藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)

基因檢測技術(shù)指南（試行）

前言

藥物體內(nèi)代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)及藥物作用靶點(diǎn)基因的遺傳變異及其表達(dá)水平的變化可通過影

響藥物的體內(nèi)濃度和敏感性，導(dǎo)致藥物反應(yīng)性個(gè)體差異。近年來隨著人類基因組學(xué)的發(fā)

展，藥物基因組學(xué)領(lǐng)域得到了迅猛發(fā)展，越來越多的藥物基因組生物標(biāo)記物及其檢測方

法相繼涌現(xiàn)。藥物基因組學(xué)已成為指導(dǎo)臨床個(gè)體化用藥、評(píng)估嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)發(fā)生風(fēng)

險(xiǎn)、指導(dǎo)新藥研發(fā)和評(píng)價(jià)新藥的重要工具，部分上市的新藥僅限于特定基因型的適應(yīng)癥

患者。美國FDA已批準(zhǔn)在140余種藥物的藥品標(biāo)簽中增加藥物基因組信息，涉及的藥

物基因組生物標(biāo)記物42個(gè)。此外，部分行業(yè)指南也將部分非FDA批準(zhǔn)的生物標(biāo)記物及

其特性(如MGMT基因甲基化)的檢測列入疾病的治療指南。藥物反應(yīng)相關(guān)基因及其

表達(dá)產(chǎn)物的分子檢測是實(shí)施個(gè)體化藥物治療的前提。

藥理學(xué)與遺傳學(xué)結(jié)合的關(guān)鍵環(huán)節(jié)包括藥物代謝動(dòng)力學(xué)(phairnacokinetics,PK)和

藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)(pharmacodynamics,PD)兩方面c藥物代謝動(dòng)力學(xué)主要是定量研究藥

物在生物體內(nèi)吸收、分布、代謝和排泄規(guī)律，側(cè)重于闡明藥物的體內(nèi)過程；藥物效應(yīng)動(dòng)

力學(xué)主要研究藥物對(duì)機(jī)體的作用、作用規(guī)律及作用機(jī)制，其內(nèi)容包括藥物與作用靶位之

間相互作用所引起的生化、生理學(xué)和形態(tài)學(xué)變化，側(cè)重于解釋藥物如何與作用靶點(diǎn)發(fā)生

作用。對(duì)藥物代謝酶和藥物靶點(diǎn)基因進(jìn)行檢測可指導(dǎo)臨床針對(duì)特定的患者選擇合適的藥

物和給藥劑量，實(shí)現(xiàn)個(gè)體化用藥，從而提高藥物治療的有效性和安全性，防止嚴(yán)重藥物

不良反應(yīng)的發(fā)生。目前美國FDA和我國食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)都已批準(zhǔn)了一系

列的個(gè)體化用藥基因診斷試劑盒。這些試劑盒基本都是對(duì)人DNA樣本進(jìn)行基因檢測。

而在基因表達(dá)的檢測方面，由于RNA的穩(wěn)定性差，樣本處置不當(dāng)可導(dǎo)致目標(biāo)RNA降解,

使得檢測結(jié)果不準(zhǔn)確，影響臨床判斷。因此，RNA檢測試劑的研發(fā)相對(duì)滯后。

本指南旨在為個(gè)體化用藥基因檢測提供一致性的方法。本指南中所指的藥物基因組

生物標(biāo)志物不包括影響抗感染藥物反應(yīng)性的微生物基因組變異。此外，腫瘤靶向治療藥

物個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測指南見《腫瘤個(gè)體化治疔的檢測技術(shù)指南》。

本指南起草單位：中南大學(xué)湘雅醫(yī)院臨床藥理研究所、中南大學(xué)臨床藥理研究所、

中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所，并經(jīng)國家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會(huì)、中國

藥理學(xué)會(huì)藥物基因組學(xué)專業(yè)委員會(huì)、中國藥理學(xué)會(huì)臨床藥理學(xué)專業(yè)委員會(huì)和中華醫(yī)學(xué)會(huì)

檢驗(yàn)分會(huì)組織修訂。

本指南起草人：周宏潮、陳小平、張偉、劉昭前、尹繼業(yè)、李智、李曦、唐潔、俞

竟、彭靜波、曹杉、成瑜C

目錄

1.本指南適用范圍.........................................................................1

2.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測概述.................................................1

3,標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語...............................................................................1

4.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測分析前質(zhì)量保證......................................6

4.1采樣前準(zhǔn)備....................................................................6

4.2標(biāo)本采集......................................................................7

4.3標(biāo)本的運(yùn)輸與保存.............................................................9

4.4標(biāo)本的接收與保存.............................................................9

5.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測分析中質(zhì)量保證.....................................10

5.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要求...............................................................10

5.2檢測方法.....................................................................11

5.3儀器設(shè)備的使用、維護(hù)與保養(yǎng)..................................................17

5.4人員培訓(xùn).....................................................................17

5.5檢測體系的性能驗(yàn)證..........................................................18

6.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測分析后質(zhì)量保證.....................................19

6.1.檢測報(bào)告、解釋及報(bào)告發(fā)放....................................................19

6.2檢測后樣本的保存和處理.............................................................23

7.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測的質(zhì)量保證.........................................23

7.1檢測確認(rèn)和特征描述..........................................................24

7.2可操作性的SOP編寫.........................................................24

7.3質(zhì)控品與室內(nèi)質(zhì)控............................................................24

7.4室內(nèi)質(zhì)控的評(píng)價(jià)..............................................................26

7.5室間質(zhì)量評(píng)價(jià)................................................................26

8.制度..................................................................................27

附錄A.基因及突變名稱、核酸信息.......................................................28

附錄B.縮略語...........................................................................30

附錄C.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測項(xiàng)目列舉................................33

附錄D.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因相關(guān)的藥物........................................50

參考文獻(xiàn)...............................................................................52

1.本指南適用范圍

本指南由國家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測技術(shù)專家委員會(huì)制定，旨在為臨慶檢驗(yàn)實(shí)

驗(yàn)室進(jìn)行藥物代謝酣和藥物靶點(diǎn)基因的檢測提供指導(dǎo)。本指南的主要適用對(duì)象為開展個(gè)

體化醫(yī)學(xué)分子檢測的醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室。

2.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測概述

藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因特性的變化可通過影響藥物的體內(nèi)濃度和靶組織

對(duì)藥物的敏感性，導(dǎo)致藥物反應(yīng)性(包括藥物的療效和不良反應(yīng)發(fā)生)個(gè)體差異。藥物

基因組生物標(biāo)志物的檢測是臨床實(shí)施個(gè)體化藥物治療的前提。從藥物代謝酶和藥物作用

靶點(diǎn)基因出發(fā)，對(duì)個(gè)體化用藥基因檢測的適應(yīng)人群、標(biāo)本采集、運(yùn)輸、接收、處理、樣

本檢測、結(jié)果報(bào)告與解釋、室內(nèi)室間質(zhì)控需遵循的基本原則，以及可能出現(xiàn)的問題與應(yīng)

對(duì)措施等方面的內(nèi)容進(jìn)行介紹，可為基于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)的基因檢測提供標(biāo)

準(zhǔn)化指導(dǎo)c

3.標(biāo)準(zhǔn)術(shù)語

3.1Ct值(thresholdcycle)

熒光定量PCR反應(yīng)的熒光強(qiáng)度超過設(shè)定的閾值所需的循環(huán)數(shù)。Ct值位于PCR反應(yīng)

的指數(shù)期初期，與標(biāo)本中待測核酸分子的原始拷貝數(shù)呈反比，即樣本中原始拷貝數(shù)越多，

熒光強(qiáng)度升高的就越快，相應(yīng)的Ct值就越小。

3.2RNA(ribonucleicacid)

核糖核酸，與DNA類似的單鏈核酸，由核糖核甘酸按照一定的順序排列而成，含

尿嗑咤而不含胸腺喑呢，存在于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成及其他化學(xué)活

動(dòng)中起重要的作用。RNA分子包含信使RNA(mRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(tRNA)、核糖體

RNA(rRNA)和其他小RNA等多種類型，分別行使不同的功能。各種RNA的混合物

秘;為總RNAo

3.3rs和ss體系SNP

由美國國立生物技術(shù)信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation,NCBI)

