最新臨床微生物實驗室真菌檢測能力建設(shè)基本要求專家共識

近年來侵襲性真菌翩呈持續(xù)增多趨勢，準確、早期診斷是治療疾病的關(guān)

鍵。然而，目前我國臨床實驗室真菌檢測能力離臨床診治需求尚有較大差

距，亟待改進。

國家衛(wèi)生計生委辦公廳于2016年底發(fā)布了《關(guān)于提高二級以上綜合醫(yī)院

細菌真菌感染診療能力的通知》（國衛(wèi)辦醫(yī)函[2016]1281號），要求在

2020年以前加強臨床細菌真菌感染診療體系的建設(shè)，促進抗菌藥物的合

理應用，維護人民群眾健康。本共識的制定旨在建立臨床微生物實驗室真

菌檢測能力基本要求，推動真菌檢測技術(shù)的普及和人員能力的提升，從而

提高綜合醫(yī)院真菌蜂診療能力。

一.術(shù)語和定義▼

（-）酵母菌

單細胞真菌呈圓形或卵圓形，以出芽方式繁殖，稱為酵母菌（yeast）。

臨床致病的酵母菌主要包括念珠菌、隱球菌、毛泡子菌等。

（二）絲狀真菌

多細胞真菌有菌絲和泡子，菌絲延長分枝,交織成團，稱為絲狀真菌

又稱霉菌（。臨床重要的絲狀真菌包括

（filamentousfungi）omold）

曲霉菌、毛霉菌、鐮刀菌等。

（三）雙相型真菌

有些真菌可因環(huán)境條件（如營養(yǎng)、溫度、氧氣等）改變，由一種形態(tài)轉(zhuǎn)變

為另一種形態(tài)，稱為雙相型真菌如球胞子菌、組

（dimorphicfungi）,

織胞漿菌、芽生菌、泡子絲菌、馬爾尼菲籃狀菌等。這些真菌在體內(nèi)或在

含動物蛋白的培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)時呈酵母相；而在普通培養(yǎng)基，25℃

