CUBIC組織透明化技術(shù)：解鎖神經(jīng)元成像的新視角一、引言1.1研究背景與意義神經(jīng)元作為神經(jīng)系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)和功能單位，其結(jié)構(gòu)與功能的研究對(duì)于理解大腦的奧秘、揭示神經(jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)有效的治療方法具有至關(guān)重要的意義。大腦由數(shù)以?xún)|計(jì)的神經(jīng)元組成，這些神經(jīng)元通過(guò)復(fù)雜的連接形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，執(zhí)行著感知、運(yùn)動(dòng)、學(xué)習(xí)、記憶、情感等各種高級(jí)神經(jīng)功能。然而，由于大腦結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和神經(jīng)元分布的密集性，傳統(tǒng)的成像技術(shù)在觀察神經(jīng)元的整體結(jié)構(gòu)和連接方式時(shí)面臨諸多挑戰(zhàn)。在神經(jīng)科學(xué)研究中，神經(jīng)元成像技術(shù)是探索神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)鍵手段。傳統(tǒng)的成像方法，如光學(xué)顯微鏡，雖然能夠?qū)M織切片進(jìn)行高分辨率成像，但對(duì)于完整的大腦組織，由于其不透明性和光線散射問(wèn)題，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)深層神經(jīng)元的清晰觀察。電子顯微鏡雖然具有更高的分辨率，但樣本制備過(guò)程復(fù)雜，且成像范圍有限，無(wú)法滿足對(duì)大規(guī)模神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)的研究需求。這些技術(shù)的局限性限制了我們對(duì)神經(jīng)元整體結(jié)構(gòu)和功能的深入理解，迫切需要一種能夠突破這些限制的新技術(shù)。組織透明化技術(shù)的出現(xiàn)為解決上述問(wèn)題提供了新的途徑。該技術(shù)通過(guò)對(duì)組織進(jìn)行處理，使組織變得透明，從而減少光線散射，實(shí)現(xiàn)對(duì)厚組織或完整器官的三維成像。通過(guò)組織透明化技術(shù)，研究者可以在不破壞組織完整性的前提下，對(duì)整個(gè)大腦或特定腦區(qū)的神經(jīng)元進(jìn)行全面、系統(tǒng)的觀察。這不僅有助于揭示神經(jīng)元之間的連接模式和神經(jīng)回路的構(gòu)建方式，還能夠?yàn)檠芯可窠?jīng)疾病的發(fā)病機(jī)制提供更直觀、更全面的信息。例如，在阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性疾病的研究中，組織透明化技術(shù)可以幫助我們觀察神經(jīng)元的形態(tài)變化、突觸丟失以及淀粉樣蛋白斑塊的分布情況，從而深入了解疾病的發(fā)展過(guò)程。CUBIC（Clear,UnobstructedBrain/BodyImagingCocktailsandComputationalanalysis）組織透明化技術(shù)作為一種新興的組織透明化方法，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)。該技術(shù)采用特殊的化學(xué)試劑和處理方法，能夠有效地去除組織中的脂質(zhì)，同時(shí)保留組織的結(jié)構(gòu)和熒光信號(hào)。與其他組織透明化技術(shù)相比，CUBIC技術(shù)具有操作簡(jiǎn)單、透明化速度快、組織兼容性好等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)多種組織和器官的高質(zhì)量透明化處理。在神經(jīng)元成像領(lǐng)域，CUBIC技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于大腦、脊髓等組織的研究，為揭示神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能提供了有力的工具。通過(guò)CUBIC技術(shù)，研究者可以對(duì)整個(gè)大腦的神經(jīng)元進(jìn)行三維成像，觀察神經(jīng)元的軸突和樹(shù)突的分布、神經(jīng)元之間的連接以及神經(jīng)回路的形成。這對(duì)于深入理解大腦的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制、開(kāi)發(fā)治療神經(jīng)疾病的新方法具有重要的推動(dòng)作用。綜上所述，本研究旨在探討CUBIC組織透明化技術(shù)在神經(jīng)元成像中的應(yīng)用，通過(guò)對(duì)該技術(shù)的原理、方法和應(yīng)用案例進(jìn)行深入分析，揭示其在神經(jīng)元成像領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)和潛力，為神經(jīng)科學(xué)研究提供新的思路和方法。1.2CUBIC組織透明化技術(shù)概述CUBIC組織透明化技術(shù)是一種基于化學(xué)處理的組織透明化方法，其基本原理是利用特殊的化學(xué)試劑對(duì)組織進(jìn)行處理，去除組織中的脂質(zhì)成分，同時(shí)保留組織的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子結(jié)構(gòu)，使組織變得透明。