建立、dbSNP數(shù)據(jù)庫制定的SNP命名體系，rs體系的SNP代表己獲得官方認(rèn)可和推薦

的參考SNP(referenceSNP),ss體系的SNP代表用戶新遞交但尚未得到認(rèn)可的SNP

(submittedSNP)。

3.4TE緩沖液

TE緩沖液由Tris和EDTA配置而成，土要用于溶解DNA,能穩(wěn)定儲(chǔ)存DNA。

3.5錯(cuò)配修復(fù)（mismatchrepair*MMR）

在含有錯(cuò)配堿基的DNA分子中，使正常核甘酸序列恢復(fù)的核甘酸修復(fù)方式，這種

類型的修復(fù)可糾正DNA雙螺旋上錯(cuò)配的堿基對(duì)，還可修復(fù)因復(fù)制打滑而產(chǎn)生的核甘酸

插入或缺失。MMR的過程需要區(qū)分母鏈和子鏈，做到只切除子鏈上錯(cuò)誤的核甘酸，而

不會(huì)切除母鏈上的正常核昔酸。修復(fù)的過程是：識(shí)別出正確的鏈，切除掉不正確的部分,

然后通過DNA聚合酶III和DNA連接酶的作用，合成正確配對(duì)的雙鏈DNAo

3.6單核昔酸多態(tài)性（SNP）

是指由單個(gè)核甘酸一A、T、C或G的改變而引起的DNA序列的改變，造成包括人

類在內(nèi)的物種之間染色體基因組的多樣性。

3.7等位基因

一般是指位于一對(duì)同源染色體相同位置上控制某一性狀的不同形態(tài)的一對(duì)基因。若

成對(duì)的等位基因中兩個(gè)成員完全相同，則該個(gè)體對(duì)此性狀來說是純合子C若兩個(gè)等位基

因各不相同，則該個(gè)體對(duì)該性狀來說是雜合子。

3.85-氟尿嘴咤

一種喀咤類似物，作為胸甘酸合成醐抑制劑，阻斷DNA復(fù)制的必需原料胸腺喘咤

的合成。主要用于腫瘤的治療）

3.9光密度

表示紫外光照射下被檢測物吸收的光密度，260nm波長下的吸光值（DNA吸收峰

值）可用來表示DNA的相對(duì)濃度，具體換算公式為：DNA濃度（ng/川）=OD26OX50X

稀釋倍數(shù)。

3.10基因芯片

將大量（通常每平方厘米點(diǎn)陣密度高于400）的核酸探針分子固定于支持物上并與

標(biāo)記的樣品分子進(jìn)行雜交，通過檢測每個(gè)探針分子的雜交信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)而獲取樣品分子的

數(shù)量和序列信息。

3.11基因

是遺傳物質(zhì)的最小功能單位，是指具有一定生物學(xué)意義的一段DNAo

3.12基因型

又稱遺傳型，是某一生物個(gè)體全部基因組合的總稱，它反映生物體的遺傳構(gòu)成，即

從雙親獲得的全部基因的總和。據(jù)估計(jì)，人類的結(jié)構(gòu)基因有3萬個(gè)。因此，整個(gè)生物的

2

基因型是無法表示的，遺傳學(xué)中具體使用的基因型，往往是指某一性狀的基因型。

3.13基因組生物標(biāo)志物

是一種可用于指示正常生物學(xué)過程、病理過程和/或?qū)χ委熂捌渌深A(yù)措施反應(yīng)性的

可測量的DNA或RNA特性。其中DNA的特性可包括但不僅限于單核甘酸多態(tài)性、短

序列重復(fù)次數(shù)多態(tài)性、單倍型、DNA修飾如甲基化、核甘酸的插入/缺失、拷貝數(shù)變異

及細(xì)胞遺傳學(xué)重排如轉(zhuǎn)位、重復(fù)、缺失或反轉(zhuǎn)。RNA特性包括但不僅限于RNA序列、

RNA表達(dá)水平、RNA處理過程(如剪接和編輯)、微小RNA。

3?14檢出限(limitofdetection,LOD)

標(biāo)本中一種分析物可被檢出的最低的含量，這一分析物含量可能不是量化的具體數(shù)

值。

3.15健康保險(xiǎn)隱私及責(zé)任法案(healthinsuranceportabilityandaccountabilityact,

HIPAA)

美國政府1996年頒布的、醫(yī)療服務(wù)行業(yè)必須遵守的法案。該法案制定了一系列安

全標(biāo)準(zhǔn)，就保健計(jì)劃、供應(yīng)商及結(jié)算中心如何以電子文件的形式傳送、訪問和存儲(chǔ)受保

護(hù)的健康信息做出了詳細(xì)的規(guī)定。

3.16聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)

簡稱PCR技術(shù)，是一-種體外擴(kuò)增特異DNA片段的技術(shù)，應(yīng)用該技術(shù)可以在短時(shí)間

內(nèi)將一個(gè)或幾個(gè)DNA拷貝擴(kuò)增到百萬數(shù)量級(jí)。

3?17臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室

是指對(duì)取自人體的各種標(biāo)本進(jìn)行生物學(xué)、微生物學(xué)、免疫學(xué)、化學(xué)、血液免疫學(xué)、

血液學(xué)、生物物理學(xué)、細(xì)胞學(xué)等檢驗(yàn)，并為臨床提供醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)服務(wù)的實(shí)驗(yàn)室。

3?18靈敏度(sensitivity)

測量系統(tǒng)的示值變化除以相應(yīng)的被測量值變化所得的商。

3.19室內(nèi)質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行的用于滿足質(zhì)量要求的操作技術(shù)和活動(dòng)。

3.20室間質(zhì)量評(píng)價(jià)

室間質(zhì)量評(píng)價(jià)是多家實(shí)驗(yàn)室分析同一標(biāo)本，并由外部獨(dú)立機(jī)構(gòu)收集和反饋實(shí)驗(yàn)室上

報(bào)結(jié)果、評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)室操作的過程，也稱能力驗(yàn)證。

3.21脫氧核糖核酸(DNA)

3

核酸的一種，是由特殊序列的脫氧核糖核甘酸單元(dNTP)構(gòu)成的多聚核甘酸，

起攜帶遺傳信息的功能。DNA為一種雙鏈分子，通過核甘酸堿基對(duì)間的氫鍵維系。DNA

包含的4種核甘酸包括：腺喋吟(A)、鳥喋吟(G)、胸腺喀咤(T)和胞喀咤(G)o人

類存在兩種類型的DNA：來自染色體的基因組DNA(gDNA)和線粒體DNA。

3.22能力驗(yàn)證(proficiencytestingsPT)

多個(gè)標(biāo)本周期性地發(fā)送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析和(或)鑒定，將每一實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果與同

組的其他實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果或指定值進(jìn)行比較，并將比較結(jié)果報(bào)告給參與的實(shí)驗(yàn)室，同室間

質(zhì)量評(píng)價(jià)。

3.23生物標(biāo)記物(biomarker)

患者標(biāo)本中所含有的一種特殊的分析物質(zhì)(如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等)，可用于疾

病診斷、判斷疾病分期或評(píng)價(jià)新藥或新療法在目標(biāo)人群中的安全性和有效性。

3.24微五星

指基因上含有重復(fù)的DNA短小序列或單核甘酸的區(qū)域，每個(gè)單元長度在1-6bp之

間。根據(jù)重復(fù)單元的構(gòu)成與分布，微衛(wèi)星DNA序列可分為3種類型：單一型、復(fù)合型

和間斷型。

3.25微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(niicrosatelliteinstabilityyMSI)

是指腫瘤基因組特定的微衛(wèi)星位點(diǎn)與其對(duì)應(yīng)的非腫瘤基因組相比，因重復(fù)單位的缺

失或插入而造成的結(jié)構(gòu)性等位基因的大小發(fā)生改變，出現(xiàn)新的微衛(wèi)星等位基因現(xiàn)象。

3.26線性

在已知的范圍內(nèi)，某檢測提供的結(jié)果能夠直接與標(biāo)本的濃度(或量值)成匕例關(guān)系

的能力。

3.27相對(duì)定量

通過標(biāo)準(zhǔn)曲線法和CT值比較法測定目的基因的相對(duì)表達(dá)量，以比較兩個(gè)或多個(gè)樣

本中目的基因的表達(dá)差異°該方法通常用來檢測基因表達(dá)量是上調(diào)還是下降。

3.28遺傳藥理學(xué)

