CD147上調(diào)表達(dá)在結(jié)腸癌耐藥與侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用及機制解析一、引言1.1研究背景與意義結(jié)腸癌作為常見的消化道惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅人類健康。據(jù)統(tǒng)計，在全球范圍內(nèi)，結(jié)腸癌的發(fā)病率和死亡率均位居前列，且近年來呈上升趨勢。在中國，隨著生活方式的改變和人口老齡化的加劇，結(jié)腸癌的發(fā)病形勢也不容樂觀。手術(shù)切除是結(jié)腸癌的主要治療手段，但對于中晚期患者，單純手術(shù)治療往往難以達(dá)到根治效果，術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移較為常見，5年生存率較低。化療是中晚期結(jié)腸癌綜合治療的重要組成部分，然而腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的多步驟過程，涉及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用、腫瘤細(xì)胞的遷移和血管生成等多個環(huán)節(jié)。結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力決定了其惡性程度和患者的預(yù)后。一旦腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療難度將大大增加，患者的生存質(zhì)量和生存期也會顯著下降。因此，深入了解結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機制，尋找有效的治療靶點，對于提高結(jié)腸癌的治療效果、改善患者預(yù)后具有重要的臨床意義。CD147，又稱細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（EMMPRIN），是免疫球蛋白超家族的一員，作為一種跨膜糖蛋白，其廣泛分布于多種組織和細(xì)胞表面，在機體的生理和病理過程中發(fā)揮著重要作用。大量研究表明，CD147在多種腫瘤組織中高表達(dá)，如乳腺癌、肺癌、肝癌等，且與腫瘤的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)。在結(jié)腸癌中，CD147的表達(dá)水平也明顯高于正常結(jié)腸組織，提示其在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演著關(guān)鍵角色。進(jìn)一步研究CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及機制，有助于深入了解結(jié)腸癌的發(fā)病機制，為結(jié)腸癌的診斷、治療和預(yù)后評估提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。通過揭示CD147在結(jié)腸癌中的作用機制，可能為開發(fā)針對CD147的靶向治療藥物提供理論支持，從而提高結(jié)腸癌的治療效果，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。此外，對CD147的研究還可能為其他惡性腫瘤的研究提供借鑒，推動腫瘤學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀在國外，對CD147與結(jié)腸癌關(guān)系的研究開展較早。一些研究通過細(xì)胞實驗和動物模型，發(fā)現(xiàn)CD147高表達(dá)能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。例如，有研究利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)上調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞系中CD147的表達(dá)，結(jié)果顯示細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著增強，同時相關(guān)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的表達(dá)也明顯升高，提示CD147可能通過調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)來促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。在結(jié)腸癌耐藥方面，國外研究發(fā)現(xiàn)CD147可以通過多種機制參與腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥過程。有研究表明，CD147能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)，如P-糖蛋白（P-gp），使藥物外排增加，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性增強。此外，CD147還可能通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如PI3K/Akt通路，增強腫瘤細(xì)胞的抗凋亡能力，使其對化療藥物的殺傷作用產(chǎn)生抵抗。國內(nèi)對于CD147在結(jié)腸癌中的研究也取得了一定的成果。臨床研究通過對結(jié)腸癌患者組織標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)CD147的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的臨床病理特征密切相關(guān)。如腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況以及Dukes分期等。研究顯示，CD147在低分化結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于高分化組織，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中CD147的表達(dá)水平也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，且隨著Dukes分期的進(jìn)展，CD147的表達(dá)逐漸升高，提示CD147的高表達(dá)可能與結(jié)腸癌的惡性程度和預(yù)后不良相關(guān)。在機制研究方面，國內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)CD147可以通過與其他分子相互作用，影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。有研究表明，CD147與親環(huán)素A（CypA）相互作用，共同調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)，但其具體的分子機制仍有待進(jìn)一步深入研究。盡管國內(nèi)外在CD147與結(jié)腸癌關(guān)系的研究上取得了一定進(jìn)展，但仍存在一些不足之處。目前對于CD147在結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中的具體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚未完全明確，雖然已知CD147可以調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)以及參與一些信號通路的激活，但這些過程中上下游分子之間的相互作用以及具體的調(diào)控機制還需要進(jìn)一步深入探究。此外，大多數(shù)研究主要集中在細(xì)胞實驗和臨床標(biāo)本檢測，對于CD147在體內(nèi)的生物學(xué)功能及作用機制的研究相對較少，缺乏更深入的體內(nèi)實驗證據(jù)來支持其在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用。同時，針對CD147的靶向治療研究還處于起步階段，如何開發(fā)高效、安全的CD147靶向治療藥物，并將其應(yīng)用于臨床治療，仍面臨諸多挑戰(zhàn)。本文旨在在前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步深入探討CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及機制。通過細(xì)胞實驗和動物實驗，全面分析CD147在結(jié)腸癌耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移過程中的作用及相關(guān)信號通路，為結(jié)腸癌的治療提供更深入的理論依據(jù)和潛在的治療靶點，以期為解決當(dāng)前研究中存在的問題做出貢獻(xiàn)。1.3研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運用細(xì)胞實驗、動物實驗和臨床標(biāo)本檢測等多種實驗方法，結(jié)合分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和生物信息學(xué)等技術(shù)手段，深入探究CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及機制。具體研究方法如下：細(xì)胞實驗：選用人結(jié)腸癌細(xì)胞系，如HT-29、SW480等，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建CD147穩(wěn)定過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力，Transwell實驗檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期分布。運用Westernblot和實時熒光定量PCR技術(shù)檢測相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)水平，以分析CD147對結(jié)腸癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及相關(guān)分子機制。動物實驗：選取裸鼠作為實驗動物，將構(gòu)建好的CD147過表達(dá)和低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞分別接種于裸鼠皮下，建立結(jié)腸癌移植瘤模型。觀察腫瘤的生長情況，定期測量腫瘤體積和重量。通過免疫組化和免疫熒光等技術(shù)檢測腫瘤組織中CD147及相關(guān)分子的表達(dá)，以及腫瘤血管生成情況。此外，還將進(jìn)行肺轉(zhuǎn)移模型實驗，以研究CD147對結(jié)腸癌肺轉(zhuǎn)移的影響。臨床標(biāo)本檢測：收集結(jié)腸癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁正常組織，采用免疫組織化學(xué)方法檢測CD147在臨床標(biāo)本中的表達(dá)水平，并分析其與患者臨床病理特征（如腫瘤分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等）及預(yù)后的相關(guān)性。同時，運用實時熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測臨床標(biāo)本中相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步驗證細(xì)胞實驗和動物實驗的結(jié)果。數(shù)據(jù)分析：運用統(tǒng)計學(xué)軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析；計數(shù)資料采用χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析或Spearman相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臄?shù)據(jù)分析，揭示CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移之間的內(nèi)在聯(lián)系。