培養(yǎng)時呈霉菌相。

二.環(huán)境和設(shè)施要求^

真菌實驗室環(huán)境和設(shè)施的設(shè)計應確保實驗的質(zhì)量和生物安全。

（-）環(huán)境要求

真菌實驗室應與細菌、病毒等實驗室區(qū)分，以防發(fā)生交叉污染。其面積以

滿足工作和安全要求為宜，合理布局。在建設(shè)實驗室或開展實驗活動之前，

應進行生物危害評估。

（二）基本設(shè)施

設(shè)置防飛蟲紗窗和門禁，有充足的照明、應急燈、通風、供水、供電、緊

急疏散標識及信息系統(tǒng)，工作區(qū)設(shè)有洗手池、應急淋浴和洗眼裝置；門外

有生物安全級別標識口］。

配置生物安全柜和不同溫度培養(yǎng)箱（至少包括25~30℃以及35~37CC\

設(shè)置耐化學品和消毒劑腐蝕的防護用品及器材。

（三）氣流要求

實驗室宜設(shè)計負壓或定向氣流,主實驗室氣流應由清潔區(qū)送入操作區(qū)。生

物安全柜為n級，其高效過濾器對于直徑為0.3pm的微粒過濾效率不低

于99.99%[2]。

（四）消毒措施的管理

工作臺面可用5%石碳酸或0.5%過氧乙酸或含氯消毒劑（500mg/L）消

毒。如遇操作臺被真菌或標本污染，應立即覆蓋紙巾，并用5%石碳酸或

含氯消毒液（2000mg/L）消毒20min。切忌用水沖洗，以免污染擴散

高壓滅菌效果建議使用指示條以及生物指示劑進行監(jiān)測。

[3]e

（五）醫(yī)療廢物的管理

真菌培養(yǎng)標本及污染物在丟棄前，需做好生物安全防護，廢棄物的容器或

包裝材料應當符合防水、防破損、防外泄的要求，特別是絲狀真菌，建議

用醫(yī)用膠布或透明膠帶密封后高壓滅菌⑷。

實驗室廢物的最終處置應交由經(jīng)當?shù)丨h(huán)保部門資質(zhì)認定的醫(yī)療廢物處理

單位集中處置。

（六）絲狀真菌處理的生物安全要求

絲狀真菌的檢測需在n級生物安全柜內(nèi)進行，特別是可疑高致病性病原真

菌（莢膜組織胞漿菌、粗球泡子菌等），嚴格執(zhí)行《病原微生物實驗室生

物安全通用準則》進行操作及處理［5］。BSL-2級臨床微生物實驗室不建議

對高致病性真菌進行大量活菌的操作（如大量活菌的傳代培養(yǎng)，藥敏試驗

等）56］。

三、人員要求^

臨床微生物實驗室真菌專業(yè)組人員配置應根據(jù)開展的真菌檢測項目及工

作量適當配置。人員要取得檢驗相關(guān)上崗證，經(jīng)過真菌崗位的基本培訓K崗

前培訓、持續(xù)培訓I）和工作能力的評估。

培訓內(nèi)容至少包括：（1）生物安全，實驗室設(shè)施設(shè)備安全使用，檢測前、

中、后的風險及突發(fā)事件的處理；（2）檢測技能，所開展檢測項目的基

本原理、參考區(qū)間、質(zhì)量控制、結(jié)果影響因素和實驗室信息系統(tǒng)的使用等；

（3）倫理和患者信息的保密等。

能力評估包括：（1）常規(guī)工作的過程和程序以及安全操作；（2）設(shè)備維

護和功能檢查；（3）檢驗結(jié)果的記錄和報告過程；（4）核查工作記錄和

解決問題的技能等。評估方法：對新進的員工,在最初6個月內(nèi)應至少進

行2次能力評估，其他員工應每年進行1次能力評估，并對每位員工的評

估結(jié)果進行記錄,并據(jù)此授予相關(guān)檢測權(quán)限。

四、儀器和試劑要求^

（-）對實驗室儀器和設(shè)備的要求

真菌實驗室應根據(jù)各自醫(yī)院的規(guī)模和診治對象的不同需求，配備符合工作

要求的儀器和設(shè)備⑺。儀器設(shè)備要求見表1。

表1真的實聆室儀耨和設(shè)備的配置要求

技術(shù)平臺基本配25費求建議配置

樂本芟索及處理口曝生哈^怛京本自動接并儀

百通專心機白蝌片嘰

2~B5atM心嘰

海底滅?-B00盛溫?鋁■

影態(tài)學校檢苔謖先字至￡<83璃0矢或25停工集儀.天光旻蘇的

ass??25-30工?3A37工的苗1灣霜可用于量附國機所需其他混曲再用

全自動0培美儀

年/全日為501￡三分析。甚質(zhì)曲意光解限電離飛行STS）度圖儀

手工法不5押展以號設(shè)，華/全臺旗IS色載分析第線

免費字衣宜蟻.EUS/6■折儀或洗饋機.修標儀?

K暫壬界傳新方法■分子演斷罕名：PCRFW儀.測序儀等

注：：無?設(shè)

儀器裝機后，在臨床使用前，應按照說明書對各儀器的關(guān)鍵性能進行相應

的驗證和評價,如對檢測準確度、精密度、可報告范圍等進行驗證，性能

驗證通過后方可用于臨床檢測。生物安全柜應根據(jù)使用頻率定期（每年至

少1次進行安全性能檢測,必要時更換高效濾膜或進行甲醛熏蒸消毒［4］。

（二）對實驗室檢測試劑的要求

真菌相關(guān)實驗室檢測試劑，應滿足國家對檢驗試劑的相關(guān)要求，實驗室應

按照制造商或相關(guān)指南、規(guī)范的說明和建議儲存試劑。商品化試劑或?qū)嶒?/p>

室自制試劑都需要在使用前嚴格進行性能驗證，實驗過程中做好質(zhì)量控制。

五.檢測技術(shù)要求▼

真菌檢測技術(shù)包括形態(tài)學檢查、培養(yǎng)、鑒定、藥敏試驗、免疫學檢測、分

子生物學檢測等。直接涂片鏡椅簡便、快速，能夠在各級醫(yī)院開展，經(jīng)染

色后鏡檢可更為清晰地觀察其形態(tài)學特征，對臨床診斷具有重要價值。合

格標本（無菌部位尤其血培養(yǎng)的臨床價值高）經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)菌落大小、形

態(tài)、顏色可初步判斷，并進一步做鑒定和藥敏試驗。使用顯色平板和基質(zhì)

輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assistedlaserdesorption/

ionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOFMS）可縮

短檢驗周期，提高鑒定準確性。分子生物學檢測靈敏度高，血培養(yǎng)的特異

性強。聯(lián)合抗原（隱球菌抗原、G試驗、GM試驗）和抗體檢測等多種真

菌實驗室檢測技術(shù)的合理應用（多次檢測、聯(lián)合檢測），結(jié)合臨床病史、

癥狀體征及影像學檢查，有助于早期診斷侵襲性真菌病。常見真菌病的微

生物學診斷方法建議見表2。

注：&Qi：1.3-3-D?RW$?:GM"：M，：?JW5史-ML：:CSFE?$;PCR：R2M%2.E:.ERiFSaS：?:

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（-）標本采集處理

各類標本的采集與處理要求如下。

1.血液：

推薦在抗真菌藥物使用前，發(fā)熱初期或寒戰(zhàn)期取靜脈血。采集后立即注入

血培養(yǎng)瓶內(nèi)并輕輕搖勻。至少采集2套。采血量與培養(yǎng)基比例為1/10~1/5

（必須包括需氧瓶或真菌專用瓶）o2h內(nèi)常溫送檢。若不能及時送檢，

則常溫保存。嚴格執(zhí)行皮膚消毒程序可有效降低血培養(yǎng)的污染率。雙相血

培養(yǎng)瓶（含肉湯加瓊0旨斜面）較單純?nèi)鉁囵B(yǎng)基更早發(fā)現(xiàn)陽性［16/7］。

2?骨髓液：

使用肝素化的注射器或溶解離心管采集骨髓液0.5ml（兒童）至3ml（成

人）后送檢。15min內(nèi)常溫送檢。若不能及時送檢，則常溫保存，已出

現(xiàn)凝聚的標本不能送檢。骨髓液真菌培養(yǎng)可采用裂解離心培養(yǎng)系統(tǒng)（如

Isolator）或商業(yè)化的真菌自動化培養(yǎng)系統(tǒng)（如專用的真菌血培養(yǎng)瓶），

少量骨髓可直接接種到培養(yǎng)基中。標本采集和接種操作需嚴格遵守實驗室

規(guī)范或商品說明書。實驗室人員還需關(guān)注骨髓中大量白細胞產(chǎn)生CO2可

能導致的培養(yǎng)瓶假陽性。骨髓涂片非常重要，需做吉姆薩或瑞氏染色鏡檢。

播散性的念珠菌、隱球菌及曲霉感染都可能累及骨髓［3］。

3,無菌體液（腦脊液、心包液、腹腔積液和關(guān)節(jié)液）：

除腦脊液外，其余的無菌體液宜置于含肝素的無菌真空采血管，15min

內(nèi)送檢，若不能及時送檢，則常溫保存（不能冷藏）。部分新型隱球菌在

37℃不生長，建議接種二管分別置25℃及37℃口6］。腦脊液可直接接

種于血培養(yǎng)瓶，提高陽性率。也可同時作隱球菌莢膜抗原檢測。

4.膿液、引流液、創(chuàng)面分泌物及竇道：

開放性創(chuàng)口，用無菌生理鹽水沖洗創(chuàng)面后，采集病灶活動性邊緣壞死組織

標本及分泌物。封閉性膿腫，局部皮膚消毒后用注射器抽取膿血性液體送

檢。2h內(nèi)常溫送檢。如有顆粒應以無菌生理鹽水漂洗后采集顆粒并記錄

顆粒的顏色，壓碎后鏡檢及培養(yǎng)。標本通?？勺鱇OH濕片、革蘭或熒光

染色，發(fā)現(xiàn)真菌菌絲或抱子具有診斷意義［16,17］。較濃稠的標本需使用消

化液處理。

5.下呼吸道標本（深部痰液，支氣管肺泡灌洗液）：

清潔口腔后采集晨痰，采用支氣管毛刷取樣和采集支氣管肺泡灌洗液。推

薦采集至少3份痰液標本，可以提高陽性檢出率，支氣管肺泡灌洗液對于

非艾滋病患者檢測耶氏肺泡子菌是最佳標本，對于艾滋病患者誘導痰或常

規(guī)痰標本具有與支氣管肺泡灌洗液相同的敏感性。唾液或24h痰液都不

推薦作真菌培養(yǎng)。支氣管沖洗液因含較多的定植真菌也不宜作真菌培養(yǎng)。

標本2h內(nèi)室溫送檢，若不能及時送檢，則4P保存。呼吸道標本液化后

離心取沉渣檢測可也是高陽性率。臨床懷疑組織胞漿菌和皮炎芽生菌感染

時，標本建議盡快送檢。

6?口腔及口咽部標本：

采用無菌生理鹽水濕潤的拭子輕輕刮取黏膜損害表面，作KOH或熒光染

色涂片，同時種于含氯霉素的沙氏瓊脂或念珠菌顯色培養(yǎng)基?？谘什扛腥?/p>

最常見的真菌為念珠菌。不推薦采用鼻腔拭子，可以采用鼻腔組織及鼻竇

沖洗液標本。

7.眼（角膜刮片、玻璃體液等）：

一般由臨床醫(yī)生操作。15min內(nèi)常溫送檢。若不能及時送檢，則常溫保

存。角膜刮片直接接種至不含抑制劑的培養(yǎng)皿中采用X或C型涂菌方式；

玻璃體液離心后取沉淀物接種。眼內(nèi)標本一般量較少，操作時須嚴格無菌,

防止污染。

8.組織標本：

采集標本后用無菌容器轉(zhuǎn)運,如標本量較少，應滴加幾滴無菌生理鹽水保

濕。及時送檢，若不能及時送檢則室溫保存。培養(yǎng)標本使用無菌眼科剪將

標本剪成米粒大小后接種，對標本作研磨后接種可以增加標本與培養(yǎng)基的

接觸面積，同時也能使組織胞漿菌等一些胞內(nèi)菌釋放出來提高培養(yǎng)的陽性

率；懷疑接合菌感染的組織則直接剪碎后接種，研磨可能會破壞菌絲降低

其生長活力。組織標本可作KOH或熒光染色涂片，能及時發(fā)現(xiàn)真菌成分，

幫助臨床診斷，尤其對一些不能人工培養(yǎng)的真菌如鼻泡子菌，瘢痕疙瘩樣

芽生菌等，同時可接種于沙氏瓊脂。

9.尿液：

采集早晨第1次清潔尿液、恥骨上聯(lián)合穿刺尿液或?qū)Ч苣蛞?0?50ml。

不能采用24h尿液c2h內(nèi)常溫送檢，若不能及時送檢，則4。（:保存，

但不能超過72ho尿液真菌培養(yǎng)不推薦定量檢測菌落計數(shù)，因其與疾病的

嚴重程度相關(guān)性存在爭議。

10.生殖道標本：

男性患者可用無菌特制的尿道拭子伸入尿道口內(nèi)2cm,用足夠壓力旋轉(zhuǎn)

5~10s;女性患者采集陰道、宮頸分泌物，在陰道擴張器幫助下用無菌拭

子插入宮頸口1.5cm處采集，拭子取出時不要碰到陰道壁，放入無菌管

中立即送檢。標本量一般較少，要防止干燥，影響致病菌的存活率。取陰

道分泌物前避免性生活及陰道沖洗與用藥。

11.糞便：

置無菌容器內(nèi)立即送檢。挑取含膿血、黏液部分的標本，如遇液狀宜取絮

狀物。應在2h內(nèi)送檢，標本置放時間過久可因糞便中細菌繁殖抑制了致

病真菌的生長。T殳不推薦糞便作真菌檢查，因考慮腸道內(nèi)可以有念珠菌

正常菌群，除非標本鏡檢發(fā)現(xiàn)大量的菌絲及菌落生長。

12.皮屑、甲屑及毛發(fā)標本：

不能置冰箱保存，因皮膚癬菌對低溫敏感。

皮屑：用經(jīng)消毒的刮刀刮取皮損活動邊緣皮屑及深層趾（指）間皮屑，水

皰取皰壁，取材前用75%酒精消毒，作KOH或熒光染色涂片，同時種于

含氯霉素的沙氏瓊月窗面，置25~28P培養(yǎng)2周。懷疑馬拉色菌的標本

接種于含橄欖油或其他脂質(zhì)的培養(yǎng)基,置35-37工培養(yǎng)2周［16］。

甲屑：用刮刀、細挫采集病甲甲下碎屑，標本用75%酒精浸泡待干燥后分

別種于含氯霉素及含放線菌酮的沙氏瓊脂斜面置25?28℃培養(yǎng)3?4周,

并同時作KOH或熒光染色涂片。甲板內(nèi)真菌活力較弱，培養(yǎng)陽性率不高，

增加標本接種量及平皿多點接種可以提高培養(yǎng)的陽性率。放線菌酮可抑制

污染真菌生長。

毛發(fā)：取病發(fā)（變色、無光澤、彎曲、脆易折斷、松動易拔除）10?12根

經(jīng)75%酒精消毒自然干燥，3~5根作直接鏡檢，5?7根種于含氯霉素的

沙氏瓊脂斜面。頭癬的病發(fā)鏡檢可見發(fā)內(nèi)菌絲、發(fā)內(nèi)抱子、或發(fā)外泡子［引。

13.免疫學試驗標本：

包括真菌（1-3）-p-D葡聚糖檢測（G試驗）、隱球菌莢膜多糖抗原檢測

和曲霉半乳甘露聚糖檢測（galactomannan,GM）。

G試驗：使用專用的無熱原真空采血管，空腹采血，分離血清。黃疸、溶

血、脂血標本會影響實驗結(jié)果，不推薦檢測。若不能及時檢測，分離血清

置于2~8℃下保存24h;或在無熱原專用離心管內(nèi)?20℃下可保存1

周［12］。

隱球菌莢膜多糖抗原檢測：采集血清及腦脊液。膠體金免疫層析法還可采

用血漿。

GM:血清及支氣管肺泡灌洗液。黃疸、溶血、脂血等標本會影響實驗結(jié)