研究機(jī)體的基因多態(tài)性對(duì)藥物反應(yīng)個(gè)體差異的影響，是藥物基因組學(xué)的重要內(nèi)容。

3.29藥物不良反應(yīng)(adversedrugreaction,ADR)

是指上市的合格藥品在常規(guī)用法、用量情況下出現(xiàn)的，與用藥目的無關(guān)，并給患者

帶來痛苦或危害的反應(yīng)。

4

3.30藥物的反應(yīng)性

包括藥物吸收和分布（即藥代動(dòng)力學(xué)）、藥物效應(yīng)（如藥物效應(yīng)動(dòng)力學(xué)）、藥物的療

效及藥物不良反應(yīng)。

3.31藥物基因組學(xué)

研究人類基因組信息與藥物反應(yīng)之間的關(guān)系，同時(shí)也可以發(fā)現(xiàn)藥物新靶點(diǎn)和提高臨

床試驗(yàn)的成功率。

3.32熒光定量PCR

通過應(yīng)用熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性探針，對(duì)聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，

實(shí)時(shí)監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)基因檢測的定性和

（或）定量分析。

3.33熒光原位雜交（FISH）

一種細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，可以用來對(duì)核酸進(jìn)行檢測和定位.熒光標(biāo)記的核酸探針只與

具有高度相似性的核酸雜交，可用于染色體上基因的定位和定量。

334雜交

兩個(gè)以上的分子具有相近的化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)而在適宜的條件下形成雜交體，雜交體

中的分子不是來自一個(gè)二聚體分子。利用兩條不同來源的多核甘酸鏈之間的互補(bǔ)性而使

它們形成雜交體雙鏈被稱為核酸雜交。

3.35知情同意（informedconsent）

患者有權(quán)利知曉自己的病情，并可以對(duì)醫(yī)務(wù)人員所采取的治療措施和臨床檢測項(xiàng)目

有決定取舍的權(quán)利。

3.36控制品

僅用于質(zhì)量控制目的而不是用于校準(zhǔn)分析的標(biāo)本或溶液。

3.37準(zhǔn)確度（accuracy）

是測量結(jié)果中系統(tǒng)誤差與隨機(jī)誤差的綜合，表示測量結(jié)果與真值的一致程度。

3.38正確度（trucness）

無窮多次重復(fù)測量所得量值的平均值與一個(gè)參考量值間的一致程度。

3.39精密度（precision）

是指在一定條件下進(jìn)行多次測定時(shí)，所得測定結(jié)果之間的符合程度，表示測量結(jié)果

中的隨機(jī)誤差大小的程度C

5

3.40特異性（specificity）

在出現(xiàn)干擾現(xiàn)象（影響量）時(shí)，試驗(yàn)或檢測程序能夠正確地識(shí)別或定量確定某一實(shí)

體物質(zhì)的能力。

4.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測分析前質(zhì)量保證

根據(jù)臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的條件確定合適的分子診斷項(xiàng)目和恰當(dāng)?shù)臉颖咎幚硎谴_保核

酸定性定量檢測準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。標(biāo)本在檢測前必須確保標(biāo)本的采集、運(yùn)輸和儲(chǔ)存符合要

求。標(biāo)本處置不當(dāng)可能引起核酸降解，導(dǎo)致定量檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。

4.1采樣前準(zhǔn)備

1）分子診斷項(xiàng)目的申請與完善

藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測采樣前需填寫規(guī)范的申請單，申請單應(yīng)包含足

夠的信息，以識(shí)別患者和有資格開具申請單的臨床醫(yī)生。臨床醫(yī)生應(yīng)根據(jù)臨床需求合理

選擇分子診斷項(xiàng)目C個(gè)體化用藥領(lǐng)域發(fā)展迅速，臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)加強(qiáng)與臨床醫(yī)師的溝通，

及時(shí)指導(dǎo)臨床醫(yī)師選擇有價(jià)值的診斷項(xiàng)目，幫助醫(yī)師合理解釋檢驗(yàn)結(jié)果；不斷接受正確

合理的臨床醫(yī)師的反饋意見，及時(shí)了解臨床對(duì)個(gè)體化用藥分子檢測的需求，優(yōu)化項(xiàng)目目

錄。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)其具體的工作流程，確定質(zhì)量監(jiān)測指標(biāo)，如患者診斷信息完整率、適

當(dāng)臨床判斷率等，并定期對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回顧性分析，定期對(duì)檢驗(yàn)申請進(jìn)行評(píng)審。

2）患者的正確識(shí)別及知情同意

患者的正確識(shí)別是確保獲得正確的臨床標(biāo)本的前提。收集標(biāo)本的容器上應(yīng)注明患者

的信息，通常應(yīng)包括姓名、送檢醫(yī)院及科室、住院號(hào)等。醫(yī)護(hù)人員在采樣前需首先核對(duì)

確定患者的身份，核實(shí)能標(biāo)示患者的信息。

標(biāo)本收集前應(yīng)向患者介紹個(gè)體化用藥基因檢測的意義，以得到患者的認(rèn)同，即知情

同意。采樣前需告知患者所檢測項(xiàng)目的目的、意義、基本過程、項(xiàng)目可能存在的不足如

檢測結(jié)果可能出現(xiàn)與臨床用藥實(shí)際不相符的情況、剩余核酸的去向（包括可能匿名用于

科研項(xiàng)目）及保存時(shí)間，保護(hù)受檢者的個(gè)人隱私（包括醫(yī)疔記錄和醫(yī)疔數(shù)據(jù)）。對(duì)實(shí)施

有創(chuàng)檢查的分子診斷項(xiàng)目如穿刺取活檢組織，應(yīng)清楚地告知患者及家屬檢查可能遇到的

風(fēng)險(xiǎn)和緊急情況下的緊急預(yù)案。知情同意書是醫(yī)方履行如實(shí)告知義務(wù)的證據(jù)，也是患者

行使選擇權(quán)的書面依據(jù)。

3）送檢單的填寫與項(xiàng)目的復(fù)核

標(biāo)本采集前需填寫送檢申請單，提供受檢者必需的信息。申請單需填寫的信息包括:

6

申請的檢測項(xiàng)目、標(biāo)本編號(hào)、受檢者姓名、性別、出生日期、民族、采樣日期及時(shí)間、

標(biāo)本來源（組織類型）、相關(guān)臨床資料（如身高、體重、疾病診斷、疾病分型分期、合

并疾病、用藥情況）、采樣單位及科室名稱、送檢醫(yī)師姓名等信息。臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有專

業(yè)人員根據(jù)信息采集表對(duì)檢測項(xiàng)目的合理性進(jìn)行審核，必要時(shí)可與送檢醫(yī)師討論。

4.2標(biāo)本采集

臨床分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)各種個(gè)體化用藥分子診斷臨床標(biāo)本的采集按檢測要求建

立SOP。標(biāo)本采集人員應(yīng)經(jīng)過系統(tǒng)的培訓(xùn)。采樣前應(yīng)對(duì)標(biāo)本采集容器進(jìn)行評(píng)價(jià)，確保容

器本身不會(huì)干擾測定過程，并保存評(píng)估記錄。用于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測

的標(biāo)本在采集時(shí)間上無特殊要求。靜脈血液采集之前應(yīng)按要求對(duì)預(yù)采血的部位徹底消

毒。腫瘤組織中DNA的分析利用常規(guī)診斷所用的標(biāo)本即可，但用于RNA分析的標(biāo)本需專

門采集，并準(zhǔn)備好液氮等速凍所需的材料及設(shè)備。標(biāo)本采集需要在密閉、一次性采樣系

統(tǒng)中完成，所用的材料如注射器、棉簽、拭子等應(yīng)為一次性使用，以防止污染「無論采

集哪種類型的標(biāo)本，采樣時(shí)都必須戴手套，以避免標(biāo)本中病原微生物感染和皮膚脫落細(xì)

胞對(duì)標(biāo)本的污染。

用于藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測的標(biāo)本類型有多種，包括全血標(biāo)本、組織