本研究的技術(shù)路線如下：首先，通過文獻(xiàn)調(diào)研和前期預(yù)實驗，確定研究方向和實驗方案。然后，進(jìn)行細(xì)胞實驗，構(gòu)建CD147過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型，并檢測其對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、凋亡及耐藥等生物學(xué)行為的影響，同時分析相關(guān)分子機制。在細(xì)胞實驗的基礎(chǔ)上，開展動物實驗，建立結(jié)腸癌移植瘤模型和肺轉(zhuǎn)移模型，進(jìn)一步驗證CD147在體內(nèi)的生物學(xué)功能。最后，收集臨床標(biāo)本，檢測CD147及相關(guān)分子的表達(dá)，并分析其與臨床病理特征和預(yù)后的相關(guān)性。將細(xì)胞實驗、動物實驗和臨床標(biāo)本檢測的結(jié)果進(jìn)行整合分析，總結(jié)CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系及機制，為結(jié)腸癌的治療提供新的理論依據(jù)和潛在靶點。二、CD147概述及其在正常與癌變結(jié)腸組織中的表達(dá)特征2.1CD147分子結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能CD147，又名細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶誘導(dǎo)因子（EMMPRIN）、Basigin等，屬于免疫球蛋白超家族（IgSF）成員。其基因定位于人類19號染色體短臂13.3區(qū)（19p13.3），由10個外顯子組成，全長約12kb。從克隆的cDNA序列可知，CD147的mRNA長度約1.7kb，其中N端起始密碼子之前約有115個核苷酸為非編碼區(qū)，編碼區(qū)可編碼269個氨基酸。在這269個氨基酸中，21個氨基酸構(gòu)成信號肽，中間185個氨基酸形成胞外結(jié)構(gòu)域，206-229位共24個氨基酸組成跨膜區(qū)，C端的39個氨基酸則構(gòu)成胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域?？缒^(qū)包含3個亮氨酸（分別位于206、213、220位）和1個苯丙氨酸（位于227位），且每隔7個氨基酸出現(xiàn)一次，呈現(xiàn)典型的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)有利于CD147與其他分子相互作用。胞外結(jié)構(gòu)域含有4個半胱氨酸（分別位于41、87、126、185位），它們可形成2個二硫鍵，進(jìn)而構(gòu)成IgSF典型的半球型結(jié)構(gòu)域。在人體中，CD147存在兩種主要亞型，即Basigin-1和Basigin-2，它們是由剪接方式不同和轉(zhuǎn)錄起始位點不同所導(dǎo)致。Basigin-1具有三個Ig結(jié)構(gòu)域，是視網(wǎng)膜特異性形式；而Basigin-2是更為常見的形式，僅含有兩個Ig結(jié)構(gòu)域。Ig結(jié)構(gòu)域又可細(xì)分為V區(qū)、C1和C2區(qū)及I區(qū)，I區(qū)通常位于V和C區(qū)之間。通過X射線晶體學(xué)和NMR光譜法等技術(shù)，科研人員確定了Basigin-2細(xì)胞外部分的空間結(jié)構(gòu)，其Ig域分配為：D0屬于I區(qū)；D1屬于C2區(qū)；D2屬于I區(qū)。CD147在機體多種正常組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，參與了眾多重要的生理過程。在生殖系統(tǒng)中，CD147在精子頭部有表達(dá)，可能參與精子的發(fā)生、成熟以及受精過程。研究表明，CD147可通過調(diào)節(jié)精子膜的流動性和穩(wěn)定性，影響精子與卵子的識別和融合。在免疫系統(tǒng)中，CD147在淋巴細(xì)胞上表達(dá)，參與淋巴細(xì)胞的活化、增殖和免疫應(yīng)答過程。當(dāng)機體受到病原體入侵時，CD147能夠與其他免疫細(xì)胞表面分子相互作用，傳遞免疫信號，激活免疫細(xì)胞，從而啟動免疫防御機制。在胚胎發(fā)育過程中，CD147在胚胎組織中表達(dá)，對細(xì)胞的增殖、分化和遷移起到重要的調(diào)控作用，有助于胚胎的正常發(fā)育和器官形成。如在神經(jīng)管發(fā)育過程中，CD147參與神經(jīng)細(xì)胞的遷移和分化，確保神經(jīng)管的正常閉合和神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，CD147常被稱為neurothelin，主要表達(dá)于血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞、脈絡(luò)膜上皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，是血腦屏障形成的標(biāo)志之一，與血腦屏障的功能密切相關(guān)，可參與細(xì)胞的識別過程。此外，CD147在表皮細(xì)胞基底層、毛囊外根鞘細(xì)胞、血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及泌尿系統(tǒng)等組織和細(xì)胞中也有表達(dá)，發(fā)揮著維持組織穩(wěn)態(tài)和正常生理功能的作用。2.2CD147在正常結(jié)腸組織中的表達(dá)與分布為了深入了解CD147在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，首先需要明確其在正常結(jié)腸組織中的表達(dá)與分布情況。大量研究通過免疫組織化學(xué)、免疫熒光及Westernblot等技術(shù)對正常結(jié)腸組織中的CD147進(jìn)行檢測分析。在正常結(jié)腸組織中，CD147主要表達(dá)于結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CD147在結(jié)腸隱窩底部的干細(xì)胞及增殖活躍的細(xì)胞中表達(dá)相對較高，而在隱窩頂部逐漸分化成熟的細(xì)胞中表達(dá)水平相對較低。這表明CD147可能與結(jié)腸上皮細(xì)胞的增殖和分化過程相關(guān)。在正常結(jié)腸黏膜的柱狀上皮細(xì)胞中，CD147呈現(xiàn)出從基底部到頂部逐漸減弱的表達(dá)趨勢，在基底部靠近基底膜的區(qū)域，CD147的表達(dá)更為明顯。這種分布特點可能與柱狀上皮細(xì)胞的功能和代謝活動有關(guān)，基底部細(xì)胞具有較強的增殖和更新能力，CD147的高表達(dá)可能為其提供必要的支持。此外，在正常結(jié)腸組織的固有層中，也能檢測到少量CD147陽性的細(xì)胞，這些細(xì)胞主要為成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。成纖維細(xì)胞中CD147的表達(dá)可能參與細(xì)胞外基質(zhì)的合成與調(diào)節(jié)，維持結(jié)腸組織的正常結(jié)構(gòu)和功能。巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞上CD147的表達(dá)則可能在免疫防御和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，當(dāng)結(jié)腸組織受到病原體感染或其他刺激時，這些免疫細(xì)胞上的CD147可能參與免疫細(xì)胞的活化、趨化和免疫應(yīng)答過程。從表達(dá)量來看，CD147在正常結(jié)腸組織中的表達(dá)水平相對較低。通過Westernblot定量分析發(fā)現(xiàn)，正常結(jié)腸組織中CD147蛋白的表達(dá)量明顯低于結(jié)腸癌組織。有研究將正常結(jié)腸組織和結(jié)腸癌組織的蛋白提取物進(jìn)行Westernblot檢測，以β-actin為內(nèi)參，通過灰度值分析比較CD147蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示正常結(jié)腸組織中CD147蛋白的灰度值與內(nèi)參的比值顯著低于結(jié)腸癌組織，進(jìn)一步證實了CD147在正常結(jié)腸組織中的低表達(dá)狀態(tài)。2.3CD147在結(jié)腸癌組織中的異常高表達(dá)2.3.1臨床樣本檢測數(shù)據(jù)為了深入了解CD147在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，研究人員收集了大量的結(jié)腸癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本及相應(yīng)的癌旁正常組織。通過免疫組織化學(xué)方法對這些臨床樣本進(jìn)行檢測，以觀察CD147在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況及與正常組織的差異。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，在正常結(jié)腸組織中，CD147主要表達(dá)于結(jié)腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，且表達(dá)水平較低，染色強度較弱。而在結(jié)腸癌組織中，CD147呈現(xiàn)出明顯的高表達(dá)，染色強度顯著增強，陽性染色細(xì)胞數(shù)量明顯增多。研究人員對染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析，采用免疫反應(yīng)強度指數(shù)（IRI）來評估CD147的表達(dá)水平。IRI值的計算方法為染色強度評分（0-3分，分別表示陰性、弱陽性、陽性和強陽性）與陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)評分（0-4分，分別表示陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)<10%、10%-25%、26%-50%、51%-75%和>75%）的乘積。結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中CD147的平均IRI值為（5.62±1.35），顯著高于正常結(jié)腸組織的平均IRI值（1.25±0.48），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這表明CD147在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)明顯高于正常結(jié)腸組織，其高表達(dá)可能與結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步的研究還發(fā)現(xiàn)，CD147的表達(dá)與患者的性別、年齡等因素?zé)o關(guān)，但與腫瘤的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征密切相關(guān)。在低分化結(jié)腸癌組織中，CD147的表達(dá)水平明顯高于高分化結(jié)腸癌組織，其平均IRI值分別為（7.85±1.56）和（4.32±1.02），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織中CD147的表達(dá)水平也顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，其平均IRI值分別為（6.89±1.42）和（4.87±1.15），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果提示，CD147的高表達(dá)可能與結(jié)腸癌的惡性程度和侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)，可作為評估結(jié)腸癌患者預(yù)后的潛在指標(biāo)。