果。如標本不能及時檢測,可置2~8°C,48h內(nèi)檢測。如48h內(nèi)不能

檢測，需-20°C以下保存。支氣管肺泡灌洗液需離心取上清液檢測［12］。

(二)標本形態(tài)學檢查

標本的形態(tài)學檢測能客觀評估標本質(zhì)量，修正培養(yǎng)結(jié)果；對于合格標本應

根據(jù)標本特點選擇高特異度和高敏感度的方法以覆蓋幾乎所有真菌，包括

部分尚無法人工培養(yǎng)或培養(yǎng)生長非常緩慢的真菌。標本的形態(tài)學檢查應作

為真菌性疾病診斷強烈推薦的檢測項目。

1.真菌免疫熒光法：

建議臨床標本直接用鈣熒光白(calcofluorwhite,CFW)或博蘭卡風

(Blankophor)熒光染色檢測。該方法幾乎可以檢測所有真菌，并且具

有高度敏感度和特異度。但熒光染色除了真菌外，動脈壁、肺泡和細支氣

管上的彈性纖維、外源性的植物纖維、脂肪滴、寄生蟲也可以發(fā)出亮藍色

的熒光，但結(jié)合形態(tài)容易區(qū)分。造成假陰性的因素有未使用適合波長段的

濾光片、標本涂片太厚、染液量過少、染色時間過短、熒光淬滅物質(zhì)存在

等。直接免疫熒光法可以用于檢測耶氏肺泡子菌（Pneumocystis

jeroveci），但部分熒光商品試劑無法使肺泡子菌著色應引起注意。暗色

真菌新鮮培養(yǎng)物的菌絲和抱子可以呈現(xiàn)強烈熒光，陳舊培養(yǎng)物的菌絲和抱

子熒光不著色或熒光信號很弱，易漏檢［18,19,20］。

2.10%KOH法：

KOH常用于處理感染的皮膚、指（趾）甲、毛發(fā)和組織標本，其能使角

質(zhì)層細胞溶解但不會破壞真菌抱子和菌絲而易于觀察。對于角質(zhì)層較厚的

皮屑、甲屑和組織塊，可以將KOH濃度適當提高（20%）,酒精燈上微

加熱以加快角質(zhì)層溶解。KOH處理后的真菌菌絲有明顯折光性，其立體

感強、粗細均勻、形態(tài)一致、彎曲自然，而上皮細胞邊緣、纖維等異物無

此特點。對于組織標本，KOH配合熒光染色能明顯提高真菌檢測的敏感

性［21］。

3.革蘭染色:

酵母菌革蘭染色呈現(xiàn)藍黑色圓形抱子，毛霉目、曲霉屬、鐮刀菌屬等絲狀

真菌多呈革蘭陰性菌絲，易漏檢，對于高度懷疑真菌感染標本，應使用更

特異的真菌染色方法進一步明確。

4.特殊真菌檢查：

懷疑隱球菌感染可以使用墨汁、黏蛋白卡紅染色法；懷疑肺泡子菌感染使

用六胺銀、甲苯胺藍、吉姆薩染色法；懷疑馬爾尼菲籃狀菌、組織胞漿菌

感染使用瑞氏、吉姆薩、熒光染色法；常規(guī)HE染色的懷疑真菌感染的組

織,進一步使用熒光、六胺銀、PAS等特異的真菌檢測方法。真菌的不同

染色涂片鏡檢方法見圖1。

注：A圖示毛霉（膿液,六胺銀染色x400）,B圖示耶氏肺泡子菌（支氣

管肺泡灌洗液，六胺銀染色x1000）,C圖示曲霉（痰,鈣熒光白染色,

x1000）,D圖示曲霉（支氣管肺泡灌洗液，10%KOHx400）

圖1真菌的不同染色涂片鏡檢方法

（三）真菌培養(yǎng)

1.適用條件：

確定臨床標本中病原真菌的種類，提高對病原體檢出的陽性率，保存菌種,

確定病原真菌的藥物敏感性、篩選耐藥菌株。感染部位合格標本中培養(yǎng)出

明確的致病菌時可確立診斷。

2.所用培養(yǎng)基的種類和意義[22]:

包括基礎(chǔ)分離培養(yǎng)野口特殊培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)分離培養(yǎng)基：只提供病原性真菌生長所需要的最基本成分。

沙氏培養(yǎng)基（Sabauraudsagar,SDA）:大多數(shù)真菌生長尚可，加入放

線菌酮和氯霉素以抑制腐生型真菌（多數(shù)可能為條件致病菌）和大多數(shù)細

菌（并非所有細菌）。放線菌酮也抑制新生隱球菌、一些念珠菌、煙曲霉

等，應該引起注意。含4%糖、低pH的SDA用于皮膚癬菌的形態(tài)學研究。

腦心浸膏瓊脂：用于雙相真菌皮炎芽生菌等從菌絲相向酵母相轉(zhuǎn)變時，其

中也可以加入抗生素^血液制品。

抑制性霉菌瓊脂：氯霉素可抑制細菌的生長而不抑制真菌的生長，用于臨

床標本最初的增菌培養(yǎng)，常用于篩選防線菌酮敏感的真菌，如隱球菌、組

織胞漿菌和接合菌。

特殊培養(yǎng)基：包括咖啡酸瓊脂（caffeicacidagar,CAA）、鳥食瓊脂、

KT培養(yǎng)基和CHROMagar念珠菌顯色培養(yǎng)基。CAA:新生隱球菌在CAA

培養(yǎng)基中菌落呈黑色；此培養(yǎng)基有助于混合培養(yǎng)物中選擇性地培養(yǎng)新型隱

球菌。鳥食瓊脂：分離痰等污染嚴重的標本中新型隱球菌。KT培養(yǎng)基：

用于皮炎芽生菌轉(zhuǎn)相（為酵母相）培養(yǎng)時使用。CHROMagar念珠菌顯色

培養(yǎng)基：根據(jù)不同顏色鑒定菌種［17］。

3,培養(yǎng)溫度:

初代培養(yǎng)建議使用（28±1）P培養(yǎng)。高溫輔助培養(yǎng)有助于部分真菌的鑒

定，如煙曲霉在45°C培養(yǎng)時可用來區(qū)別其他曲霉。雙相真菌在37或

組織中可以以酵母或小球體形式生長，常用于區(qū)別其他真菌。

4,培養(yǎng)時間:

生殖道或黏膜的念珠菌培養(yǎng)7d即可。深部標本的真菌培養(yǎng)建議4周。懷

疑罕見真菌或慢生長真菌（如莢膜組織胞漿菌、皮炎芽生菌等）感染時,

建議培養(yǎng)6~8周［2引。

（四）真菌鑒定

1.酵母菌的鑒定：

懷疑酵母菌時首先做濕片鏡檢，對于黏液型菌落、鏡下呈圓形或略橢圓形、

無假菌絲的出芽酵母菌應立即判斷是否為新型隱球菌/格特隱球菌，可進一

步用墨汁染色檢測是否存在莢膜，但莢膜的大小受培養(yǎng)時間、培養(yǎng)基成分

影響，紅酵母菌和少見的念珠菌也會產(chǎn)生莢膜樣結(jié)構(gòu)。依據(jù)是否形成假菌

絲、真菌絲、有/無頂生厚膜泡子及芽生抱子的形狀和排列方式，并結(jié)合其

他形態(tài)和生化試驗,可將酵母菌鑒定至屬或種的水平。臨床常見酵母菌鑒

定流程見圖2。

__________

圖2臨床常見酵母菌鑒定流程

芽管形成試驗：芽管試驗是快速推測性鑒定白念珠菌最為簡單有效的方法,

但不是所有的白念珠菌都是陽性。熱帶念珠菌也可能出現(xiàn)芽管試驗假陽性,

但其抱子與假菌絲連接處有明顯的縊痕。

顯色培養(yǎng)基：培養(yǎng)基放置35?37°C、空氣中培養(yǎng)36-48h,平板盡量在

暗處儲存和孵育。顯色培養(yǎng)基只能提供推斷性鑒定，2%~10%白念珠菌在

顯色培養(yǎng)基上形成白色菌落。

糖同化試驗：是酵母菌鑒定至種水平的主要方法，但不能區(qū)分復合群。

酚氧化酶試驗：臨床分離的酵母菌中只有新型隱球菌和格特隱球菌可產(chǎn)生

酚氧化酶，能使咖啡酸分解為黑色素，表現(xiàn)為深棕色至黑色。

版酶：用于協(xié)助鑒定版酶陽性的擔子菌酵母（隱球菌、馬拉色菌、紅酵母

屬、毛抱子菌屬）和眼酶陰性的子囊菌類酵母（念珠菌屬、酵母菌屬、地

絲菌屬、芽生裂殖菌屬）。

分子生物學技術(shù)：DNA直接測序和MALDI-TOF質(zhì)譜技術(shù)對酥母樣真菌

鑒定準確率高，對生化表型不能區(qū)分的復合群或菌種能準確鑒定。

2.絲狀真菌的鑒定：

絲狀真菌主要通過菌落形態(tài)以及顯微鏡下真菌泡子、菌絲、產(chǎn)泡等特征性

結(jié)構(gòu)進行初步判斷種屬，菌落主要觀察其生長速度、質(zhì)地、高度、邊緣形

態(tài)、正反面顏色等，菌絲應注意是否分隔、顏色、形態(tài)（球拍、關(guān)節(jié)等）、

附著結(jié)構(gòu)（假根、附著抱等），產(chǎn)胞結(jié)構(gòu)包括抱子的形態(tài)、大小、顏色、

聚集模式、產(chǎn)泡方式、厚壁抱子等。顯微鏡檢查最好使用透明膠帶法或小

培養(yǎng)法。準確的菌種鑒定常需要分子生物學技術(shù)。MALDI-TOFMS技術(shù)

鑒定準確性取決于其數(shù)據(jù)庫及培養(yǎng)和蛋白提取方法等因素。臨床常見絲狀

真菌鑒定流程見圖3。

依狀存僵］

分隔或很少分隔］

曲解.產(chǎn)胞靖構(gòu).假設(shè)等［透明曲比I

I~~~~H_I

E客目：累客蟲毒目:維糞隼目：雙極苗屬.核胞毒1

耳”

M.毛寄H.根1蛀舞奇屬S.稔氏有用格

匕耳屬,橫快與他百海,外電再

腐.共頭宜猛.屬.電115H.穹拖

小克做雙騫屬毒礴1

圖3臨床常見絲狀真菌的鑒定流程

（五）真菌藥敏試驗

實驗室應根據(jù)標本和菌株的臨床意義決定是否進行真菌藥敏試驗，并選擇

正確的藥敏試驗方法。對于酵母菌，建議僅對分離自組織、血液、無菌體

液等標本的菌株或分離自同一患者多個部位的同一菌種（即多部位感染）

進行藥敏試驗，對于分離自呼吸道標本的酹母菌不推薦常規(guī)進行藥敏試驗。

對于絲狀真菌，應結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、影像學及其他感染相關(guān)檢查結(jié)果