標(biāo)本（新鮮組織、冰凍組織、石蠟包埋組織、穿刺標(biāo)本）、口腔拭子、骨髓、胸腹水等。

樣本采樣原則見《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》。

1）全血和骨髓標(biāo)本

全血標(biāo)本采集到含有適當(dāng)抗凝劑或添加物的采樣管中，添加物根據(jù)被測量（DNA、

細(xì)胞內(nèi)RNA）、檢測項(xiàng)目和采樣體積而定。因肝素可抑制PCR,全血或骨髓標(biāo)本一般用

EDTA或枸椽酸鹽抗凝。采樣前需在采樣管或注射器上標(biāo)注標(biāo)本信息。全血標(biāo)本采集外

周靜脈血2?3mL并置于采血管中，將采血管輕輕顛倒混勻數(shù)次以確保充分抗凝，避免

溶血。如檢測目的是細(xì)胞內(nèi)RNA,建議用含RNA穩(wěn)定劑的采樣管，或采樣后盡快將全

血或骨髓加入到RNA穩(wěn)定溶液中。采集干血斑標(biāo)本時(shí)，可向無菌濾紙上滴加約5（）RL

全血，根據(jù)需要可連續(xù)在數(shù)個(gè)印圈上滴加標(biāo)本，于室溫自然干燥至少4小時(shí)。干血斑標(biāo)

本采集時(shí)不要堆疊血斑，不與其他界面接觸，待血斑充分干燥后應(yīng)放入無菌袋口，避免

血斑之間的相互污染，同時(shí)加入干燥劑和濕度指示卡，密封包裝后運(yùn)送。

2）組織標(biāo)本

當(dāng)待檢測的組織與血液或口腔脫落細(xì)胞基因型不一致時(shí)，或當(dāng)組織是待測核酸必須

7

的來源時(shí)（如檢測腫瘤組織中mRNA表達(dá)、融合基因、基因擴(kuò)增或缺失、甲基化水平、

微衛(wèi)星不穩(wěn)定等），需采集組織標(biāo)本進(jìn)行檢測。可用的組織標(biāo)本包括新鮮組織、活檢組

織、石蠟包埋組織和石蠟切片。

a）新鮮組織和活檢組織：采樣大小取決于組織類型。一般而言，無論是哪種組織類型,

在沒有大量脂肪細(xì)胞侵潤的情況下，10mg組織標(biāo)本可提取DNA或RNA10強(qiáng)。無

菌條件下取米粒大小手術(shù)或活檢組織（約25mg）；腫瘤組織要求未壞死腫瘤組織比

例＞70%。穿刺取實(shí)體腫瘤組織時(shí)，取得的細(xì)胞數(shù)與穿刺針的粗細(xì)有關(guān)，21G細(xì)針每

次獲得2100個(gè)細(xì)胞，19G細(xì)針每次獲得2150個(gè)細(xì)胞，支氣管活檢每次獲得2300個(gè)

細(xì)胞，CT介導(dǎo)的細(xì)針穿刺每次可獲得2500個(gè)細(xì)胞。通常檢測時(shí)標(biāo)本中腫瘤細(xì)胞的

數(shù)量需達(dá)到200?400個(gè)。在某些情況下，要求同時(shí)采集無病變的組織或外周血作為

對(duì)照（如微衛(wèi)星不穩(wěn)定性檢測）。組織塊取樣后的處理與保存見《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)

量保證指南》c

b）石蠟包埋組織：推薦用10%中性緩沖甲醛溶液固定組織標(biāo)本，避免使用含重金屬離

子的固定液如Bouin液等。甲醛介導(dǎo)的DNA損傷在固定3小時(shí)后明顯發(fā)生，且時(shí)間

越長，DNA損傷越嚴(yán)重。因此推薦較小的組織（如活檢組織標(biāo)本）固定6?12小時(shí),

較大的組織（如手術(shù)切除標(biāo)本）固定6?48小時(shí)。甲醛固定的石蠟包埋組織不適于

用作RNA檢測，但在沒有其他標(biāo)本可供選擇時(shí)，可考慮選擇沒有污染部分提取的

RNA用于檢測，待測RNA序列的長度最好vl30bp。組織標(biāo)本切片時(shí)應(yīng)特別注意避

免標(biāo)本間的交叉污染。

c）組織切片：用于DNA檢測時(shí)，手術(shù)標(biāo)本需提供10厚的石蠟切片4?8張，面積

為成人拇指蓋大??；活檢穿刺標(biāo)本提供10Rm厚切片8?10張。所有切片均為白片。

腫瘤組織切片應(yīng)在HE染色后，經(jīng)病理醫(yī)師顯微鏡下觀察，以判斷是否含有腫瘤細(xì)

胞及腫瘤細(xì)胞的數(shù)量是否足夠（一般要求＞50%）、壞死組織比例〈10%,并在對(duì)應(yīng)的

白片上畫出癌巢，對(duì)腫瘤細(xì)胞密集區(qū)域進(jìn)行標(biāo)注。DNA測序法要求腫瘤細(xì)胞至少占

組織細(xì)胞的50%。應(yīng)采取措施避免核酸交叉污染，制備不同患者病理切片標(biāo)本時(shí)，

需更換新刀片。

3）口腔脫落細(xì)胞

口腔脫落細(xì)胞可同時(shí)用于DNA和RNA分析。常用的是口腔拭子，患者清水漱口后,

將消毒醫(yī)用棉簽伸進(jìn)口腔，在口腔內(nèi)側(cè)臉頰粘膜處左右反復(fù)擦拭20次左右，取出棉簽,

8

將棉簽置于干凈濾紙上陰干，每位受檢者至少采集棉簽3根。棉簽立即放入干凈封口塑

料袋內(nèi)封閉并放入紙質(zhì)信封，信封上應(yīng)做好詳細(xì)標(biāo)記。濾紙應(yīng)經(jīng)過滅菌處理，以防細(xì)菌

生長抑制核酸前的活性。漱口標(biāo)本也可作為口腔脫落細(xì)胞的來源。用于RNA分析的口

腔脫落細(xì)胞必須保存在RNA穩(wěn)定劑中。

4.3標(biāo)本的運(yùn)輸與保存

分子檢測人員應(yīng)熟知標(biāo)本運(yùn)送與保存的條件要求。標(biāo)本一經(jīng)采集，應(yīng)盡快送到臨檢

實(shí)驗(yàn)室。臨檢實(shí)驗(yàn)室應(yīng)制定樣本運(yùn)輸與保存的SOP。在運(yùn)送工具的選擇、標(biāo)本的運(yùn)送和

保存環(huán)境等方面應(yīng)嚴(yán)格按規(guī)定執(zhí)行。

運(yùn)送過程中應(yīng)防止盛放標(biāo)本的容器破碎和標(biāo)本丟失，注意標(biāo)本的隔離、封裝、容器

的密閉。標(biāo)本應(yīng)標(biāo)明采集的日期和時(shí)間、運(yùn)送時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室接收時(shí)間、實(shí)驗(yàn)室接收時(shí)標(biāo)

木的溫度。運(yùn)送條件根據(jù)標(biāo)本類型和待測靶核酸的性質(zhì)而定。DNA分析應(yīng)在采集后8

小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，否則需低溫運(yùn)送「當(dāng)待測核酸為RNA時(shí)，能在10分鐘內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)

室的標(biāo)本可室溫運(yùn)送；如果運(yùn)送時(shí)間較長，則應(yīng)將標(biāo)本置于干冰中，4小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)

室；如果標(biāo)本中添加了RNA穩(wěn)定劑，則可室溫運(yùn)送或郵寄。標(biāo)本的長距離運(yùn)送應(yīng)符合

生物安全要求。標(biāo)本運(yùn)輸人員應(yīng)接受適用于標(biāo)本類型和遠(yuǎn)程運(yùn)輸?shù)陌踩桶b程序的培

訓(xùn)。

1）樣本運(yùn)輸中需注意的常規(guī)事項(xiàng)

a）放置血液標(biāo)本的采血管應(yīng)用石蠟?zāi)せ蛲该髂z帶封住管蓋，以防標(biāo)本運(yùn)送過程中采血

管管蓋脫離；標(biāo)本運(yùn)輸過程中選用輕質(zhì)且不易破碎的包裝物，并在包裝間隙用細(xì)碎

輕質(zhì)材料填充。

b）標(biāo)本運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程中要避免將標(biāo)本暴露于可能導(dǎo)致核酸降解的環(huán)境中。

c）選擇可靠的快遞公司，樣本寄出后應(yīng)盡快告知檢測實(shí)驗(yàn)室快遞單號(hào)及相關(guān)信息，以

便對(duì)樣本運(yùn)輸情況進(jìn)行查詢和跟蹤。樣本要求在盡量短的時(shí)間內(nèi)送達(dá)臨檢實(shí)驗(yàn)室。

d）組織或血液標(biāo)本的采集過程中可能引起部分基因的表達(dá)上調(diào)，定量分析基因表達(dá)時(shí)