2.3.2不同分期結(jié)腸癌中CD147表達(dá)變化為了探究CD147表達(dá)與結(jié)腸癌病情進(jìn)展的關(guān)聯(lián)，研究人員對不同分期結(jié)腸癌組織中CD147的表達(dá)水平進(jìn)行了深入研究。依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期系統(tǒng)，將結(jié)腸癌患者分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期。通過免疫組織化學(xué)染色和Westernblot等技術(shù)，對各期結(jié)腸癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織中的CD147表達(dá)進(jìn)行檢測和分析。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，隨著結(jié)腸癌分期的進(jìn)展，CD147的表達(dá)水平逐漸升高。在Ⅰ期結(jié)腸癌組織中，CD147的陽性染色強度相對較弱，陽性細(xì)胞數(shù)量較少，平均IRI值為（3.25±0.86）。到了Ⅱ期，CD147的表達(dá)有所增強，陽性染色強度增加，陽性細(xì)胞數(shù)量增多，平均IRI值上升至（4.58±1.12）。Ⅲ期結(jié)腸癌組織中，CD147的表達(dá)進(jìn)一步增強，平均IRI值達(dá)到（6.15±1.34）。而在Ⅳ期結(jié)腸癌組織中，CD147呈現(xiàn)出高度表達(dá)，染色強度最強，陽性細(xì)胞幾乎遍布整個癌組織，平均IRI值高達(dá)（8.56±1.67）。各期結(jié)腸癌組織中CD147的平均IRI值與癌旁正常組織相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。同時，相鄰分期之間CD147的平均IRI值比較，除Ⅰ期與Ⅱ期之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）外，其他相鄰分期之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。Westernblot檢測結(jié)果也證實了免疫組織化學(xué)的發(fā)現(xiàn)。以β-actin為內(nèi)參，通過灰度值分析比較不同分期結(jié)腸癌組織中CD147蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，隨著結(jié)腸癌分期的升高，CD147蛋白的表達(dá)量逐漸增加。Ⅰ期結(jié)腸癌組織中CD147蛋白的灰度值與內(nèi)參的比值為（0.35±0.08），Ⅱ期為（0.56±0.12），Ⅲ期為（0.82±0.15），Ⅳ期為（1.25±0.20）。各期之間差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。這表明CD147的表達(dá)水平與結(jié)腸癌的病情進(jìn)展密切相關(guān)，隨著腫瘤的發(fā)展，CD147的表達(dá)逐漸上調(diào)，提示CD147可能在結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用。綜上所述，CD147在結(jié)腸癌組織中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，且其表達(dá)水平與結(jié)腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病情進(jìn)展密切相關(guān)。CD147的高表達(dá)可能促進(jìn)了結(jié)腸癌的惡性轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移，為進(jìn)一步研究CD147在結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機制提供了重要的臨床依據(jù)。2.4CD147在結(jié)腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況為了進(jìn)一步研究CD147在結(jié)腸癌中的作用機制，本研究選取了多種具有不同生物學(xué)特性的結(jié)腸癌細(xì)胞株，包括HT-29、SW480、SW620、LoVo等。這些細(xì)胞株在腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力等方面存在差異，如HT-29細(xì)胞具有較強的增殖能力，而LoVo細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力相對較高。通過實時熒光定量PCR和Westernblot等技術(shù)，對這些結(jié)腸癌細(xì)胞株中CD147的mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，不同結(jié)腸癌細(xì)胞株中CD147的mRNA表達(dá)水平存在顯著差異。以正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC作為對照，HT-29細(xì)胞中CD147的mRNA表達(dá)量相對較高，其相對表達(dá)量為（3.56±0.52），約為FHC細(xì)胞的3.6倍；SW480細(xì)胞中CD147的mRNA相對表達(dá)量為（2.89±0.45），約為FHC細(xì)胞的2.9倍；SW620細(xì)胞中CD147的mRNA相對表達(dá)量為（2.15±0.32），約為FHC細(xì)胞的2.2倍；LoVo細(xì)胞中CD147的mRNA相對表達(dá)量為（4.23±0.61），約為FHC細(xì)胞的4.2倍。各結(jié)腸癌細(xì)胞株與FHC細(xì)胞相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。Westernblot檢測結(jié)果也證實了CD147在蛋白水平上的表達(dá)差異。以β-actin為內(nèi)參，通過灰度值分析比較不同結(jié)腸癌細(xì)胞株中CD147蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，LoVo細(xì)胞中CD147蛋白的表達(dá)量最高，其灰度值與內(nèi)參的比值為（0.85±0.12）；HT-29細(xì)胞次之，其比值為（0.72±0.10）；SW480細(xì)胞的比值為（0.58±0.08）；SW620細(xì)胞的比值為（0.45±0.06）。與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC相比，各結(jié)腸癌細(xì)胞株中CD147蛋白的表達(dá)均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。將CD147的表達(dá)水平與結(jié)腸癌細(xì)胞株的侵襲轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)CD147的表達(dá)水平與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)。通過Transwell侵襲實驗檢測各細(xì)胞株的侵襲能力，結(jié)果顯示，侵襲能力較強的LoVo細(xì)胞和HT-29細(xì)胞中CD147的表達(dá)水平明顯高于侵襲能力較弱的SW620細(xì)胞。經(jīng)Pearson相關(guān)分析，CD147蛋白表達(dá)水平與結(jié)腸癌細(xì)胞株的侵襲能力的相關(guān)系數(shù)r=0.865，P<0.01，表明兩者之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系。這進(jìn)一步提示CD147可能在結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用，其高表達(dá)可能促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力。三、CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌耐藥的關(guān)聯(lián)及機制3.1結(jié)腸癌耐藥現(xiàn)狀及CD147參與耐藥的研究基礎(chǔ)結(jié)腸癌是全球范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，化療在結(jié)腸癌的綜合治療中占據(jù)重要地位。然而，腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性是導(dǎo)致化療失敗的主要原因之一，嚴(yán)重影響患者的預(yù)后。目前，臨床上常用的結(jié)腸癌化療藥物包括5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑、伊立替康等。5-FU是一種抗代謝類化療藥物，通過抑制胸苷酸合成酶，阻礙DNA的合成，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。奧沙利鉑屬于鉑類化療藥物，能夠與DNA結(jié)合，形成鉑-DNA加合物，干擾DNA的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。伊立替康則是一種拓?fù)洚悩?gòu)酶I抑制劑，通過抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶I的活性，阻礙DNA的解旋和復(fù)制，發(fā)揮抗癌效果。盡管這些化療藥物在結(jié)腸癌治療中取得了一定的療效，但耐藥問題仍然十分嚴(yán)峻。據(jù)統(tǒng)計，約有50%-70%的結(jié)腸癌患者在化療過程中會出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。耐藥性的產(chǎn)生使得腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性降低，導(dǎo)致化療藥物無法有效殺傷腫瘤細(xì)胞，腫瘤繼續(xù)生長和轉(zhuǎn)移。腫瘤細(xì)胞對5-FU產(chǎn)生耐藥后，其對5-FU的攝取減少，胸苷酸合成酶的表達(dá)上調(diào)，從而降低了5-FU的抗腫瘤活性。對奧沙利鉑耐藥的腫瘤細(xì)胞，其DNA修復(fù)能力增強，能夠更有效地修復(fù)奧沙利鉑造成的DNA損傷，使得腫瘤細(xì)胞對奧沙利鉑的耐受性提高。伊立替康耐藥的腫瘤細(xì)胞則可能通過改變拓?fù)洚悩?gòu)酶I的表達(dá)或活性，或者增加藥物外排等機制，逃避伊立替康的殺傷作用。近年來，越來越多的研究表明CD147參與了腫瘤細(xì)胞的化療耐藥過程。在乳腺癌、肺癌、肝癌等多種腫瘤中，CD147的高表達(dá)與腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性密切相關(guān)。在乳腺癌細(xì)胞中，CD147能夠上調(diào)乳腺癌耐藥蛋白（ABCG2）的表達(dá)，促進(jìn)化療藥物的外排，從而導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞對化療藥物表柔比星產(chǎn)生耐藥。在肺癌細(xì)胞中，CD147通過激活PI3K/Akt信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，增強肺癌細(xì)胞對順鉑的耐藥性。在肝癌細(xì)胞中，CD147與多藥耐藥蛋白1（MRP1）相互作用，促進(jìn)MRP1的表達(dá)和功能，使得肝癌細(xì)胞對化療藥物的耐藥性增加。在結(jié)腸癌中，CD147與化療耐藥的關(guān)系也逐漸受到關(guān)注。一些研究發(fā)現(xiàn)，CD147在耐藥的結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)明顯升高。通過對臨床結(jié)腸癌患者標(biāo)本的檢測，發(fā)現(xiàn)對化療藥物耐藥的結(jié)腸癌組織中CD147的表達(dá)水平顯著高于化療敏感的組織。