該技術(shù)主要通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)組織透明化：首先，將組織樣本浸泡在含有表面活性劑和有機(jī)溶劑的溶液中，表面活性劑能夠破壞脂質(zhì)分子之間的相互作用，有機(jī)溶劑則有助于溶解脂質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)組織中脂質(zhì)的有效去除；然后，將脫脂后的組織浸泡在折射率匹配介質(zhì)中，使組織的折射率與周?chē)橘|(zhì)的折射率相匹配，減少光線散射，提高組織的透明度。通過(guò)這一系列處理，CUBIC技術(shù)能夠使組織變得透明，為后續(xù)的成像分析提供良好的條件。CUBIC技術(shù)的發(fā)展歷程可以追溯到2011年，由日本RIKEN發(fā)育生物學(xué)中心的Susaki等研究人員首次提出。他們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，通過(guò)使用特定的化學(xué)試劑組合，能夠有效地使小鼠的大腦和身體組織透明化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)組織內(nèi)部結(jié)構(gòu)的三維成像。這一開(kāi)創(chuàng)性的研究成果為組織透明化技術(shù)的發(fā)展開(kāi)辟了新的道路。此后，CUBIC技術(shù)不斷得到改進(jìn)和完善，研究人員對(duì)試劑配方、處理流程等方面進(jìn)行了優(yōu)化，使其在不同組織類(lèi)型和實(shí)驗(yàn)需求下都能表現(xiàn)出良好的透明化效果。隨著技術(shù)的發(fā)展，CUBIC技術(shù)逐漸應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域的研究，如神經(jīng)科學(xué)、腫瘤學(xué)、發(fā)育生物學(xué)等，為這些領(lǐng)域的研究提供了新的技術(shù)手段。CUBIC組織透明化技術(shù)具有諸多顯著特點(diǎn)，使其在組織透明化領(lǐng)域脫穎而出。在兼容性方面，CUBIC技術(shù)具有廣泛的組織兼容性，能夠適用于多種組織和器官，包括大腦、脊髓、心臟、肝臟、腎臟等。無(wú)論是軟組織還是硬組織，CUBIC技術(shù)都能實(shí)現(xiàn)有效的透明化處理，為不同組織類(lèi)型的研究提供了可能。在操作方面，CUBIC技術(shù)操作相對(duì)簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的設(shè)備和技術(shù)。其處理流程相對(duì)常規(guī)實(shí)驗(yàn)室操作較為便捷，研究人員易于掌握，這使得該技術(shù)能夠在更多實(shí)驗(yàn)室中推廣應(yīng)用。在成像效果上，CUBIC技術(shù)能夠較好地保留組織的熒光信號(hào)，這對(duì)于熒光標(biāo)記的神經(jīng)元成像尤為重要。通過(guò)保留熒光信號(hào)，研究人員可以更清晰地觀察神經(jīng)元的形態(tài)、分布和連接情況，為神經(jīng)元成像提供了高質(zhì)量的圖像數(shù)據(jù)。此外，CUBIC技術(shù)還具有處理時(shí)間相對(duì)較短的優(yōu)勢(shì)，能夠在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)組織的透明化，提高實(shí)驗(yàn)效率，滿足科研工作對(duì)時(shí)間的要求。與其他組織透明化技術(shù)相比，CUBIC技術(shù)的創(chuàng)新性體現(xiàn)在其獨(dú)特的化學(xué)試劑配方和處理方法上。傳統(tǒng)的組織透明化技術(shù)，如基于有機(jī)溶劑的透明化方法，雖然能夠?qū)崿F(xiàn)組織透明化，但往往會(huì)導(dǎo)致組織收縮、變形，熒光信號(hào)淬滅等問(wèn)題。而基于水凝膠包埋的透明化方法，雖然能較好地保留組織的結(jié)構(gòu)和熒光信號(hào)，但操作復(fù)雜，需要特殊的設(shè)備和技術(shù)。CUBIC技術(shù)通過(guò)使用表面活性劑和有機(jī)溶劑的組合，既能夠有效去除脂質(zhì)，又能在一定程度上避免組織的收縮和變形，同時(shí)較好地保留熒光信號(hào)。此外，CUBIC技術(shù)不需要特殊的設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，成本較低，這些優(yōu)勢(shì)使得CUBIC技術(shù)在組織透明化領(lǐng)域具有較高的應(yīng)用價(jià)值和創(chuàng)新性。在神經(jīng)科學(xué)研究中，CUBIC技術(shù)為神經(jīng)元成像提供了更優(yōu)質(zhì)的解決方案，能夠幫助研究人員更深入地了解神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能，推動(dòng)神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展。1.3研究目的與內(nèi)容本研究旨在深入探討CUBIC組織透明化技術(shù)在神經(jīng)元成像中的應(yīng)用，通過(guò)系統(tǒng)研究該技術(shù)在神經(jīng)元成像方面的原理、方法、優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用效果，為神經(jīng)科學(xué)研究提供更有效的技術(shù)手段和理論支持，推動(dòng)神經(jīng)元成像技術(shù)的發(fā)展，進(jìn)一步加深對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的理解。