需考慮到。

2）常見標(biāo)本運(yùn)輸和保存注意事項(xiàng)

見《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》。

4.4標(biāo)本的接收與保存

1）標(biāo)本的驗(yàn)收、接受與拒收：臨床分子診斷實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立嚴(yán)格的標(biāo)本驗(yàn)收制度和

9

不合格標(biāo)本拒收制度，并安排專人接收標(biāo)本。標(biāo)本驗(yàn)收的內(nèi)容包括：檢查申請單的項(xiàng)目

填寫是否符合要求、標(biāo)識(shí)是否清楚；申請單有無醫(yī)師簽字；申請單所填項(xiàng)目是否與標(biāo)本

所示一致；申請單姓名、科別、門診或住院號(hào)與標(biāo)本的標(biāo)簽是否一致；是否簽署了知情

同意書；核實(shí)標(biāo)本采集及送檢之間的時(shí)間間隔（要求采樣1周以內(nèi)）：檢查標(biāo)本的量和

外觀質(zhì)量，血液標(biāo)本的外觀質(zhì)量包括采血管是否密閉、有無溶血、管壁有無破損、標(biāo)本

是否有明顯的污染跡象（如開蓋），樣本接收時(shí)的大致溫度，樣本量是否符合要求。手

術(shù)切除組織標(biāo)本需做切片和HE染色，由有經(jīng)驗(yàn)的病理醫(yī)師評(píng)價(jià)腫瘤細(xì)胞的數(shù)量是否滿

足檢測需要。若送檢的為DNA樣本時(shí)，要求體積大于20uL,OD260/280為1.6?1.8

之間，濃度大于50ng/UL,瓊脂糖電泳后電泳條帶大于50kb。拒收無標(biāo)簽、標(biāo)簽不清

晰、采血管破裂、已開蓋、運(yùn)送時(shí)間超過1周的樣本。拒收標(biāo)本時(shí)應(yīng)及時(shí)與送檢單位聯(lián)

系，要求重新采樣或重新送樣。每個(gè)接受的合格標(biāo)本均應(yīng)分配一個(gè)唯一的標(biāo)識(shí)碼。樣本

簽收時(shí)實(shí)行送樣人和收樣人雙簽名制度.標(biāo)本接收后，如不能立即檢測，必須按要求進(jìn)

行適當(dāng)?shù)谋４妗?/p>

2）樣本的登記與錄入：樣本簽收后立即登記樣本基本信息，收樣日期和時(shí)間，并

盡快將標(biāo)本信息錄入實(shí)驗(yàn)室（或醫(yī)院）信息系統(tǒng)，后續(xù)的操作過程及樣本保存均用唯一

編號(hào)。

3）標(biāo)本預(yù)處理：部分送檢標(biāo)本到達(dá)實(shí)驗(yàn)室后需進(jìn)行預(yù)處理，如保存于濾紙上的血

液標(biāo)本需采用穿孔機(jī)將濾紙上的血斑取下裝入離心管中，用溶解液沖洗浸泡濾紙，搖床

上室溫孵育以除去濾紙上的血紅蛋白。為避免交叉污染，一個(gè)干血斑取材完畢后，穿孔

機(jī)需用70%的乙醇徹底清洗，PBS沖洗后，方可用于下一個(gè)干血斑的采集。甲醛固定石

蠟包埋組織在進(jìn)行核酸檢測前需進(jìn)行徹底的脫蠟，二甲苯是常用的高效脫蠟有機(jī)溶劑。

4）接收后標(biāo)本的保存見《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》。

5.藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測分析中質(zhì)量保證

藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測必須有嚴(yán)格的質(zhì)量控制措施，涉及基因擴(kuò)增的

檢測項(xiàng)目必須在通過技術(shù)審核的臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室完成。分析中質(zhì)量控制的內(nèi)容

包括：實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的要求；檢測程序的選擇、驗(yàn)證及確認(rèn)；儀器設(shè)備的使用、維護(hù)與校

準(zhǔn)；人員培訓(xùn)；樣本的準(zhǔn)備（如核酸純化等）；執(zhí)行檢測；確認(rèn)檢測結(jié)果的可靠性。實(shí)

驗(yàn)室應(yīng)制定室內(nèi)質(zhì)量控制操作程序（SOP）和參加室間質(zhì)評(píng)或?qū)嶒?yàn)室間比對(duì)。

5.1實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)要求

10

原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。作為藥物代謝商和藥物

作用靶點(diǎn)基因檢測核心技術(shù)之一的PCR,要保證結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性，首要措施就是

防“污染”。檢測實(shí)驗(yàn)室應(yīng)按《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室管理辦法》要求進(jìn)行設(shè)置,

并按要求嚴(yán)格控制空氣流向，避免PCR產(chǎn)物污染。

5.2檢測方法

藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測過程一般包括核酸提取和靶標(biāo)檢測兩階段。

5.2.1核酸提取方法

DNA提取用酚-氯仿提取法和鹽析法等均可。酚?氯仿法提取可能導(dǎo)致DNA樣品中

酚或氯仿殘留，從而抑制后續(xù)的PCR反應(yīng)。鹽析法提取可能存在蛋白質(zhì)及其他物質(zhì)的

殘余，DNA的純度和得率不高。DNA提取操作要求在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。DNA一般溶

解在pH為7.2的TE（Tris-EDTA）溶液中，可減少其降解。但如果DNA在提取后幾天

內(nèi)用于PCR,也可用雙蒸水進(jìn)行溶解.提取出的DNA要求OD260/2X0介于1.6~1木之

間，濃度大于50ng/^L。

DNA相對(duì)穩(wěn)定，在無DNA酶的情況下，常溫二純化的DNA在TE緩沖液中可放

置26周，2~8OC冰箱中可放置至少1年。為降低DNA酶的活性和確保DNA的完整性,

純化的DNA標(biāo)本的長期保存應(yīng)在Oy以下的環(huán)境中。建議將DNA原液保存于々（TC或

以下的環(huán)境中。DNA應(yīng)放置在帶蓋密封、疏水的塑料管中（帶橡膠墊片的塑料管更好,

可防蒸發(fā)）。聚丙烯容易吸附DNA,尤其是在高離子強(qiáng)度的時(shí)候，聚乙烯結(jié)合DNA的

能力更強(qiáng)。DNA最適于俁存在異質(zhì)同晶聚合物材料的塑料管或經(jīng)特殊處理的聚丙烯塑

料管中。

RNA的提取用異硫氨酸呱結(jié)合酚-氯仿提取法，要求提取后的RNAOD260/280介于

1.8?2.1之間，瓊脂糖電泳28S:18s22。因RNA很容易被降解，純化好的RNA最好沉淀在

無水乙醇中或更低溫度下保存。RNA需儲(chǔ)存在滅菌、疏水、并用焦碳酸二乙酯

（DEPC）滅活了RNA酶的塑料管中，操作過程需帶手套。盡量將RNA溶解于偏堿性（pH

7.1?7.5）溶液中。純化的RNA在首次凍融后3小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，但反復(fù)凍融可導(dǎo)致降解。

5.2.2藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測的檢測方法

用于靶標(biāo)檢測的方法包括PCR-直接測序法、PCR-焦磷酸測序法、熒光定量PCR法、

PCR-基因芯片法、PCR-電泳分析、PCR.高分辨率熔解曲線法、等位基因特異性PCR法、

PCR.限制性片段長度多態(tài)性方法、原位雜交（ISH）等多種方法，每種方法的原理和優(yōu)

11

缺點(diǎn)如下：

1）PCR-直接測序法

也稱PCR-Sanger測序，該方法基于雙脫氧核糖核酸（ddNTP）末端終止法，根據(jù)核

昔酸在某一固定點(diǎn)開始延伸，隨機(jī)在某一特定堿基處終止，由于摻入的每個(gè)堿基都進(jìn)行

了熒光標(biāo)記，因此產(chǎn)生了以A、T、C、G結(jié)束的四組相差一個(gè)堿基的不同長度的系列核

酸片段；通過毛細(xì)管電泳分離這些片段后讀取待測核酸的堿基序列。Sanger法測序是

DNA序列分析的經(jīng)典方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認(rèn)為是基因分