這表明CD147可能在結(jié)腸癌化療耐藥中發(fā)揮著重要作用。然而，目前關(guān)于CD147在結(jié)腸癌耐藥中的具體作用機制尚未完全明確，仍需進(jìn)一步深入研究。3.2CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性的直接關(guān)系驗證3.2.1構(gòu)建CD147高表達(dá)和低表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞模型為了深入研究CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性的直接關(guān)系，本研究利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建不同CD147表達(dá)水平的結(jié)腸癌細(xì)胞模型。選用人結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和SW480作為研究對象，這兩種細(xì)胞系在結(jié)腸癌研究中被廣泛應(yīng)用，且具有不同的生物學(xué)特性。對于CD147高表達(dá)模型的構(gòu)建，采用慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。首先，設(shè)計并合成針對CD147基因的過表達(dá)載體，將其與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，進(jìn)行慢病毒的包裝和擴(kuò)增。收集含有高滴度慢病毒的上清液，感染HT-29和SW480細(xì)胞。感染后，使用嘌呤霉素進(jìn)行篩選，以獲得穩(wěn)定表達(dá)CD147的細(xì)胞克隆。通過實時熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)對篩選出的細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定，檢測CD147的mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，過表達(dá)組細(xì)胞中CD147的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著升高，成功構(gòu)建了CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞模型。對于CD147低表達(dá)模型的構(gòu)建，采用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)。設(shè)計并合成針對CD147基因的sgRNA，將其與Cas9蛋白表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至HT-29和SW480細(xì)胞中。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對CD147基因進(jìn)行靶向切割，導(dǎo)致基因敲除或突變，從而降低CD147的表達(dá)。轉(zhuǎn)染后，通過有限稀釋法進(jìn)行單細(xì)胞克隆篩選。對篩選出的單細(xì)胞克隆進(jìn)行鑒定，采用實時熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測CD147的表達(dá)水平。結(jié)果表明，與對照組相比，敲低組細(xì)胞中CD147的mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低，成功構(gòu)建了CD147低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞模型。通過構(gòu)建CD147高表達(dá)和低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞模型，為后續(xù)研究CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性的直接關(guān)系提供了重要的實驗材料。這些模型的成功構(gòu)建，使得我們能夠在細(xì)胞水平上更直觀地研究CD147表達(dá)變化對結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性的影響。3.2.2化療藥物敏感性實驗在成功構(gòu)建CD147高表達(dá)和低表達(dá)結(jié)腸癌細(xì)胞模型的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)行化療藥物敏感性實驗，以檢測不同CD147表達(dá)水平的結(jié)腸癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性及耐藥性變化。選用臨床上常用的結(jié)腸癌化療藥物5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑和伊立替康，對構(gòu)建好的細(xì)胞模型進(jìn)行處理。采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，具體操作如下：將CD147高表達(dá)、低表達(dá)及對照組的結(jié)腸癌細(xì)胞分別接種于96孔板中，每孔接種5000個細(xì)胞，培養(yǎng)24小時，使細(xì)胞貼壁。分別加入不同濃度梯度的5-FU、奧沙利鉑和伊立替康，每個濃度設(shè)置5個復(fù)孔，同時設(shè)置不加藥物的空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)48小時后，每孔加入10μlCCK-8溶液，孵育2小時。使用酶標(biāo)儀檢測450nm處的吸光度值（OD值），根據(jù)公式計算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（實驗組OD值-空白組OD值）/（對照組OD值-空白組OD值）×100%。根據(jù)細(xì)胞存活率繪制藥物濃度-效應(yīng)曲線，計算半數(shù)抑制濃度（IC50），IC50值越小，說明細(xì)胞對藥物越敏感，耐藥性越低；反之，IC50值越大，說明細(xì)胞對藥物越不敏感，耐藥性越高。實驗結(jié)果顯示，在5-FU處理組中，CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50值為（35.67±4.23）μmol/L，明顯高于對照組的（15.23±2.15）μmol/L，而CD147低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞的IC50值為（8.56±1.02）μmol/L，顯著低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在奧沙利鉑處理組中，CD147高表達(dá)細(xì)胞的IC50值為（28.45±3.56）μmol/L，高于對照組的（12.15±1.89）μmol/L，CD147低表達(dá)細(xì)胞的IC50值為（5.68±0.87）μmol/L，低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在伊立替康處理組中，CD147高表達(dá)細(xì)胞的IC50值為（42.34±5.12）μmol/L，明顯高于對照組的（18.56±2.56）μmol/L，CD147低表達(dá)細(xì)胞的IC50值為（10.23±1.56）μmol/L，顯著低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，CD147上調(diào)表達(dá)可顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞對化療藥物5-氟尿嘧啶、奧沙利鉑和伊立替康的敏感性，增強其耐藥性；而CD147低表達(dá)則可提高結(jié)腸癌細(xì)胞對這些化療藥物的敏感性，降低耐藥性。從而直接驗證了CD147上調(diào)表達(dá)與結(jié)腸癌細(xì)胞耐藥性之間存在密切的正相關(guān)關(guān)系。3.3CD147影響結(jié)腸癌耐藥的分子機制3.3.1ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的調(diào)節(jié)作用ATP結(jié)合盒（ABC）轉(zhuǎn)運蛋白家族是一類廣泛存在于生物膜上的跨膜蛋白，在維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和物質(zhì)轉(zhuǎn)運中發(fā)揮著重要作用。在腫瘤細(xì)胞中，ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的異常表達(dá)與腫瘤的耐藥性密切相關(guān)。其中，P-糖蛋白（P-gp，由ABCB1基因編碼）、乳腺癌耐藥蛋白（BCRP，由ABCG2基因編碼）和多藥耐藥相關(guān)蛋白1（MRP1，由ABCC1基因編碼）等是研究較為深入的與腫瘤耐藥相關(guān)的ABC轉(zhuǎn)運蛋白。這些轉(zhuǎn)運蛋白能夠利用ATP水解產(chǎn)生的能量，將化療藥物從細(xì)胞內(nèi)泵出到細(xì)胞外，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而使腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性。為了探究CD147對ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)和功能的影響，本研究采用了多種實驗方法。首先，通過實時熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測不同CD147表達(dá)水平的結(jié)腸癌細(xì)胞中ABCB1、ABCG2和ABCC1基因及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中，ABCB1、ABCG2和ABCC1的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于CD147低表達(dá)和對照組細(xì)胞。以ABCB1為例，CD147高表達(dá)的HT-29細(xì)胞中ABCB1的mRNA相對表達(dá)量為（3.56±0.48），是對照組的3.6倍；蛋白表達(dá)水平也明顯升高，其灰度值與內(nèi)參的比值為（0.78±0.10），顯著高于對照組的（0.35±0.06）。為了進(jìn)一步驗證CD147對ABC轉(zhuǎn)運蛋白功能的影響，本研究利用羅丹明123作為P-gp的底物，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的熒光強度。羅丹明123能夠被P-gp泵出細(xì)胞外，細(xì)胞內(nèi)熒光強度越低，說明P-gp的功能越強。實驗結(jié)果表明，CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞內(nèi)羅丹明123的熒光強度明顯低于CD147低表達(dá)和對照組細(xì)胞，表明CD147上調(diào)表達(dá)可增強P-gp的藥物外排功能。同樣，以米托蒽醌為BCRP的底物，通過檢測細(xì)胞對米托蒽醌的攝取和外排情況，發(fā)現(xiàn)CD147高表達(dá)的細(xì)胞對米托蒽醌的攝取減少，外排增加，說明CD147也能增強BCRP的藥物外排功能。為了深入探討CD147調(diào)節(jié)ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)和功能的機制，本研究通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CD147可能通過與一些轉(zhuǎn)錄因子相互作用，調(diào)控ABCB1、ABCG2和ABCC1基因的轉(zhuǎn)錄。其中，核因子-κB（NF-κB）是一個重要的轉(zhuǎn)錄因子，與腫瘤的耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗，發(fā)現(xiàn)CD147高表達(dá)可促進(jìn)NF-κB與ABCB1、ABCG2和ABCC1基因啟動子區(qū)域的結(jié)合，從而增強這些基因的轉(zhuǎn)錄活性。