養(yǎng)48h，轉(zhuǎn)接于保藏斜面，29℃恒溫培養(yǎng)10天左右，待斜面完全被孢子覆蓋，在發(fā)酵前，要先制備孢子懸浮液和進(jìn)行種子培養(yǎng)，用適量無(wú)菌水洗下瓊脂斜面上長(zhǎng)好的孢子，將孢子懸浮液置于裝有玻璃珠的三角瓶中，在振蕩器上充分振蕩，使孢子均勻分散，孢子濃度為105～1010CFU/mL；然后取一定量的孢子懸浮液接種于種子培養(yǎng)基中，29℃，通風(fēng)培養(yǎng)30h分別將以培養(yǎng)18、20、22、24、26、28、30h的種子以1％～15％的不同接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵96h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)種齡為24h、2％接種量的種子所產(chǎn)生的納他霉素量最高。另外，研究表明，用孢子接種比用營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞接種的納他霉素產(chǎn)量高40%。五、納他霉素發(fā)酵Borden和Raghoenath兩個(gè)研究小組發(fā)現(xiàn)，褐黃孢鏈霉菌經(jīng)發(fā)酵罐放大培養(yǎng)總發(fā)酵周期為250h，因供氧及產(chǎn)物濃度等原因，攪拌速度在不同時(shí)期有所不同，發(fā)酵初期的攪拌速度較低，到發(fā)酵后期，由于產(chǎn)物及代謝物的積累，產(chǎn)物的生成速率下降，故應(yīng)適當(dāng)提高攪拌速度以保持發(fā)酵罐內(nèi)足夠的溶解氧水平；還可采取持續(xù)地抽去發(fā)酵罐中的培養(yǎng)液，同時(shí)，以與之相同的速率向發(fā)酵罐中添加新培養(yǎng)液，這樣就避免有害代謝物在發(fā)酵罐中過度積累，及時(shí)補(bǔ)充新鮮的營(yíng)養(yǎng)成分。另外，在發(fā)酵后期，添加的新鮮培養(yǎng)液各營(yíng)養(yǎng)成分的濃度比原來(lái)的培養(yǎng)液都有所增加，這也有利于產(chǎn)物的進(jìn)一步生成。發(fā)酵過程中，培養(yǎng)液中各成分的濃度和類型都會(huì)影響納他霉素的生物合成，其中碳氮比是關(guān)鍵因素之一，氮源促進(jìn)菌體的生長(zhǎng)繁殖，同時(shí)要在發(fā)酵中流加補(bǔ)充適當(dāng)?shù)奶荚矗ㄆ咸烟牵?。在發(fā)酵前期葡萄糖的濃度為40g/L，到發(fā)酵后期則為20g/L，此時(shí)菌體生長(zhǎng)和納他霉素的產(chǎn)量均達(dá)到最佳值。有資料表明，氮源的類型對(duì)菌體生長(zhǎng)和納他霉素的產(chǎn)量有較大影響，菌體細(xì)胞生長(zhǎng)最好的氮源是酵母抽提物，而納他霉素產(chǎn)生的最佳氮源是牛肉浸出物，所以將兩種氮源混合使用則使納他霉素的產(chǎn)量增加兩倍。采用5L自動(dòng)發(fā)酵罐進(jìn)行了納他霉素的分批發(fā)酵，確定的發(fā)酵工藝條件為初始葡萄糖濃度：40g/L；以體積比2%的接種量接種于5L罐內(nèi)；空氣流速6L/min，起始轉(zhuǎn)速200rpm，當(dāng)溶氧下降至40%以下，增加轉(zhuǎn)速；29℃；發(fā)酵96h，納他霉素的產(chǎn)量為2.75g/L納他霉素的提取和精制一、納他霉素的提取納他霉素的分離提取方法有很多。專利GB846933報(bào)道了利用甲醇、丁醇和丙酮等從發(fā)酵液中提取納他霉素的方法。美國(guó)專利NO.3378441報(bào)道了用限制性水溶性有機(jī)溶劑萃取納他霉素。也有專利報(bào)道了鹽析法提取納他霉素，包括溶劑溶解，蒸發(fā)和納他霉素析出。另外，專利GB2106498報(bào)道了體積濃縮法和從過濾后的發(fā)酵液中用丁醇回收納他霉素，從中可分離納他霉素。世界專利WO92/10580報(bào)道了在低pH條件下用甲醇溶解納他霉素，然后除去固形物，提高pH以沉淀析出納他霉素。這些提取過程一般要求多級(jí)純化，操作費(fèi)用比較昂貴，而且納他霉素對(duì)酸降解非常敏感，存在提取量低的缺點(diǎn)。