型的金標(biāo)準(zhǔn)。

PCR-Sanger測序法的操作過程主要包括PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物純化、測序反應(yīng)、測

序和結(jié)果分析四個(gè)主要步喉。分析時(shí)需要設(shè)置陰性對(duì)照和陽性質(zhì)控品。該方法屬于定性

檢測，優(yōu)點(diǎn)是測序長度較長，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)。主要不足：靈敏度不高，尤其是在

進(jìn)行腫瘤組織體細(xì)胞突變檢測時(shí)，當(dāng)姐織中靶標(biāo)基因突變比例低于20%時(shí)，可能出現(xiàn)假

陰性結(jié)果；對(duì)試劑和儀器有特殊要求，不易普及；操作復(fù)雜，成本相對(duì)較高，速度慢、

通量低。

2）PCR?焦磷酸測序法

本方法是由4種酶催化的同一反應(yīng)體系中的酶級(jí)聯(lián)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)需設(shè)計(jì)一條

生物素標(biāo)記的測序引物，當(dāng)引物與單鏈模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸

化酶、熒光素酶和三磷酸腺甘雙磷酸酶4種酶的協(xié)同作用下，將引物上每一個(gè)dNTP的

聚合與一次熒光信號(hào)的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光的釋放和強(qiáng)度，達(dá)到實(shí)時(shí)測定DNA

序列的目的。所需試劑包括樣本處理試劑、核酸擴(kuò)增試劑、單鏈模板制備試劑、焦磷酸

測序試劑和陽性質(zhì)控品五大類。所需儀器為PCR儀和焦磷酸測序儀。為避免假陽性和

假陰性結(jié)果，應(yīng)嚴(yán)格區(qū)分陽性質(zhì)控品和反應(yīng)試劑的使用，防止因試劑污染致假陽性發(fā)生。

該方法的主要優(yōu)點(diǎn)：檢測靈敏度較高，對(duì)體細(xì)胞突變和甲基化等可實(shí)現(xiàn)定量檢測；

分型準(zhǔn)確可靠，通量較高，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)靈活，可發(fā)現(xiàn)新的突變或遺傳變異。主要缺點(diǎn)：對(duì)

試劑和儀潛有特殊要求，不易普及；檢測靈敏度有限，對(duì)腫瘤組織中的低豐度體細(xì)胞突

變（＜3%）容易出現(xiàn)假陰性；測序長度僅10多個(gè)堿基，不能對(duì)長片段進(jìn)行分析。

3）實(shí)時(shí)熒光PCR法

根據(jù)檢測原理的不同，實(shí)時(shí)熒光PCR法可分為探針法和非探針法兩種，前者利用

與靶序列特異雜交的探針（Taqman和分子信標(biāo)）來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，后者利用熒

12

光染料或特殊設(shè)計(jì)的引物來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加。Taqman探針法同時(shí)綜合了5,端核酸

酶活性和熒光等技術(shù)，其在反應(yīng)過程使用4條真核甘酸鏈，其中兩條為等位基因特異性

探針，兩條為PCR引物。兩條探針可分別與突變型和野生型模板互補(bǔ)，其兩端分別應(yīng)

用含報(bào)告基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的染料進(jìn)行標(biāo)記，兩條探針的報(bào)告基團(tuán)熒光染料不一樣。在進(jìn)

行SNP檢測時(shí)，PCR擴(kuò)增的退火過程導(dǎo)致探針與模板雜交結(jié)合，當(dāng)引物延伸至探針處

時(shí)，DNA聚合酶的5,端外切酶活性將探針的5,端報(bào)告基團(tuán)從探針上切除，使之與淬滅

基團(tuán)分離，從而釋放出相對(duì)應(yīng)的熒光，而沒有配對(duì)的探針仍然保持完整而不會(huì)發(fā)熒光。

不同的等位基因探針由于標(biāo)記的熒光染料不同，因此所發(fā)熒光信號(hào)不同，可通過對(duì)熒光

信號(hào)的檢測判斷樣本的基因型。

實(shí)時(shí)熒光PCR法靈敏度高，分型準(zhǔn)確，操作簡便快捷，所用儀器容易普及，易于

推廣使用。但該方法通量不高，探針成本較高，單個(gè)位點(diǎn)的檢測成本與樣本量有關(guān)，樣

本量越小，成本越高.本方法主要適于對(duì)少量位點(diǎn)、大樣本進(jìn)行分型.目前CFDA已批

準(zhǔn)CYP2C9、VK0RC1等多種基因多態(tài)性檢測的PCR-熒光檢測試劑盒。

4)PCR-基因芯片法

該方法以特定的寡核甘酸片段作為探針，將其有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后

將樣品DNA通過PCR擴(kuò)增、熒光標(biāo)記等程序，按堿基配對(duì)原理與芯片雜交，再通過熒

光檢測系統(tǒng)對(duì)芯片上的熒光信號(hào)進(jìn)行檢測和分析，從而迅速獲得個(gè)體的基因型信息?；?/p>

因芯片分型法的操作過程包括PCR核酸擴(kuò)增、雜交、芯片掃描和結(jié)果分析。該方法用

于DNA基因分型時(shí)屬于定性檢測，靈敏度為50ng/^Lo基因芯片法分析時(shí)需設(shè)置陰性

對(duì)照和陽性質(zhì)控品。應(yīng)用基因芯片檢測試劑盒時(shí)應(yīng)確保試劑在開封前按要求保存、各組

分液體使用前振蕩混勻，雜交和洗片操作務(wù)必在避光條件下進(jìn)行，PCR反應(yīng)液和定位參

照需避光保存，芯片加樣時(shí)注意使液體鋪滿整個(gè)反應(yīng)區(qū)，但不能溢出、不能出現(xiàn)氣泡，

以防交叉污染。其主要優(yōu)點(diǎn)是可同時(shí)對(duì)多個(gè)待測SNP位點(diǎn)進(jìn)行檢測。我國CFDA已批

準(zhǔn)多種用丁藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因如"。〃2、CYP2C9.CY2c19、CYP2D6.

ADRI、ACE.VKORC/多態(tài)性檢測的基因芯片試劑盒。

5)PCR-電泳分析

該方法是指對(duì)待分析的目的基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并通過瓊脂糖凝膠電泳或毛

細(xì)管電泳分析，根據(jù)PCR產(chǎn)物的大小對(duì)基因多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。該方法屬于定

性檢測，且只能用于對(duì)已知的多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行檢測，不能識(shí)別未知多態(tài)性。瓊脂糖電泳

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法適用于對(duì)片段較長的插入缺失多態(tài)性進(jìn)行檢測，如ACE插入缺失多態(tài)性；毛細(xì)管電

泳法適于對(duì)較短的插入缺失多態(tài)性如UGTJA1^28多態(tài)性和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)進(jìn)

行檢測。PCR過程中需建立陽性質(zhì)控品和陰性質(zhì)控品，電泳分析時(shí)需同時(shí)用分子量標(biāo)記

物進(jìn)行片段大小的判斷。當(dāng)分子量標(biāo)記物反應(yīng)管無條帶或出現(xiàn)較弱的條帶時(shí)，可能的原

因包括點(diǎn)樣孔漏、熒光染料不夠或失效、電泳時(shí)間過長或電壓過大。該方法的優(yōu)點(diǎn)是成

本低，在普通實(shí)驗(yàn)室即可開展；缺點(diǎn)是只適合對(duì)DNA插入/缺失多態(tài)性或融合基因進(jìn)行

定性測定，不能用于SNP的檢測。

6)PCR.高分辨率熔解曲線(HRM)法

該方法通過對(duì)PCR反應(yīng)的熔解曲線分析進(jìn)行基因分型。PCR擴(kuò)增的熔解曲線取決

于其擴(kuò)增序列，序列中一個(gè)堿基的差異都可導(dǎo)致雙鏈DNA的解鏈溫度發(fā)生變化。HRM

法應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀監(jiān)測這種細(xì)微的溫度變化，確定所擴(kuò)增的目的片段中是否