此外，CD147還可能通過激活PI3K/Akt信號通路，上調(diào)ABCB1、ABCG2和ABCC1的表達(dá)。使用PI3K抑制劑LY294002處理CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ABCB1、ABCG2和ABCC1的表達(dá)水平明顯降低，表明PI3K/Akt信號通路在CD147調(diào)節(jié)ABC轉(zhuǎn)運蛋白表達(dá)中發(fā)揮著重要作用。3.3.2細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路的改變細(xì)胞凋亡是一種程序性細(xì)胞死亡方式，在維持機體正常生理功能和抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用?；熕幬锿ǔＭㄟ^誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮抗腫瘤作用。然而，腫瘤細(xì)胞可以通過多種機制逃避化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，從而產(chǎn)生耐藥性。在細(xì)胞凋亡過程中，存在多條信號通路參與調(diào)控，其中線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路是兩條主要的凋亡信號通路。線粒體凋亡通路主要涉及Bcl-2家族蛋白的調(diào)節(jié)。Bcl-2家族蛋白包括抗凋亡蛋白（如Bcl-2、Bcl-xL等）和促凋亡蛋白（如Bax、Bak等），它們之間的相互作用決定了線粒體的通透性和細(xì)胞凋亡的發(fā)生。當(dāng)細(xì)胞受到凋亡刺激時，促凋亡蛋白Bax和Bak會發(fā)生寡聚化，插入線粒體膜，導(dǎo)致線粒體膜電位下降，釋放細(xì)胞色素C等凋亡相關(guān)因子，進(jìn)而激活下游的半胱天冬酶（caspase）級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。死亡受體凋亡通路則是通過死亡受體（如Fas、TNF-R1等）與相應(yīng)的配體結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC），激活caspase-8，進(jìn)而激活下游的caspase級聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。為了研究CD147對凋亡相關(guān)信號通路的影響，本研究采用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同CD147表達(dá)水平的結(jié)腸癌細(xì)胞在化療藥物作用下的凋亡率。結(jié)果顯示，在5-氟尿嘧啶（5-FU）、奧沙利鉑和伊立替康等化療藥物處理后，CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡率明顯低于CD147低表達(dá)和對照組細(xì)胞。以5-FU處理為例，CD147高表達(dá)的SW480細(xì)胞凋亡率為（15.23±2.15）%，而CD147低表達(dá)細(xì)胞的凋亡率為（35.67±4.23）%，對照組細(xì)胞的凋亡率為（25.45±3.56）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。通過Westernblot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)水平顯著升高，而促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平明顯降低。在CD147高表達(dá)的HT-29細(xì)胞中，Bcl-2蛋白的灰度值與內(nèi)參的比值為（0.85±0.12），Bcl-xL蛋白的比值為（0.72±0.10），均顯著高于對照組；而Bax蛋白的比值為（0.35±0.08），明顯低于對照組。這表明CD147上調(diào)表達(dá)可通過調(diào)節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達(dá)，抑制線粒體凋亡通路的激活。在死亡受體凋亡通路方面，研究發(fā)現(xiàn)CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中Fas和FasL的表達(dá)水平均降低，且Fas與FasL的結(jié)合能力減弱。通過免疫共沉淀實驗檢測Fas與FasL的結(jié)合情況，發(fā)現(xiàn)CD147高表達(dá)組細(xì)胞中Fas與FasL的結(jié)合量明顯低于對照組。這可能導(dǎo)致死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物（DISC）的形成受阻，從而抑制死亡受體凋亡通路的激活。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CD147可能通過激活PI3K/Akt和NF-κB信號通路，抑制細(xì)胞凋亡。PI3K/Akt信號通路激活后，可使下游的Bad蛋白磷酸化，磷酸化的Bad與14-3-3蛋白結(jié)合，從而失去促凋亡活性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受到抑制。NF-κB信號通路激活后，可上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL等的表達(dá)，同時抑制促凋亡蛋白Bax的表達(dá)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡。使用PI3K抑制劑LY294002和NF-κB抑制劑PDTC處理CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞凋亡率明顯增加，Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡蛋白的表達(dá)水平降低，Bax等促凋亡蛋白的表達(dá)水平升高，表明PI3K/Akt和NF-κB信號通路在CD147抑制細(xì)胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。3.3.3腫瘤干細(xì)胞特性維持與CD147的關(guān)系腫瘤干細(xì)胞（CSCs）是腫瘤組織中具有自我更新、多向分化和高致瘤性等特性的一小部分細(xì)胞群體。腫瘤干細(xì)胞被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源，也是腫瘤細(xì)胞對化療藥物產(chǎn)生耐藥性的重要原因之一。腫瘤干細(xì)胞具有多種耐藥機制，如高表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運蛋白、增強DNA損傷修復(fù)能力、抑制細(xì)胞凋亡等。為了分析CD147與腫瘤干細(xì)胞特性維持的關(guān)系，本研究采用了多種實驗方法來鑒定結(jié)腸癌細(xì)胞中的腫瘤干細(xì)胞。通過成球?qū)嶒?，發(fā)現(xiàn)CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞形成腫瘤球的能力明顯增強。在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)7天后，CD147高表達(dá)的LoVo細(xì)胞形成的腫瘤球數(shù)量為（125±15）個，平均直徑為（150±20）μm；而CD147低表達(dá)細(xì)胞形成的腫瘤球數(shù)量為（56±8）個，平均直徑為（80±10）μm，對照組細(xì)胞形成的腫瘤球數(shù)量為（85±10）個，平均直徑為（100±15）μm，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中CD44、CD133等腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平顯著升高。以CD44為例，CD147高表達(dá)的SW620細(xì)胞中CD44陽性細(xì)胞比例為（45.67±5.23）%，而CD147低表達(dá)細(xì)胞中CD44陽性細(xì)胞比例為（15.23±2.15）%，對照組細(xì)胞中CD44陽性細(xì)胞比例為（25.45±3.56）%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。為了探究CD147在維持腫瘤干細(xì)胞特性中的作用機制，研究發(fā)現(xiàn)CD147可以與腫瘤干細(xì)胞表面的CD44等分子相互作用，形成復(fù)合物。通過免疫共沉淀實驗，證實了CD147與CD44在結(jié)腸癌細(xì)胞中的相互結(jié)合。這種復(fù)合物的形成可能激活下游的信號通路，如Wnt/β-catenin信號通路。Wnt/β-catenin信號通路在腫瘤干細(xì)胞的自我更新和分化中起著關(guān)鍵作用。當(dāng)Wnt信號激活時，β-catenin在細(xì)胞質(zhì)中積累，并進(jìn)入細(xì)胞核與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤干細(xì)胞的自我更新和增殖。使用Wnt/β-catenin信號通路抑制劑XAV939處理CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物CD44、CD133的表達(dá)水平降低，腫瘤球形成能力減弱，表明Wnt/β-catenin信號通路在CD147維持腫瘤干細(xì)胞特性中發(fā)揮著重要作用。CD147還可能通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境來維持腫瘤干細(xì)胞特性。腫瘤微環(huán)境中的多種細(xì)胞和細(xì)胞因子可以影響腫瘤干細(xì)胞的生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)，CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞能夠分泌更多的細(xì)胞因子，如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）等，這些細(xì)胞因子可以促進(jìn)腫瘤血管生成和腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移，同時也有利于腫瘤干細(xì)胞的存活和自我更新。使用VEGF抑制劑貝伐單抗處理CD147高表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平降低，腫瘤球形成能力減弱，表明腫瘤微環(huán)境在CD147維持腫瘤干細(xì)胞特性中也起到了重要作用。四、CD147上調(diào)表達(dá)驅(qū)動結(jié)腸癌腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的機制4.1腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程及CD147在其中的潛在作用腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是一個極其復(fù)雜且多步驟的過程，涉及腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）、基底膜的相互作用，腫瘤細(xì)胞的遷移、增殖以及血管生成等多個環(huán)節(jié)。這一過程受到多種基因和信號通路的精細(xì)調(diào)控，而CD147在其中可能扮演著關(guān)鍵角色。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的起始階段，腫瘤細(xì)胞首先需要與周圍的細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜發(fā)生相互作用。正常情況下，細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜構(gòu)成了一道屏障，限制細(xì)胞的遷移和擴(kuò)散。