1999年美國(guó)專利5942611報(bào)道了一種有效的提取高質(zhì)量納他霉素的方法，該方法的提取過程主要包括四步：（1）用錯(cuò)流過濾發(fā)酵液，濃縮至發(fā)酵液濃度達(dá)到10～50%（W/V），濃縮過程中，可以在50～70℃條件下加熱發(fā)酵液以提高蒸發(fā)量和過濾速率。（2）調(diào)節(jié)發(fā)酵液的pH在10～11，添加足夠量的水溶性有機(jī)溶劑如乙醇、丙醇、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等溶解發(fā)酵液中的納他霉素?？赏ㄟ^加抗氧化劑如抗壞血酸、BHA、BHT等來(lái)進(jìn)一步提高納他霉素的穩(wěn)定性。（3）通過錯(cuò)流過濾除去沒有活性的發(fā)酵不溶物。（4）調(diào)節(jié)過濾液的pH在5.5～7.5范圍內(nèi)，使納他霉素沉淀。過濾得到析出的晶體，可用于進(jìn)一步純化，干燥。通過這種方法，干燥產(chǎn)品純度可達(dá)94～99%（無(wú)結(jié)晶水計(jì)算），納他霉素回收率可達(dá)40～70%。二、納他霉素的精制Millis等人開發(fā)了甲醇法精制納他霉素，其處理過程如下：將甲醇加入到含有經(jīng)提取的納他霉素粗品溶液中，使溫度不超過15℃；調(diào)節(jié)溶液pH為1.0～4.5，除去溶液中析出的固體，并將pH調(diào)至6.0～9.0，這時(shí)純的納他霉素就會(huì)析出沉淀。納他霉素的檢測(cè)一、生物檢測(cè)法納他霉素效價(jià)的生物檢測(cè)法主要采用管碟法。管碟法利用抗生素在瓊脂培養(yǎng)基中的擴(kuò)散滲透作用，將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液和未知濃度的樣品在含有敏感性實(shí)驗(yàn)菌的瓊脂表面進(jìn)行擴(kuò)散滲透，由于對(duì)被試菌的抑制作用而產(chǎn)生抑菌圈，抑菌圈的大小和抗生素的濃度之間有一定的比例。這個(gè)方法利用抗生素抑制敏感菌的特點(diǎn)，符合臨床使用的實(shí)際情況，而且靈敏度高，接近0.5μg/ml，不需特殊設(shè)備，為國(guó)際公認(rèn)。二、色譜分析1.紙色譜法表1-4用Whatman1號(hào)濾紙通過以下幾種色譜系統(tǒng)進(jìn)行分析，色譜斑用生物自顯影測(cè)定。溶劑系統(tǒng)Rf值正丁醇/水，飽和液0.33正丁醇/乙醇/水（5:1:4）—正丁醇/水（7:3）－三乙胺/甲酰胺/水（10:3:10）上層0.332.薄層色譜法表1-5用于納他霉素的薄層色譜系統(tǒng)穩(wěn)定相溶劑系統(tǒng)（表1-6）測(cè)定方法（表1-7）Rf值硅膠G（MerckpH8）110.34硅膠G（Merck）210.34硅膠G（Merck）32，30.57硅膠G（Merck）440.40硅膠G（Merck）540.54硅膠G（Merck）62，30.18硅膠G（Merck）72，30.55硅膠G（Merck）82，30.75硅膠G（MerckpH3）92，30.60硅膠G（Merck60F254）1050.59硅膠G（Merck60F254）116，100.40硅膠GF（Analtech）127，80.33PolygramSilGfoil(M和N)137，80.45交聯(lián)葡聚糖G-1514110.70表1-6用于納他霉素的薄層系統(tǒng)的溶劑系統(tǒng)1乙醇/氨/水8:1:12正丁醇/乙酸/水3:1:13甲醇/異丙醇/乙酸90:10:14甲醇/丙酮/乙酸8:1:15乙醇/氨/二惡烷/水8:1:1:16正丁醇/吡啶/水3:2:17正丁醇/吡啶/乙酸/水15:10:3:128正丁醇/乙酸/水/二惡烷6:2:2:19正丁醇/乙酸/水2:1:110三氯甲烷/甲醇/乙酸/水6:2:2:111三氯甲烷/甲醇/0.05M硼酸緩沖液pH8.32:1:1較低層12正丁醇/乙酸/水4:1:5上層13正丁醇/乙酸/水4:1:2:1140.025M硼酸緩沖液pH6.0含0.5MNaCl表1-7用于納他霉素薄層色譜測(cè)定方法110%高錳酸鉀/0.2%溴酚藍(lán)25%高錳酸鉀3濃縮磷酸100℃40.2%P-二甲基氨基苯甲醛在含微量氯化鐵的濃硫酸中51%P-二甲基氨基苯甲醛＋20%三氯化銻醇溶液和20%(v/v%)的濃鹽酸6濃硫酸105℃7碘蒸氣8濃硫酸/冰醋酸1:19濃硫酸/甲醇1:210茚三酮11生物自顯影3.