存在突變，從而用于基因分型.HRM分析使用ICGreen等飽和熒光染料，該類染料在

飽和濃度時(shí)對(duì)PCR反應(yīng)無抑制作用，因此可以高濃度使用，從而全部結(jié)合DNA雙螺旋

結(jié)構(gòu)中的小溝。在雙鏈DNA的變性過程不存在熒光分子的重排，其特異度得到大幅提

升，因此，熔解曲線細(xì)微的變化可以反映擴(kuò)增片段中堿基的差異。應(yīng)用本方法進(jìn)行基因

分型屬于定性分析。

該方法操作簡便、快速、通量大、使用成本低、結(jié)果準(zhǔn)確，有利于實(shí)現(xiàn)閉管操作，

在進(jìn)行甲基化檢測時(shí)可根據(jù)熔解曲線確定甲基化程度的高低。該方法的缺點(diǎn)是：不能排

除待測核酸中新出現(xiàn)的遺傳變異；由于單個(gè)堿基突變導(dǎo)致DNA解鏈溫度的變化非常小,

該方法對(duì)儀器的靈敏度和分辨率有較高要求。

7)等位基因特異性PCR(Allele-specificPCR,AS-PCR)

又稱為擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR(AmplificationRefractoryMutationSystemPCR,

ARMS-PCR)o該技術(shù)的基本原理：由于TaqDNA聚合酶缺乏3,到5,端的外切酶活性，

3,端錯(cuò)配的堿基會(huì)導(dǎo)致引物延伸速度變慢，當(dāng)錯(cuò)配達(dá)到定程度時(shí)，引物延伸將終止，

得不到特異長度的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，從而提示模板DNA沒有與引物3,端配對(duì)的堿基，反

之則有。因此，AS-PCR反應(yīng)需要兩條等位基因特異的引物和一條共用的反向引物，兩

條非特異性引物在3,端與模板錯(cuò)配，但其他部分堿基序列完全一樣。只有引物的3,端與

模板完全配對(duì)時(shí)，PCR擴(kuò)增才可以進(jìn)行。PCR產(chǎn)物可通過凝膠電泳進(jìn)行分析和基因型的

判斷。該方法也可與實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合起來進(jìn)行基因分型。該方法可以用于檢測

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各種類型的SNP,其優(yōu)勢是靈敏度高，特別適合于對(duì)腫瘤組織中的體細(xì)胞突變進(jìn)行檢測;

缺點(diǎn)是假陽性率較高。

8）PCR-限制性片段長度多態(tài)性方法

限制性片段長度多態(tài)性方法（RFLP）是一種基于酶切原理的方法，是最早用于基

因分型的經(jīng)典方法之一，現(xiàn)在仍被廣泛采用。該方法主要基于某些限制性內(nèi)切酶可以特

異性識(shí)別某一特定序列和結(jié)構(gòu)DNA,并對(duì)其進(jìn)行剪切的原理。限制性內(nèi)切酶通常識(shí)別

雙鏈DNA的某一特定序列，并在特定位置或者附近將雙鏈DNA切斷，從而產(chǎn)生較短

的DNA片段。由于限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的嚴(yán)格性，一個(gè)堿基的變化都可以導(dǎo)致酶切

活性的消失。利用這一特性，若待分型的SNP位點(diǎn)在某一限制性內(nèi)切酶的識(shí)別位點(diǎn)上,

將會(huì)導(dǎo)致該酶只對(duì)其中的一種等位基因具有酶切活性。因此，對(duì)位于限制性酶切識(shí)別位

點(diǎn)的SNP進(jìn)行分型時(shí)，可以使用包含該位點(diǎn)的PCR產(chǎn)物與相應(yīng)的限制性內(nèi)切防進(jìn)行溫

育.酶切以后的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，并根據(jù)酶切產(chǎn)物片段的大小來進(jìn)行基因分型.該方法不

需要任何探針，也不需要特別的儀器設(shè)備，成本較低，實(shí)驗(yàn)過程簡單，可操作性強(qiáng)。但

缺點(diǎn)也很明顯，主要是通量太低，大量分型時(shí)工作量大，并且只適用于部分SNP分型。

9）原位雜交（ISH）法

ISH法以各種人體標(biāo)本，包括相應(yīng)實(shí)驗(yàn)方法制備的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)標(biāo)本（福爾馬林

固定石蠟包埋）作為靶標(biāo)，采用目的DNA探針與該靶標(biāo)進(jìn)行分子雜交，從而檢測相關(guān)

的靶基因異常。ISH技術(shù)按照探針標(biāo)記物的類型，可分為亮視野原位雜交和熒光原位雜

交（FISH）。ISH法檢測的靶標(biāo)具有完整的細(xì)胞核，無需進(jìn)行核酸的提取。其具體的方

法學(xué)原理見《原位雜交（ISH）指南》。在藥物代謝酶和靶點(diǎn)基因檢測中，ISH法主要用

于測定基因擴(kuò)增和基因缺失異常。

表1.各種藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測技術(shù)優(yōu)缺點(diǎn)及適用性比較

方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)適用性

AS-PCR靈敏度高，適于對(duì)通量低對(duì)小樣本、低突變比例的

腫瘤組織中突變體細(xì)胞突變進(jìn)行檢測。

比例較低的體細(xì)

胞突變進(jìn)行檢測。

實(shí)時(shí)熒光PCR通量較高，操作簡探針較昂貴對(duì)相同位點(diǎn)、大樣本標(biāo)本

15

單，儀器設(shè)備易普進(jìn)行檢測，可用于mRNA

及。表達(dá)檢測。

焦磷酸測序高通量，高靈敏需要特殊儀器設(shè)適合于較大樣本、突變比

度，可以檢測插入備。例高于5%的各種類型

/缺失突變和未知SNP檢測、甲基化位點(diǎn)的

突變。等位基因含確定。

量的比例可用于

室內(nèi)質(zhì)控。

HRM成本低，靈敏度需要特殊儀淵設(shè)適合有該類機(jī)潛的實(shí)驗(yàn)室

高，閉管操作，降備，條件摸索過程開展各種類型SNP分型研

低污染風(fēng)險(xiǎn)。較為困難究；可用于已知甲基化位

點(diǎn)的檢測.

Sanger法測序直接獲取序列，分通量低，不能檢測各種SNP的檢測，未知突

型的金標(biāo)準(zhǔn)，可發(fā)突變比例小于變的篩查以及驗(yàn)證其他分

現(xiàn)未知突變。20%的SNP。型的結(jié)果。

PCR-RFLP無需特殊的儀器通量低，只適用于適用于無條件夠買貴重儀

設(shè)備，成本較低，部分SNP分型器設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室開展小樣

實(shí)驗(yàn)過程簡單，可本的分型檢測。

操作性強(qiáng)。

基因芯片法通量高靈活度低，成本適用于具備芯片檢測能力

高，需要特殊的儀的實(shí)驗(yàn)室對(duì)已知固定位

器設(shè)備。點(diǎn)、大樣本標(biāo)本進(jìn)行檢測。

原位雜交在細(xì)胞核原位對(duì)成本高，通量低，適于對(duì)基因擴(kuò)增和缺失異

(ISH)基因的異常進(jìn)行時(shí)間較長。常進(jìn)行檢測。

檢測

5.2.3藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因檢測項(xiàng)目及類型

遺傳藥理學(xué)知識(shí)庫（PharmGKB）根據(jù)項(xiàng)目成熟程度將個(gè)體化用藥基因檢測項(xiàng)目分

為4級(jí)，并認(rèn)為其中1級(jí)項(xiàng)目（包括1A級(jí)和1B級(jí)）滿足臨床應(yīng)用的最高標(biāo)準(zhǔn)，而4

級(jí)項(xiàng)目適于臨床應(yīng)用的證據(jù)最少⑴。1A級(jí)項(xiàng)目為同時(shí)獲臨床遺傳藥理學(xué)實(shí)施聯(lián)盟

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（ClinicalPharmacogeneticsImplementationconsortium,CPIC）、認(rèn)可CPIC藥物基因組

學(xué)指南的醫(yī)學(xué)會(huì)、以及美國國家衛(wèi)生研究院藥物基因組學(xué)研究網(wǎng)絡(luò)（Pharmagenomics

ResearchNetwork,PGRN）認(rèn)同的項(xiàng)目，這類項(xiàng)目通常經(jīng)大規(guī)模隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)（RCT）

對(duì)項(xiàng)目的意義進(jìn)行了論證；1B級(jí)項(xiàng)目有確切的臨床證據(jù)提示相關(guān)性，且這種相關(guān)性被