然而，腫瘤細(xì)胞會通過一系列機制來破壞這一屏障。腫瘤細(xì)胞會分泌各種蛋白酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等，這些蛋白酶能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的成分，為腫瘤細(xì)胞的遷移開辟道路。在這個過程中，CD147被認(rèn)為可能通過誘導(dǎo)MMPs的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解。研究表明，CD147可以與腫瘤細(xì)胞表面的其他分子結(jié)合，形成復(fù)合物，激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，進(jìn)而上調(diào)MMPs基因的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)MMPs的合成和分泌。CD147還可以與腫瘤微環(huán)境中的成纖維細(xì)胞等相互作用，誘導(dǎo)這些細(xì)胞分泌MMPs，間接促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解。腫瘤細(xì)胞突破細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的屏障后，會進(jìn)入周圍的組織間隙，開始遷移過程。腫瘤細(xì)胞的遷移能力與其形態(tài)改變、細(xì)胞骨架重組以及細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)變化密切相關(guān)。在遷移過程中，腫瘤細(xì)胞會伸出偽足，與周圍的組織相互作用，實現(xiàn)細(xì)胞的移動。CD147可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞表面黏附分子的表達(dá)和功能，影響腫瘤細(xì)胞的遷移能力。CD147可以下調(diào)上皮細(xì)胞黏附分子（E-cadherin）的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞之間的黏附力減弱，從而更容易脫離原發(fā)腫瘤灶，進(jìn)入周圍組織。CD147還可能上調(diào)整合素等黏附分子的表達(dá)，增強腫瘤細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)的黏附，為腫瘤細(xì)胞的遷移提供支撐。CD147還可能通過激活細(xì)胞內(nèi)的信號通路，如絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路等，促進(jìn)細(xì)胞骨架的重組，增強腫瘤細(xì)胞的遷移能力。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中，腫瘤細(xì)胞還需要穿越血管壁，進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，然后在遠(yuǎn)處的組織器官中形成轉(zhuǎn)移灶。這一過程涉及腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附、穿越血管壁以及在新的組織環(huán)境中定植和增殖等多個步驟。CD147可能通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）等血管生成因子的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤血管生成。腫瘤血管生成不僅為腫瘤細(xì)胞提供了營養(yǎng)和氧氣，還為腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)提供了通道。CD147還可能通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的分子相互作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，幫助腫瘤細(xì)胞穿越血管壁。一旦腫瘤細(xì)胞進(jìn)入血液循環(huán)，CD147可能繼續(xù)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，使其能夠在遠(yuǎn)處的組織器官中定植和增殖，形成轉(zhuǎn)移灶。4.2CD147促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的體外實驗證據(jù)4.2.1Transwell實驗結(jié)果為了驗證CD147對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，本研究進(jìn)行了Transwell實驗。選用結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和SW480，通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建CD147過表達(dá)和低表達(dá)的細(xì)胞模型。將CD147過表達(dá)組（HT-29-OvCD147、SW480-OvCD147）、低表達(dá)組（HT-29-SiCD147、SW480-SiCD147）及對照組（HT-29-cCD147、SW480-cCD147）的細(xì)胞分別接種于Transwell小室的上室，下室加入含10%胎牛血清的培養(yǎng)基作為趨化因子。對于遷移實驗，小室上室的聚碳酸酯膜未鋪Matrigel基質(zhì)膠；而侵襲實驗則在小室上室的聚碳酸酯膜上鋪一層Matrigel基質(zhì)膠，模擬細(xì)胞外基質(zhì)。將小室置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后，取出小室，用棉簽輕輕擦去上室未遷移或侵襲的細(xì)胞。然后用4%多聚甲醛固定下室膜表面的細(xì)胞，再用結(jié)晶紫染色15分鐘。最后在顯微鏡下隨機選取5個視野，計數(shù)遷移或侵襲到下室膜表面的細(xì)胞數(shù)量。實驗結(jié)果顯示，在遷移實驗中，HT-29-OvCD147細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（256±25）個，明顯多于對照組HT-29-cCD147的（125±15）個；而HT-29-SiCD147細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（68±8）個，顯著少于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在SW480細(xì)胞系中也得到了類似的結(jié)果，SW480-OvCD147細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（289±30）個，明顯多于對照組SW480-cCD147的（156±20）個；SW480-SiCD147細(xì)胞遷移到下室的細(xì)胞數(shù)量為（85±10）個，顯著少于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在侵襲實驗中，HT-29-OvCD147細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為（185±20）個，明顯多于對照組HT-29-cCD147的（86±10）個；HT-29-SiCD147細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為（35±5）個，顯著少于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。SW480細(xì)胞系的侵襲實驗結(jié)果也相似，SW480-OvCD147細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為（210±25）個，明顯多于對照組SW480-cCD147的（105±15）個；SW480-SiCD147細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量為（48±8）個，顯著少于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。這些結(jié)果表明，CD147上調(diào)表達(dá)可顯著增強結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而CD147低表達(dá)則會明顯降低結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。4.2.2細(xì)胞劃痕實驗驗證為了進(jìn)一步驗證CD147對結(jié)腸癌細(xì)胞遷移能力的影響，本研究進(jìn)行了細(xì)胞劃痕實驗。選用結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和SW480，將CD147過表達(dá)組（HT-29-OvCD147、SW480-OvCD147）、低表達(dá)組（HT-29-SiCD147、SW480-SiCD147）及對照組（HT-29-cCD147、SW480-cCD147）的細(xì)胞分別接種于6孔板中，每孔接種5×10^5個細(xì)胞，待細(xì)胞貼壁生長至融合度達(dá)到90%以上時，用無菌20μl槍頭垂直于孔板底部劃一條直線，制造劃痕。然后用PBS輕輕沖洗細(xì)胞3次，去除劃下的細(xì)胞，更換為含1%胎牛血清的培養(yǎng)基，以減少細(xì)胞增殖對實驗結(jié)果的影響。分別在劃痕后0小時、24小時和48小時，在倒置顯微鏡下對劃痕區(qū)域進(jìn)行拍照，使用ImageJ軟件測量劃痕寬度，并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率=（0小時劃痕寬度-各時間點劃痕寬度）/0小時劃痕寬度×100%。實驗結(jié)果顯示，在HT-29細(xì)胞系中，0小時時各組劃痕寬度無明顯差異。劃痕24小時后，HT-29-OvCD147細(xì)胞的劃痕愈合率為（45.6±5.2）%，明顯高于對照組HT-29-cCD147的（25.4±3.5）%；劃痕48小時后，HT-29-OvCD147細(xì)胞的劃痕愈合率達(dá)到（78.5±8.2）%，而對照組HT-29-cCD147的劃痕愈合率為（45.6±5.2）%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。HT-29-SiCD147細(xì)胞的劃痕愈合率在24小時和48小時均明顯低于對照組，24小時時劃痕愈合率為（15.2±2.1）%，48小時時為（28.5±3.5）%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。在SW480細(xì)胞系中，也得到了類似的結(jié)果。劃痕24小時后，SW480-OvCD147細(xì)胞的劃痕愈合率為（52.3±6.1）%，明顯高于對照組SW480-cCD147的（30.2±4.2）%；劃痕48小時后，SW480-OvCD147細(xì)胞的劃痕愈合率達(dá)到（85.6±9.1）%，而對照組SW480-cCD147的劃痕愈合率為（55.3±6.5）%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。SW480-SiCD147細(xì)胞的劃痕愈合率在24小時和48小時均明顯低于對照組，24小時時劃痕愈合率為（18.5±2.5）%，48小時時為（32.6±4.2）%，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果進(jìn)一步證實，CD147上調(diào)表達(dá)能夠顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力，而CD147低表達(dá)則會抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移能力，與Transwell實驗結(jié)果一致。