進行分析，僅對具有臨床意義的菌株進行藥敏試驗，如不能除外環(huán)境污染

的可能，應建議臨床多次留樣復檢并完善其他相關(guān)檢查。需要注意的是，

真菌體外藥敏試驗結(jié)果不一定與體內(nèi)治療效果完全一致低的MIC值不一

定預示臨床治療成功，高的MIC值也不一定臨床治療失敗。目前的臨床藥

敏折點有一定的局限性，如棘白菌素和伏立康嚶對于念珠菌的臨床折點主

要基于非粒細胞缺乏患者的念珠菌血癥感染模型，對于其他感染類型的數(shù)

據(jù)則是有限的，其他藥物也存在類似問題［23］。

1.藥敏試驗方法：

真菌藥敏試驗的參考方法是微量肉湯稀釋法，美國CLSI與歐洲藥物敏感

性試9僉委員會(EuropeanCommitteeonAntimicrobialSusceptibility

Testing,EUCAST)均有相應的檢測方法及判讀標準。但由于其操作的復

雜性，臨床常規(guī)檢測更適合選擇操作簡便的商品化試劑，包括改良微量肉

湯稀釋法、色原底物法、瓊脂梯度擴散法和紙片擴散法等，不同方法所適

用的菌種范圍不同。對于雙相真菌，除CLSI指出微量肉湯稀釋法可用于

申克泡子絲菌菌絲柜藥敏檢測外，目前尚未建立適用于馬爾尼菲籃狀菌、

莢膜組織胞漿菌、粗球泡子菌、皮炎芽生菌等雙相真菌的參考藥敏試驗方

法，可參考相關(guān)抗真菌治療指南選擇藥物。

2.藥敏結(jié)果判讀：

實驗空應嚴格按照所選擇的方法學，進行藥敏試驗操作和判讀，不同藥敏

試驗方法對不同真菌種屬所要求的接種物濃度、培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)溫度、

培養(yǎng)時間和判讀標準均不同。在真菌藥敏結(jié)果判讀終點上，兩性霉素B在

不同藥敏方法中均以100%抑制菌株生長的最低藥物濃度為MIC,其他藥

物則多以與生長對照相比部分抑制菌株生長的最低濃度為MIC,且不同藥

敏方法對不同藥物MIC讀取時的生長抑制程度要求各不相同。曲霉菌對棘

白菌素類應報告其最低有效濃度(minimaleffectiveconcentration,

MEC)e

3,藥敏解釋標準：

真菌藥敏結(jié)果的解釋，應選擇與所使用檢測方法學相對應的體系標準。對

于尚未建立臨床折點的藥物，部分真菌可提供其流行病學界值

或藥代動力學/藥效

(epidemiologicalcutoffvalueszECVs/ECOFFs)