具有一定樣本規(guī)模的研究所證實(shí)，但還需進(jìn)一步的臨床證據(jù)。根據(jù)檢測項(xiàng)目所涉及的基

因在影響藥物反應(yīng)中的作用機(jī)制和被測靶分子（DNA或RNA）的不同，個(gè)體化用藥分

子檢測項(xiàng)目包括藥物代謝酶與轉(zhuǎn)運(yùn)體基因遺傳多態(tài)性檢測、藥物作用靶點(diǎn)基因遺傳變異

檢測、其他基因變異檢測和藥物作用靶點(diǎn)基因mRNA表達(dá)檢測四種類型（附錄C）。

5?3儀器設(shè)備的使用、維護(hù)與保養(yǎng)

原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。藥物代謝酶和藥物作用

靶點(diǎn)基因檢測涉及的儀器設(shè)備眾多，實(shí)驗(yàn)室可參考生產(chǎn)商提供的操作說明書編寫書面

的、有案可查的預(yù)防性維護(hù)及校準(zhǔn)計(jì)劃,確定儀器設(shè)備的維護(hù)周期，建立儀器設(shè)備口常

維護(hù)的SOP。對(duì)于某些計(jì)量分析儀器，應(yīng)依照我國計(jì)量法規(guī)定，由計(jì)量檢定機(jī)構(gòu)定期進(jìn)

行校驗(yàn)，并保存好校驗(yàn)證書。加熱系統(tǒng)及冰箱等設(shè)備的維護(hù)包括對(duì)溫度進(jìn)行監(jiān)測。儀器

維護(hù)過程中要注意清潔劑的使用，尤其是儀器的光路系統(tǒng)。每臺(tái)儀器應(yīng)該配備專用的清

潔工具。在例行儀器的維護(hù)和保養(yǎng)后，應(yīng)填寫儀器維護(hù)保養(yǎng)記錄表。如維護(hù)中發(fā)現(xiàn)問題,

應(yīng)及時(shí)匯報(bào)并將出現(xiàn)的問題詳細(xì)記錄，最后由維護(hù)操作人員簽名。

5?4人員培訓(xùn)

原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。藥物代謝酶和藥物作用

靶點(diǎn)基因檢測通常要涉及試劑配制、核酸提取、儀器編程、結(jié)果分析和報(bào)告等步驟。操

作人員需要有一定的專業(yè)技術(shù)知識(shí)和經(jīng)驗(yàn)才能獲得穩(wěn)定可靠的檢測結(jié)果。加強(qiáng)人員培訓(xùn)

是確保檢測質(zhì)量的關(guān)鍵。人員培訓(xùn)分為入職培訓(xùn)、內(nèi)部培訓(xùn)和外部培訓(xùn)。通過培訓(xùn)，讓

操作人員掌握和建立安全操作的概念、“防污染”的概念、具備獨(dú)立進(jìn)行質(zhì)控活動(dòng)和儀

器維護(hù)的能力，可對(duì)試劑和質(zhì)控品的出入庫及使用情況、設(shè)備保養(yǎng)等情況進(jìn)行準(zhǔn)確記錄,

進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。實(shí)驗(yàn)室工作人員在培訓(xùn)后書面確認(rèn)其己接受適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)，閱讀并理解了

相關(guān)SOP。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員進(jìn)行處事能力考核和周期性能力再考核，定期開

展內(nèi)部培訓(xùn)。外部培訓(xùn)包括國家衛(wèi)生計(jì)生委臨床檢驗(yàn)中心和國家衛(wèi)生計(jì)生委個(gè)體化醫(yī)學(xué)

檢測培訓(xùn)基地等機(jī)構(gòu)組織開展的各種技術(shù)培訓(xùn)。

5.5檢測體系的性能驗(yàn)證

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原則上按照《個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測質(zhì)量保證指南》的要求進(jìn)行。臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的

體外診斷試劑包括國家藥品食品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準(zhǔn)的試劑盒和國家衛(wèi)生計(jì)生

委個(gè)體化醫(yī)學(xué)檢測試點(diǎn)單位通過性能評(píng)定、具有嚴(yán)格標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP）的自配試劑

（LDT）o所有試劑都需進(jìn)行性能評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)室所購買的商業(yè)化的儀器應(yīng)根據(jù)說明書進(jìn)

行驗(yàn)證。在報(bào)告結(jié)果之前實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該證明其性能能夠滿足廠家規(guī)定的準(zhǔn)確度、精密度、

線性與可報(bào)告范圍和參考區(qū)間。實(shí)驗(yàn)室還應(yīng)該為每個(gè)檢測系統(tǒng)建立性能規(guī)范，包括適用

性、準(zhǔn)確度、精密度和分析特異性（包括干擾物質(zhì)）、可報(bào)告范圍和其他重要特性，并

根據(jù)性能規(guī)范確定系統(tǒng)的校準(zhǔn)和質(zhì)控程序，保持性能特征建立、校準(zhǔn)和質(zhì)控程序相關(guān)活

動(dòng)的記錄。同時(shí)也需對(duì)檢驗(yàn)中的耗材進(jìn)行質(zhì)檢。

個(gè)體化醫(yī)學(xué)分子檢測包括定性檢測和定量檢測。定性檢測的性能驗(yàn)證指標(biāo)主要包括

重復(fù)性/精密度、準(zhǔn)確度（突變型的檢測能力）、分析特異性、檢出限等，可參考美國臨

床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CISI）的F.PI2—A2文件進(jìn)行「定量檢測監(jiān)測體系性能驗(yàn)證的指

標(biāo)主要包括準(zhǔn)確度、精密度、線性、可報(bào)告范圍、檢出限、參考區(qū)間、靈敏度、特異性

等。

準(zhǔn)確度的評(píng)價(jià)有兩種方法，一種方法是與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行比較，使用待評(píng)估的項(xiàng)目對(duì)

已知標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（如定性檢測中用到的陽性參照品）進(jìn)行分析，將檢測結(jié)果與已知

標(biāo)準(zhǔn)值進(jìn)行比較；第二種方法是同時(shí)用待評(píng)估項(xiàng)目與標(biāo)準(zhǔn)方法（或參考方法）對(duì)同一批

次樣品進(jìn)行分析，然后將不同方法得到的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析。精密度是指重復(fù)檢測條件

下，獲得的獨(dú)立測量結(jié)果間的一致程度，是對(duì)檢測體系隨機(jī)誤差的一種度量，常用標(biāo)準(zhǔn)

差表示，標(biāo)準(zhǔn)差越小精密度越好。定性檢測的精密度還包括一份陽性或陰性樣本在多次

檢測中，是否能得到可重復(fù)的陽性或陰性結(jié)果。藥物代謝酶和藥物作用靶點(diǎn)基因變異檢

測體系進(jìn)行準(zhǔn)確度、精密度等性能驗(yàn)證時(shí)所使用的參考物質(zhì)為各種突變型和野生型質(zhì)粒

或突變細(xì)胞株。

線性分析可直接分析己知濃度的樣品，也可將一定濃度的樣品進(jìn)行系列稀秤后，根

據(jù)稀釋因子來研究檢測值與逐步下降的預(yù)期估計(jì)濃度之間是否存在線性?？蓤?bào)告范圍是

能夠報(bào)告的可靠的最低和最高檢測結(jié)果，實(shí)驗(yàn)室可通過“多點(diǎn)法”進(jìn)行簡單驗(yàn)證，推薦

應(yīng)用5個(gè)不同濃度水平的樣品進(jìn)行驗(yàn)證。

LoD是指可被檢測體系檢出的最低檢測濃度，又稱最小檢測濃度或檢測底限。建立

和驗(yàn)證LoD時(shí)，需同時(shí)建立、驗(yàn)證空白檢測限。檢出限一般由廠家、方法建立者完成，

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實(shí)驗(yàn)室LDT試劑應(yīng)確立方法的LoD。

臨界值是鑒別樣品、作為判斷特定疾病、狀態(tài)或被測量物存在與否的界限的量值。

測量結(jié)果高于臨界值判斷為陽性，低于臨界值判斷為陰性，接近臨界值判斷為非確定性。

臨界值的選擇決定檢驗(yàn)的診斷特異性和診斷靈敏度。目前已有部分臨床治療指南將藥物

靶點(diǎn)基因的mRNA表達(dá)水平高低（如m