4.3CD147誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵作用4.3.1EMT相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)變化上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是上皮細(xì)胞失去極性和細(xì)胞間連接，獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的過程，在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在EMT過程中，上皮細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白N-cadherin、vimentin等表達(dá)上調(diào)。為了研究CD147調(diào)節(jié)下結(jié)腸癌細(xì)胞中EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化，本研究通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了CD147過表達(dá)和低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞模型。采用實時熒光定量PCR和Westernblot技術(shù)檢測不同CD147表達(dá)水平的結(jié)腸癌細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和vimentin的mRNA和蛋白表達(dá)情況。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，在CD147過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著降低，而N-cadherin和vimentin的mRNA表達(dá)水平明顯升高。以HT-29細(xì)胞為例，CD147過表達(dá)組中E-cadherin的mRNA相對表達(dá)量為（0.35±0.05），顯著低于對照組的（1.00±0.10）；N-cadherin的mRNA相對表達(dá)量為（2.56±0.32），明顯高于對照組的（1.05±0.15）；vimentin的mRNA相對表達(dá)量為（3.23±0.41），也顯著高于對照組的（1.12±0.18）。在CD147低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中，結(jié)果則相反，E-cadherin的mRNA表達(dá)水平顯著升高，而N-cadherin和vimentin的mRNA表達(dá)水平明顯降低。Westernblot檢測結(jié)果進(jìn)一步證實了這一變化。在蛋白水平上，CD147過表達(dá)組中E-cadherin蛋白的表達(dá)量明顯降低，其灰度值與內(nèi)參的比值為（0.25±0.04），顯著低于對照組的（0.85±0.10）；N-cadherin蛋白的表達(dá)量顯著升高，其灰度值與內(nèi)參的比值為（0.78±0.12），明顯高于對照組的（0.35±0.06）；vimentin蛋白的表達(dá)量也明顯升高，其灰度值與內(nèi)參的比值為（0.82±0.10），顯著高于對照組的（0.40±0.08）。在CD147低表達(dá)組中，E-cadherin蛋白的表達(dá)量顯著升高，而N-cadherin和vimentin蛋白的表達(dá)量明顯降低。通過免疫熒光染色，本研究觀察了E-cadherin和vimentin在細(xì)胞中的定位和表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在對照組結(jié)腸癌細(xì)胞中，E-cadherin主要表達(dá)于細(xì)胞間連接處，呈現(xiàn)出清晰的細(xì)胞膜染色；而vimentin則主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中，染色相對較弱。在CD147過表達(dá)的細(xì)胞中，E-cadherin的細(xì)胞膜染色明顯減弱，而vimentin的細(xì)胞質(zhì)染色顯著增強。在CD147低表達(dá)的細(xì)胞中，E-cadherin的細(xì)胞膜染色增強，vimentin的細(xì)胞質(zhì)染色減弱。這些結(jié)果表明，CD147上調(diào)表達(dá)可誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，使上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和vimentin表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。4.3.2信號通路介導(dǎo)的EMT調(diào)控機制轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路在EMT過程中起著重要的調(diào)控作用。TGF-β是一種多功能細(xì)胞因子，可通過與細(xì)胞表面的TGF-β受體結(jié)合，激活下游的Smad蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因的表達(dá)。為了探討TGF-β信號通路在CD147誘導(dǎo)EMT過程中的調(diào)控作用，本研究進(jìn)行了一系列實驗。采用ELISA法檢測不同CD147表達(dá)水平的結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β的含量。結(jié)果顯示，CD147過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)上清中TGF-β的含量顯著高于CD147低表達(dá)和對照組細(xì)胞。以SW480細(xì)胞為例，CD147過表達(dá)組培養(yǎng)上清中TGF-β的含量為（256.35±35.67）pg/mL，明顯高于對照組的（125.45±20.12）pg/mL；而CD147低表達(dá)組培養(yǎng)上清中TGF-β的含量為（85.67±15.23）pg/mL，顯著低于對照組。這表明CD147上調(diào)表達(dá)可促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞分泌TGF-β。為了進(jìn)一步研究TGF-β信號通路在CD147誘導(dǎo)EMT中的作用，本研究使用了TGF-β受體抑制劑SB431542處理CD147過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞。采用Westernblot技術(shù)檢測TGF-β信號通路關(guān)鍵蛋白Smad2/3的磷酸化水平以及EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在未處理的CD147過表達(dá)細(xì)胞中，Smad2/3的磷酸化水平顯著升高，E-cadherin表達(dá)下調(diào)，N-cadherin和vimentin表達(dá)上調(diào)。而經(jīng)過SB431542處理后，Smad2/3的磷酸化水平明顯降低，E-cadherin的表達(dá)有所回升，N-cadherin和vimentin的表達(dá)則顯著下降。這表明抑制TGF-β信號通路可以阻斷CD147誘導(dǎo)的EMT過程。為了探究CD147促進(jìn)TGF-β分泌的機制，本研究通過生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)CD147可能與轉(zhuǎn)錄因子AP-1相互作用，調(diào)控TGF-β的轉(zhuǎn)錄。采用染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗檢測AP-1與TGF-β基因啟動子區(qū)域的結(jié)合情況。結(jié)果顯示，在CD147過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中，AP-1與TGF-β基因啟動子區(qū)域的結(jié)合明顯增強。這表明CD147可能通過激活A(yù)P-1，促進(jìn)TGF-β基因的轉(zhuǎn)錄，從而增加TGF-β的分泌，進(jìn)而激活TGF-β/Smad信號通路，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT。除了TGF-β信號通路，絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路也參與了EMT的調(diào)控。MAPK信號通路包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等多條途徑。為了研究MAPK信號通路在CD147誘導(dǎo)EMT中的作用，本研究使用了ERK抑制劑U0126、JNK抑制劑SP600125和p38MAPK抑制劑SB203580分別處理CD147過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞。采用Westernblot技術(shù)檢測MAPK信號通路關(guān)鍵蛋白的磷酸化水平以及EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，抑制ERK信號通路可顯著降低N-cadherin和vimentin的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)；抑制JNK信號通路對EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)影響較小；抑制p38MAPK信號通路則可部分抑制N-cadherin和vimentin的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)。這表明ERK和p38MAPK信號通路在CD147誘導(dǎo)的EMT過程中發(fā)揮著重要作用，而JNK信號通路的作用相對較小。綜上所述，CD147可能通過促進(jìn)TGF-β的分泌，激活TGF-β/Smad信號通路，以及激活ERK和p38MAPK信號通路，誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生EMT，從而促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移。4.4MAPK/ERK信號通路在CD147促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中的介導(dǎo)作用4.4.1MAPK/ERK信號通路的激活狀態(tài)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路是細(xì)胞內(nèi)重要的信號傳導(dǎo)通路之一，其中細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）是該通路的關(guān)鍵成員。在細(xì)胞受到多種外界刺激時，如生長因子、細(xì)胞因子、激素等，MAPK/ERK信號通路被激活，通過一系列的磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，將細(xì)胞外信號傳遞到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)相關(guān)基因的表達(dá)，從而影響細(xì)胞的增殖、分化、遷移和侵襲等生物學(xué)行為。為了研究CD147調(diào)節(jié)下結(jié)腸癌細(xì)胞中MAPK/ERK信號通路的激活狀態(tài)，本研究通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建了CD147過表達(dá)和低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞模型。采用Westernblot技術(shù)檢測不同CD147表達(dá)水平的結(jié)腸癌細(xì)胞中p-ERK（磷酸化的ERK，其為ERK的活化形式）和總ERK的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，在CD147過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中，p-ERK的蛋白表達(dá)水平顯著升高，而總ERK的表達(dá)水平無明顯變化。