學(pharmacokinetic/pharmacodynamic,PK/PD)折點供臨床參考。

對于酵母菌，CLSI與EUCAST均提供了念珠菌屬臨床常見菌種的臨床折

點，CLSI還提供了新型隱球菌和格特隱球菌的流行病學界值。對于絲狀真

菌，CLSI未建立臨床折點，但提供了曲霉屬部分常見菌種ECVs,EUCAST

對曲霉屬部分菌種提供了臨床折點。棘白菌素類藥物中卡泊芬凈藥敏試驗

結(jié)果在不同實驗室間差異較大,EUCAST未給出折點,建議參考米卡芬凈

和阿尼芬凈結(jié)果對其進行評價；CLSI雖提供了折點但仍指出，當出現(xiàn)卡泊

芬凈中介或耐藥時應進行確認，當米卡芬凈或阿尼芬凈耐藥或菌株存在

FKS基因熱點區(qū)突變時，可報告耐藥。藥敏結(jié)果報告中應注意所使用判讀

標準適用的感染或標本類型。此外，建議在報告中進行說明天然耐藥的情

況。另外在特定感染部位濃度過低、不適用于此類感染治療的藥物不建議

報告其藥敏結(jié)果，可以在藥敏報告中進行說明，如對于尿標本分離株不建

議報告棘白菌素類、伏立康嚶、泊沙康嚶和兩性霉素B,對于中樞神經(jīng)系

統(tǒng)感染分離株不建議報告棘白菌素類的藥物敏感性等

[24,25,26,27,28,29,30,31,32,33]。

（六）侵襲性真菌病的免疫學診斷

免疫學診斷是指應用免疫方法檢測血清或其他體液中的真菌抗原、抗體和

代謝產(chǎn)物進行侵襲性真菌感染的實驗室診斷。

1.抗原檢測：

包括1,3-p-D葡聚糖檢測、半乳甘露聚糖檢測和隱球菌莢膜多糖抗原檢

測等。

1,3-p-D葡聚糖檢測：1,3-p-D葡聚糖（1,3-beta-D-glucan）是酵

母菌和絲狀真菌細胞壁的多聚糖成分。除血清外，還可采集肺泡灌洗液等

標本送檢。用于侵襲性真菌（隱球菌、接合菌、皮炎芽生菌酵母相除外）

感染的輔助診斷。陽性結(jié)果提示真菌感染，但不能作為確診指標。導致假

陽性結(jié)果的因素有：使用以真菌為原料的抗生素；放化療引起黏膜炎癥；

靜脈輸注血液制品（白蛋白、球蛋白、凝血因子等）；血液透析用纖維素

膜；使用纖維棉紗等含葡聚糖的材料；某些多糖類抗腫瘤藥物（如香菇多

糖）等。

半乳甘露聚糖檢測：半乳甘露聚糖（galactomannan,GM）是曲霉菌細

胞壁的一種多聚糖，檢測血清、支氣管肺泡灌洗液GM含量有助于診斷侵

襲性曲霉菌病(invasiveaspergillosis,IA)和評估治療效果。陽性結(jié)果

提示真菌感染，但不能作為確診指標。陰性結(jié)果不能排除IA,若臨床懷疑

IA建議重復送檢。IA高危患者應建立血清GM基線水平并每周送檢兩次，

以便在危及生命的穌發(fā)生之前搶先抗真菌治療。GM水平還有助于評估

治療效果。該試驗假陽性率8%~14%,至少連續(xù)兩次送檢標本為陽性,

才可考慮患者GM試驗為陽性。使用阿莫西林/克拉維酸、哌拉西林/他嚶

巴坦亦出現(xiàn)假陽性。交叉反應見于青霉菌、皮炎芽生菌、鏈格泡、隱球菌

等。在非中性粒細胞減少癥和實體器官移植患者中GM試驗敏感性較低,

不推薦監(jiān)測血清GM。

隱球菌莢膜多糖抗原檢測：隱球菌的莢膜多糖抗原常用檢測方法有酶聯(lián)免

疫測定(enzymeimmunoassay,EIA)、乳膠凝集實驗(latex

agglutinationtest,LA)和側(cè)向?qū)游鰧嶒?lateralflowtest,LFD)。

隱球菌抗原檢測是肺隱球菌病和隱球菌性腦膜炎等隱球菌感染的臨床快

速診斷方法。常用標本為血清和腦脊液，亦可使用支氣管肺泡灌洗液。EIA

的敏感度和特異度與LA相當，但類風濕因子(rheumatoidfactor,RF)

可引起LA假陽性,而EIA不受影響。LFD方法簡便，血清檢測敏感性和

特異性高于EIA和LA。感染毛胞子菌、噬二氧化碳細胞菌屬，口腔球菌

屬、白吉利地霉等可能出現(xiàn)假陽性。常見假陰性原因為抗原濃度過低或過

高引起帶效應。

2.抗體檢測：

檢測抗曲霉菌IgG和IgE抗體有助于診斷過敏性支氣管-肺曲霉菌病

(allergicbronchopulmonaryaspergillosis,ABPA)和慢性空洞性曲

霉菌病。單獨用抗體進行念珠菌屬診斷的敏感度和特異度均較低，建議念

珠菌甘露聚糖抗原及其對應抗體聯(lián)合檢測。其他可檢測球抱子菌抗體、組

織胞漿菌抗體等有助于疾病診斷或可用于判斷預后。常見侵襲性真菌感染

的免疫學檢測技術(shù)評價見表3。

S3案;MSWBI函M3免疫學檢測技術(shù)泮價

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(七)侵襲性真菌病的分子診斷

分子診斷方法大多在培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進行病原真菌分子鑒定，也有報道實時

PCR技術(shù)、液相芯片、焦磷酸測序、質(zhì)譜、宏基因組測序等分子技術(shù)可直

接從液體培養(yǎng)瓶甚至臨床標本中進行病原檢測［40］。目前由于體液中真菌

載量低、DNA抽提困難、易污染、無臨床判定標準等問題，分子診斷尚

未寫入侵襲性真菌病的診斷標準中。

1.PCR技術(shù)：

PCR方法是目前分子診斷中最為常用的方法[41],針對真菌靶基因設(shè)計特

異性引物，提取標本的DNA，經(jīng)過PCR檢測真菌相關(guān)基因。真菌靶基因

選擇主要為核糖體RNA基因，包括：18S、ITS1,5.8S、ITS2、28S區(qū)

域等，已應用于直接從臨床標本中檢測、鑒定真菌。使用PCR技術(shù)對侵襲

性真菌病進行分子診斷的研究主要集中于曲霉菌和念珠菌感染，也見于一

些少見真菌如接合菌感染中。在確診或疑似侵襲性念珠菌病患者中，PCR

方法的陽性率為85%(78%~91%),而血培養(yǎng)的陽性率為38%

(29%~46%)[42]0

2.質(zhì)譜檢測技術(shù)：

MALDI-TOFMS在侵襲性真菌感染分子診斷方面的應用研究多見于對固

體培養(yǎng)基上分離得到的臨床菌株進行鑒定,對酵母菌的鑒定準確率在

84%?99%之間不等[43],且與判定值的設(shè)置有關(guān)。MALDI-TOFMS鑒定

方法目前仍以固體/液體培養(yǎng)形成一定數(shù)量的真菌菌落為前提，尚無直接從

臨床標本中直接檢測真菌的報道，且對復合感染中同時存在的多種病原體

無法鑒定。

3.其他分子診斷技術(shù)：

PCR-電噴射電離質(zhì)譜技術(shù)是將廣譜PCR與電噴射電離質(zhì)譜技術(shù)整合于一

個系統(tǒng)。

焦磷酸測序在侵襲性真菌病分子診斷中的應用多見于對酵母菌，尤其是念

珠菌的分離菌株進行鑒定。

另外，核酸雜交、液相芯片、DNA微點陣基因芯片、宏基因組［44］等技術(shù)

在侵襲性真菌病的分子診斷方面的應用也逐漸增多，均可檢測多種病原體,

對真菌感染的分子診斷有重要意義。

六、對于真菌檢測質(zhì)量保證的要求^

（-）方法學性能驗證

任何新的真菌檢測技術(shù)臨床使用前，應查閱已發(fā)表的完整、科學的系統(tǒng)評

估文獻或廠家說明書，確定檢驗程序的性能特征。然后實驗室進行獨立的

性能驗證，通過獲取客觀證據(jù)（以性能特征形式）證實檢驗程序的性能與

其聲明相符并與預期用途相關(guān)。

應按優(yōu)先順序依次遢圣標準菌株、質(zhì)控菌株或其他已知菌株對商業(yè)鑒定系

統(tǒng)（包括自動、半自動、手工）每種板（條/卡/管）的直接鏡檢、鑒定/

藥敏結(jié)果符合性進行驗證。應根據(jù)分析類型和用途進行驗證程序的設(shè)計、

驗證結(jié)果的統(tǒng)計學分析、建立新檢驗程序的可接受性能標準。3僉證結(jié)果應

證明該檢驗程序可用于檢測或準確分析待測物。若不符合需重復驗證，再

次驗證仍不能通過時應對檢測系統(tǒng)進行修正。

（二）室內(nèi)質(zhì)控

應貯存與診斷相配套的質(zhì)控物，以便在染色、試劑、試驗、鑒定系統(tǒng)和抗

菌藥物敏感性試驗中使用。藥敏用標準菌株種類和數(shù)量應滿足工作要求,

保存其來源、傳代等記錄，并有證據(jù)表明標準菌株性能滿足要求。

1.涂片：

直接染色（如墨汁染色）檢查患者樣品時，應在實驗當日做陰性和陽性質(zhì)