高效液相色譜（HPLC）法高效液相色譜（HPLC）法檢測(cè)納他霉素廣泛采用C18反相柱，納他霉素在303nm處有最大吸收峰，所以檢測(cè)器采用UV檢測(cè)器，常見流動(dòng)相和典型的檢測(cè)條件如表1-8和表1-9。表1-8HPLC法檢測(cè)納他霉素常用流動(dòng)相流動(dòng)相配比（V/V）甲醇：水65：35甲醇：水：冰醋酸48：32：1甲醇：水：冰醋酸60：40：5甲醇：水：四氫呋喃44：47：2（含1%的醋酸氨）甲醇：水：磷酸55：45：3表1-9二種典型的納他霉素測(cè)定的高壓液相色譜系統(tǒng)條件一條件二儀器SpectraphysicsSP800色譜Shimadzuclass10Avp色譜檢測(cè)器SchoeddelSF770j二級(jí)管陣列柱子μbondapakC183.9×300mmC184.6×150mm流動(dòng)相甲醇:重蒸水:四氫呋喃（440:470:20）含1%醋酸銨甲醇:水:磷酸(550:450:3)流速2ml/min1ml/min測(cè)定波長(zhǎng)303nm303nm保留時(shí)間13.5min10.9min利用HPLC檢測(cè)沙拉醬中納他霉素含量。首先利用冰乙酸：水(5：40)直接提取沙拉醬中的納他霉素，離心分離后，在高效液相色譜儀上于波長(zhǎng)305nm處測(cè)定其含量。高效液相色譜條件：色譜柱為大連依利特科學(xué)儀器有限公司HYPERSTLBDSC184.6id×150mm。柱溫：40℃;流動(dòng)相：甲醇：水：冰乙酸(60：40：5)；流速：1.00mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：UV305nm；進(jìn)樣量：10μL；峰面積定量。該方法操作簡(jiǎn)易，精密度CV＝2.4％；線性范圍0～10μg/mL4.分光光度法HarryBrik研究了在含有0.1%乙酸的甲醇中納他霉素的紫外光譜，乙酸作為波長(zhǎng)穩(wěn)定劑。納他霉素的紫外光譜顯示，在α=290、303、318nm處有尖銳的最大吸收峰，因此紫外分光光度法可檢測(cè)納他霉素。采用紫外分光光度測(cè)定法，在303nm處可以測(cè)定納他霉素的含量，此法稱為“一點(diǎn)法”，但該方法不能精確定量納他霉素的生物活性；依據(jù)在303nm的最大吸收值，以及在295nm和311nm的吸收值，可以測(cè)定納他霉素的含量，稱為“基線法”，基線吸收的公式為A303－(A295＋A311)/2。納他霉素在強(qiáng)鹽酸作用下瞬間顯示藍(lán)色，自身形成陽(yáng)離子，這是比色法測(cè)定納他霉素的原理。在水浴中，四個(gè)體積的甲醇（含30～90μg/ml的納他霉素）中加入十個(gè)體積的含20％乙醇的鹽酸，13～15min后，在635nm處測(cè)定其吸收。一定量的酸和納他霉素的堿降解產(chǎn)物不會(huì)干擾測(cè)定。另外，納他霉素在氨基苯乙酮存在下，堿水解產(chǎn)物形成一種紅色的發(fā)色團(tuán)，這種方法更靈敏，但糖和納他霉素的堿分解產(chǎn)物干擾測(cè)定。納他霉素的分析干擾因素較多，各種方法也各有優(yōu)缺點(diǎn)。分光光度法、比色法和滴定法較為簡(jiǎn)單，但是結(jié)果不能排除干擾因素的影響，難以精確定量；微生物分析法較為直觀，操作也不復(fù)雜，易于在實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn)；高效液相色譜法測(cè)定的結(jié)果較為精確。第三章納他霉素的應(yīng)用一、納他霉素使用的國(guó)內(nèi)外標(biāo)準(zhǔn)WHO和FAO規(guī)定消費(fèi)者每天納他霉素最大攝入量（ADI）為0.3mg/kg體重，奶酪和香腸的一般消費(fèi)者每天攝入量為0.002mg/kg體重。1998年GRAS專家組認(rèn)定納他霉素用于酸奶、奶油、干酪、酸性稀奶油和農(nóng)家干酪非常安全。