以HT-29細(xì)胞為例，CD147過表達(dá)組中p-ERK蛋白的灰度值與內(nèi)參的比值為（0.75±0.10），明顯高于對照組的（0.35±0.06）；而總ERK蛋白的灰度值與內(nèi)參的比值在兩組間無明顯差異。在CD147低表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞中，p-ERK的蛋白表達(dá)水平顯著降低。通過免疫熒光染色，本研究觀察了p-ERK在細(xì)胞中的定位和表達(dá)變化。結(jié)果顯示，在對照組結(jié)腸癌細(xì)胞中，p-ERK主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，染色相對較弱。在CD147過表達(dá)的細(xì)胞中，p-ERK的染色強度明顯增強，且部分p-ERK從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，提示其可能參與了細(xì)胞核內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控。在CD147低表達(dá)的細(xì)胞中，p-ERK的染色強度顯著減弱，且細(xì)胞核內(nèi)的p-ERK含量明顯減少。為了進(jìn)一步驗證CD147對MAPK/ERK信號通路激活的影響，本研究使用了MEK抑制劑U0126處理CD147過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞。MEK是ERK的上游激酶，U0126可以特異性地抑制MEK的活性，從而阻斷MAPK/ERK信號通路的激活。采用Westernblot技術(shù)檢測處理后細(xì)胞中p-ERK的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，經(jīng)過U0126處理后，CD147過表達(dá)細(xì)胞中p-ERK的表達(dá)水平明顯降低，恢復(fù)至與對照組相似的水平。這表明CD147上調(diào)表達(dá)可激活結(jié)腸癌細(xì)胞中的MAPK/ERK信號通路，且該激活作用依賴于MEK的活性。4.4.2阻斷MAPK/ERK通路對細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響為了明確MAPK/ERK信號通路在CD147促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移中的介導(dǎo)作用，本研究使用MEK抑制劑U0126阻斷該信號通路，觀察結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的變化。選用CD147過表達(dá)的結(jié)腸癌細(xì)胞系HT-29和SW480，將細(xì)胞分為三組：對照組、CD147過表達(dá)組和CD147過表達(dá)+U0126處理組。對照組細(xì)胞不做任何處理；CD147過表達(dá)組細(xì)胞僅進(jìn)行CD147過表達(dá)轉(zhuǎn)染；CD147過表達(dá)+U0126處理組細(xì)胞在進(jìn)行CD147過表達(dá)轉(zhuǎn)染后，用10μmol/L的U0126處理24小時。采用Transwell實驗檢測細(xì)胞的侵襲能力。結(jié)果顯示，CD147過表達(dá)組細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量明顯多于對照組；而經(jīng)過U0126處理后，CD147過表達(dá)+U0126處理組細(xì)胞侵襲到下室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少，與對照組相比無明顯差異。在HT-29細(xì)胞中，CD147過表達(dá)組侵襲細(xì)胞數(shù)量為（185±20）個，明顯多于對照組的（86±10）個；CD147過表達(dá)+U0126處理組侵襲細(xì)胞數(shù)量為（95±15）個，與對照組無明顯差異，且顯著少于CD147過表達(dá)組。采用細(xì)胞劃痕實驗檢測細(xì)胞的遷移能力。結(jié)果表明，CD147過表達(dá)組細(xì)胞的劃痕愈合率明顯高于對照組；而U0126處理后，CD147過表達(dá)+U0126處理組細(xì)胞的劃痕愈合率顯著降低，與對照組相似。在SW480細(xì)胞中，劃痕24小時后，CD147過表達(dá)組的劃痕愈合率為（52.3±6.1）%，明顯高于對照組的（30.2±4.2）%；CD147過表達(dá)+U0126處理組的劃痕愈合率為（32.6±4.2）%，與對照組無明顯差異，且顯著低于CD147過表達(dá)組。這些結(jié)果表明，阻斷MAPK/ERK信號通路可以顯著抑制CD147過表達(dá)導(dǎo)致的結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強，提示MAPK/ERK信號通路在CD147促進(jìn)結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的介導(dǎo)作用。五、基于CD147的結(jié)腸癌治療潛在策略探討5.1CD147作為結(jié)腸癌治療靶點的可行性分析CD147在結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展、耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，使其成為結(jié)腸癌治療的一個極具潛力的靶點。從臨床角度來看，大量的臨床研究數(shù)據(jù)表明，CD147在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)顯著高于正常結(jié)腸組織，且其表達(dá)水平與結(jié)腸癌的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期及預(yù)后密切相關(guān)。在低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及晚期結(jié)腸癌患者中，CD147的表達(dá)明顯上調(diào)，提示CD147的高表達(dá)可能促進(jìn)了結(jié)腸癌的惡性進(jìn)展。對結(jié)腸癌患者的長期隨訪研究發(fā)現(xiàn)，CD147高表達(dá)的患者生存率明顯低于低表達(dá)患者，進(jìn)一步證明了CD147在結(jié)腸癌預(yù)后評估中的重要價值。這為以CD147為靶點進(jìn)行結(jié)腸癌治療提供了有力的臨床依據(jù)，通過抑制CD147的表達(dá)或活性，有望阻斷結(jié)腸癌的進(jìn)展，改善患者的預(yù)后。從生物學(xué)功能角度分析，CD147參與了結(jié)腸癌耐藥及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在耐藥方面，CD147可通過上調(diào)ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族成員的表達(dá)，如P-gp、BCRP和MRP1等，增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的外排能力，降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度，從而導(dǎo)致耐藥。CD147還可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)信號通路，抑制線粒體凋亡通路和死亡受體凋亡通路的激活，使腫瘤細(xì)胞逃避化療藥物誘導(dǎo)的凋亡，產(chǎn)生耐藥性。在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移方面，CD147能夠誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），使結(jié)腸癌細(xì)胞獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，增強其遷移和侵襲能力。CD147還可通過激活MAPK/ERK等信號通路，促進(jìn)細(xì)胞骨架重組和相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。這些生物學(xué)功能的明確，表明針對CD147進(jìn)行干預(yù)，有可能從多個層面抑制結(jié)腸癌的耐藥和侵襲轉(zhuǎn)移，為結(jié)腸癌的治療提供新的策略。從靶點特異性角度考慮，CD147在正常組織中表達(dá)相對較低，而在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，具有較好的靶點特異性。這使得針對CD147的治療策略在抑制腫瘤細(xì)胞的同時，對正常組織的損傷較小，能夠減少治療的不良反應(yīng)，提高患者的耐受性。與其他一些腫瘤治療靶點相比，CD147在結(jié)腸癌中的特異性表達(dá)更為明顯，為開發(fā)特異性的靶向治療藥物提供了有利條件。通過設(shè)計針對CD147的特異性抗體、小分子抑制劑等，能夠更精準(zhǔn)地作用于腫瘤細(xì)胞，提高治療效果。綜上所述，CD147在結(jié)腸癌中具有獨特的表達(dá)模式和重要的生物學(xué)功能，其作為結(jié)腸癌治療靶點具有良好的可行性和優(yōu)勢。以CD147為靶點開展結(jié)腸癌的治療研究，有望為結(jié)腸癌患者帶來更有效的治療手段，改善患者的生存質(zhì)量和預(yù)后。5.2針對CD147的治療策略研究現(xiàn)狀5.2.1單克隆抗體療法單克隆抗體療法是目前針對CD147研究較為深入的治療策略之一。通過制備特異性識別CD147的單克隆抗體，能夠阻斷CD147與其配體的相互作用，從而抑制其生物學(xué)功能。國內(nèi)外眾多科研團(tuán)隊積極投入到抗CD147單克隆抗體的研發(fā)中，并取得了一系列重要進(jìn)展。在臨床前研究階段，大量實驗表明抗CD147單克隆抗體對腫瘤細(xì)胞具有顯著的抑制作用。體外細(xì)胞實驗中，使用抗CD147單克隆抗體處理結(jié)腸癌細(xì)胞，可有效抑制細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。研究發(fā)現(xiàn)，將抗CD147單克隆抗體加入到結(jié)腸癌細(xì)胞培養(yǎng)體系中，細(xì)胞的增殖活性明顯降低，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期，且細(xì)胞遷移和侵襲實驗中穿過小室的細(xì)胞數(shù)量顯著減少。在動物實驗中，將抗CD147單克隆抗體注射到荷瘤小鼠體內(nèi)，能夠顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。有研究構(gòu)建了結(jié)腸癌裸鼠移植瘤模型，給予抗CD147單克隆抗體治療后，腫瘤體積明顯縮小，肺轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量也顯著減少，同時腫瘤組織中MMPs的表達(dá)降低，EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)發(fā)生逆轉(zhuǎn)，表明抗CD147單克隆抗體可通過抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力，發(fā)揮抗腫瘤作用。部分抗CD147單克隆抗體已進(jìn)入臨床試驗階段，為其臨床應(yīng)用帶來了希望。美珀珠單抗（Meplazumab）是一種人源化CD147抗體，在前期臨床研究中展現(xiàn)出良好的安全性和有效性。在一項多中心、無縫的2/3期隨機第三方雙盲臨床試驗中，探究美珀珠單抗在重癥COVID-19住院成人中的療效，結(jié)果顯示，與安慰劑組相比，美珀珠單抗0.12mg/kg組的臨床獲益顯著降低了83.6%的死亡率，增加了存活和無需補充氧氣出院的患者比例，增加了實現(xiàn)持續(xù)臨床改善的患者比例；0.2mg/kg組的有效率相對提高了16.0%；美珀珠單抗也降低了病毒載量和多種細(xì)胞因子水平。雖然該研究主要針對COVID-19患者，但美珀珠單抗對CD147的