控（某些染色如KOH染色，玻片本身作為陰性質(zhì)控）。熒光染色應每次

實驗以陰性和陽性質(zhì)控驗證。標本直接鏡檢真菌染色基本質(zhì)控要求見表4。

表4標本直接嫡檢真國染色基本質(zhì)控要求

染色方法厭控與例H結(jié)果

KOH含念瓊霞的反聯(lián)或搭甲反本如第5￡片中可為苴36或分

堇三姿色含黃色餐整律靠莖三陽性（素色）

大腦?；ㄉ趺捞m阻性（打色）

矍十條色符生除洋蒿葡也無寫英旗醇55a雋

三臺珠塞元英裊的期考超男

三含淳蓄可見缶百色真苫結(jié)構(gòu)

大85堆坦茗無關(guān)光券色結(jié)杓

2.培養(yǎng)：

真菌培養(yǎng)使用的所有培養(yǎng)基、試劑和耗材均需有質(zhì)量合格證。每批次、貨

次的培養(yǎng)基、試劑都需驗收其性能。通常使用質(zhì)控菌株的生長、抑制試驗，

按照常規(guī)操作程序孵育后觀察足夠生長、典型形態(tài)，對于選擇性培養(yǎng)基則

觀察是否抑制目標菌生長。

3.藥敏試驗：

質(zhì)控菌株重懸在含50%甘油肉湯中凍存于?70使用時,質(zhì)控菌株接

種于沙保弱平板上，存放于2?8℃z每周傳代，連續(xù)傳代不超過3次。

至少每月將凍存的雌菌株復蘇1次備用。藥敏試驗前凍存的質(zhì)控菌株應

傳代至少兩次。質(zhì)控頻率：連續(xù)30d檢測所有質(zhì)控菌株藥敏并記錄結(jié)果,

當每種藥物對每個菌株的藥敏結(jié)果不超過3次失控時，可以由日質(zhì)控轉(zhuǎn)為

周質(zhì)控。周質(zhì)控時當單個MIC失控時，要重新進行日質(zhì)控并解決失控的問

題，確保所有的MIC值均在控。在重新周質(zhì)控之前，需要連續(xù)進行30d

日質(zhì)控。質(zhì)控菌株檢測結(jié)果應符合CLSIM60、M61文件要求。

4.免疫學試驗：

商品化檢測系統(tǒng)應嚴格使用配套試劑和適用的質(zhì)控物，檢測結(jié)果應符合廠

家性能特征要求。

5.分子生物學檢測：

真菌分子生物學檢測過程中所使用的所有試劑、耗材均需有質(zhì)量合格證。

每批次、貨次的試劑、耗材都需驗收其性能，并做記錄。質(zhì)量控制程序中

應有針對核酸檢測防污染的具體措施。每次實驗應設(shè)置陰性、弱陽性和/

或陽性質(zhì)控物，檢測結(jié)果陰陽性符合預期。每次檢測應覆蓋核酸提取、擴

增和結(jié)果判讀全過程的質(zhì)量控制。

（三）實驗室比對

1.室間比對：

按要求參加相應的能力驗證/室間質(zhì)評。應對“不滿意“和“不合格”的能力驗

證/空間質(zhì)評結(jié)果進行分析并采取糾正和預防措施。對沒有開展能力驗證/

室間質(zhì)評的項目，應至少每6個月與其他實驗室（或其他試驗方法）進行

1次性能比對評估試臉。

2.室內(nèi)比對：

包括人員比對和設(shè)備或方法比對。

人員比對：應制定人員比對的程序，規(guī)定由多個人員進行的手工檢驗項目

比對的方法和判斷標準，至少包括顯微鏡檢查、培養(yǎng)結(jié)果判讀、抑菌圈測

量、結(jié)果報告，定期（至少每6個月1次，每次至少5份臨床樣品）進行

檢驗人員的結(jié)果比對、考核并記錄。

設(shè)備或方法比對：實驗室在開展多種染色方法（如革蘭染色、抗酸染色、

墨汁染色等）時，或同時開展手工染片法和自動化染片法時，應進行不同

方法/設(shè)備的實驗室內(nèi)部比對。至少每6個月1次，每次至少5份臨床樣

品，并包含陽性、陰性結(jié)果。

七.真菌實驗室檢測報告要求▼

（-）報告內(nèi)容

1.基本信息：

患者信息、標本信息、臨床信息。

2.檢測信息：

標本唯一編號、接收時間、審核時間、檢測者簽字、審核者簽字或者診斷

者簽字、實驗室名稱、地址、聯(lián)系電話。

3.檢測報告：

標本質(zhì)量描述、檢測項目、檢測方法、檢測結(jié)果、參考區(qū)間、結(jié)果解釋、

(二)報告格式

1.鏡下形態(tài)學檢查[45]:

(1)標本質(zhì)量描述、檢測項目、染色方法、檢測結(jié)果、結(jié)果解釋。(2)

觀察泡子和菌絲的形態(tài)、位置、大小和排列、產(chǎn)泡結(jié)構(gòu)等特征，以提示真

菌種屬，菌絲要區(qū)別真假菌絲及相應的形態(tài)描述。(3)無菌部位標本涂

片檢查，報告查見(未查見)真菌泡子及菌絲。(4)非無菌部位標本涂

片檢查，報告時對真菌胞子數(shù)量描述可參考細菌的報告模式。(5)酵母

樣泡子：建議報告”查見真菌泡子,疑似酵母菌”。(6)酵母樣抱子和假

菌絲：建議報告”查見酵母樣真菌抱子及假菌絲”。(7)墨汁染色見有寬

厚莢膜的酵母樣抱子：建議報告"查見真菌泡子，有寬厚莢膜，疑似隱球菌

\(8)透明、有