目前，荷蘭、比利時(shí)、法國(guó)、西班牙、意大利、瑞典等國(guó)家都允許納他霉素用于干酪和硬香腸的防腐，荷蘭還批準(zhǔn)納他霉素用于蘋果和梨的防腐。在中國(guó)，納他霉素被批準(zhǔn)用于干酪、肉制品、月餅、糕點(diǎn)、果汁原漿以及易發(fā)霉食品加工器皿的表面，一般采用200～300mg/kg懸浮液浸泡或噴灑，殘留量不超過10mg/kg。納他霉素也被批準(zhǔn)添加到發(fā)酵酒、酸奶和色拉醬中，限量為10mg/kg（食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)：GB2760-96，17.0,防腐劑）。目前，全世界已有三十多個(gè)國(guó)家采用納他霉素作為食品防腐劑。二、納他霉素在食品中的應(yīng)用1982年6月，美國(guó)FDA正式批準(zhǔn)納他霉素可用作食品防腐劑。1990年1月9日，我國(guó)衛(wèi)生部食品監(jiān)督廳簽發(fā)了國(guó)內(nèi)第一個(gè)生物食品防腐劑Nisin(乳酸鏈球菌素或稱乳鏈球菌肽)的使用合格證明，到1996年，中國(guó)食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會(huì)正式批準(zhǔn)納他霉素可作為食品防腐劑。乳鏈球菌肽對(duì)革蘭氏陽(yáng)性腐敗細(xì)菌有抑制作用，對(duì)酵母菌及霉菌等絲狀真菌無(wú)效；而納他霉素對(duì)酵母菌及霉菌等絲狀真菌有極強(qiáng)的抑制或殺滅作用，這一點(diǎn)正好與乳鏈球菌肽的抑菌譜互補(bǔ)。納他霉素由于溶解度低，被用作食品表面防腐劑以增加貨架期，主要在奶酪、肉制品等，它不會(huì)干擾其它食品組分，也不會(huì)帶來(lái)異味。它在食品中的抗真菌作用是雙效的：既可防止真菌引起的食品腐敗，減少經(jīng)濟(jì)損失；又可防止真菌毒素給人類造成的毒素型食物中毒。與傳統(tǒng)的抗真菌劑比較，納他霉素有其獨(dú)特的性質(zhì)，它在很低的濃度下仍具有活性，例如：在奶酪中納他霉素比山梨酸鉀活性高400倍。在葡萄酒中，納他霉素能取代山梨醇和其它抗真菌劑，它允許減少所使用的SO2量。1、干酪納他霉素應(yīng)用于奶酪生產(chǎn)的工藝已很成熟，有關(guān)的報(bào)道從70年代至今多不勝舉。納他霉素用于干酪皮防止其表面發(fā)霉，它不會(huì)滲透到干酪內(nèi)部，僅僅停留在酪皮外層，而這一部分一般不會(huì)被取食，干酪放置5-10周后，納他霉素基本消失，此時(shí)酪皮變硬不易受到霉菌侵染，納他霉素對(duì)細(xì)菌無(wú)效，因而不會(huì)影響干酪和干酪制品的熟化。使用方法一般有浸泡、噴灑或乳劑覆膜。0.5%（w/v）的納他霉素用于奶酪就可有效防止絲狀真菌的污染。2、肉制品在肉制品中使用2000mg/kg的納他霉素混懸液對(duì)其進(jìn)行浸泡或噴灑，可達(dá)到納他霉素含量為8μg/cm2安全而有效的防霉水平。對(duì)于香腸來(lái)說，納他霉素可在以下數(shù)個(gè)步驟中添加：發(fā)酵前；腸衣浸泡；已灌料香腸的浸泡；已灌料香腸的表面噴灑。對(duì)于硬香腸來(lái)說，納他霉素的推薦用量為腸衣浸漬液質(zhì)量的0.05~0.2%。3、果汁納他霉素在果汁中的應(yīng)用也很廣泛。對(duì)于葡萄汁，添加20mg/kg納他霉素就能防止酵母發(fā)酵；橙汁在自然條件下保存一周就會(huì)受到真菌的污染，而使用1.25mg/kg低劑量的納他霉素就可以確保橙汁的保質(zhì)期達(dá)到8周；對(duì)于蘋果汁，30mg/kg的納他霉素能在6周內(nèi)防止發(fā)酵變質(zhì)，并且使果汁的原有風(fēng)味基本保持不變。4、茶飲料納他霉素用于茶飲料，可以有效防止真菌腐敗，保證了茶飲料可接受的感官特性。5、水果納他霉素用于水果儲(chǔ)存中，可有效防止真菌引起的有氧降解。將整個(gè)蘋果浸泡在含有500ppm納他霉素的懸液中1~2分鐘后，經(jīng)過8個(gè)月的存放，能有效降低蘋果變質(zhì)的數(shù)目。另?yè)?jù)報(bào)道，用卵磷脂—納他霉素混合液浸洗蘋果可有效防止