具體研究?jī)?nèi)容如下：一是對(duì)CUBIC組織透明化技術(shù)的原理進(jìn)行深入剖析，詳細(xì)闡述該技術(shù)去除組織脂質(zhì)、實(shí)現(xiàn)折射率匹配的具體機(jī)制，分析其對(duì)組織中生物大分子結(jié)構(gòu)和熒光信號(hào)的影響。探討表面活性劑和有機(jī)溶劑在脫脂過(guò)程中的作用方式，以及折射率匹配介質(zhì)如何減少光線散射，從而實(shí)現(xiàn)組織透明化，為后續(xù)理解該技術(shù)在神經(jīng)元成像中的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。二是全面評(píng)估CUBIC技術(shù)在神經(jīng)元成像中的關(guān)鍵性能指標(biāo)，包括透明化效果、熒光信號(hào)保留能力、組織形態(tài)保持情況等。通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比不同處理?xiàng)l件下的樣本，觀察CUBIC技術(shù)對(duì)大腦、脊髓等神經(jīng)組織的透明化程度，評(píng)估其在不同深度組織中成像的清晰度和分辨率，分析該技術(shù)對(duì)神經(jīng)元熒光標(biāo)記信號(hào)的保留效果，以及對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，明確該技術(shù)在神經(jīng)元成像中的優(yōu)勢(shì)與局限性。三是結(jié)合具體的神經(jīng)科學(xué)研究案例，如神經(jīng)發(fā)育、神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)損傷修復(fù)等，深入研究CUBIC技術(shù)在實(shí)際神經(jīng)元成像研究中的應(yīng)用。在神經(jīng)發(fā)育研究中，利用CUBIC技術(shù)觀察神經(jīng)元在胚胎發(fā)育過(guò)程中的遷移、分化和連接形成；在神經(jīng)退行性疾病研究中，通過(guò)CUBIC成像技術(shù)觀察神經(jīng)元的病變過(guò)程，如阿爾茨海默病中神經(jīng)元的丟失、淀粉樣蛋白斑塊的分布與神經(jīng)元的關(guān)系等；在神經(jīng)損傷修復(fù)研究中，借助CUBIC技術(shù)追蹤損傷后神經(jīng)元的再生和神經(jīng)回路的重建，揭示該技術(shù)在解決實(shí)際神經(jīng)科學(xué)問(wèn)題中的應(yīng)用價(jià)值和潛力。四是將CUBIC技術(shù)與其他神經(jīng)元成像技術(shù)，如傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡成像、電子顯微鏡成像、其他組織透明化技術(shù)結(jié)合的成像等進(jìn)行對(duì)比分析，從成像原理、分辨率、成像范圍、樣本制備難度、實(shí)驗(yàn)成本等多個(gè)維度進(jìn)行綜合比較。分析不同技術(shù)在觀察神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能方面的優(yōu)缺點(diǎn)，探討CUBIC技術(shù)與其他技術(shù)結(jié)合的可能性和優(yōu)勢(shì)，為神經(jīng)科學(xué)研究者在選擇合適的成像技術(shù)時(shí)提供參考依據(jù)，促進(jìn)多種成像技術(shù)在神經(jīng)元研究中的協(xié)同應(yīng)用。五是對(duì)CUBIC技術(shù)在神經(jīng)元成像應(yīng)用中的未來(lái)發(fā)展方向進(jìn)行展望，基于當(dāng)前技術(shù)的局限性和神經(jīng)科學(xué)研究的需求，探討CUBIC技術(shù)可能的改進(jìn)方向和創(chuàng)新應(yīng)用。例如，研發(fā)更高效、更溫和的透明化試劑，以進(jìn)一步提高透明化效果和減少對(duì)組織的損傷；探索CUBIC技術(shù)與新興成像技術(shù)，如光片顯微鏡、超分辨顯微鏡等的結(jié)合，拓展其在神經(jīng)元成像中的應(yīng)用范圍和分辨率；研究CUBIC技術(shù)在活體動(dòng)物神經(jīng)元成像中的應(yīng)用潛力，為實(shí)時(shí)觀察神經(jīng)元活動(dòng)提供新的方法。二、CUBIC組織透明化技術(shù)原理與方法2.1技術(shù)原理2.1.1光散射與吸收的影響機(jī)制在生物組織中，細(xì)胞內(nèi)的多種成分，如色素、脂類(lèi)和蛋白等，對(duì)光的散射和吸收有著復(fù)雜的影響機(jī)制，這些機(jī)制極大地阻礙了大樣本成像的實(shí)現(xiàn)。從色素方面來(lái)看，生物組織中存在多種色素，例如血紅蛋白、肌紅蛋白等。以血紅蛋白為例，其在血液豐富的組織中含量較高。血紅蛋白中的血紅素基團(tuán)含有鐵離子，具有特定的電子結(jié)構(gòu)，能夠吸收特定波長(zhǎng)的光。在可見(jiàn)光范圍內(nèi)，血紅蛋白對(duì)藍(lán)光和綠光有較強(qiáng)的吸收，這使得光線在穿透含有豐富血紅蛋白的組織時(shí)，這些波長(zhǎng)的光強(qiáng)度顯著減弱。這種吸收作用不僅改變了光線的光譜組成，還導(dǎo)致光能量的損耗，使得到達(dá)組織深處的光強(qiáng)度大幅降低，進(jìn)而影響成像的對(duì)比度和清晰度。脂類(lèi)在細(xì)胞中廣泛存在，主要以細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜以及脂質(zhì)小滴等形式存在。脂類(lèi)的存在會(huì)導(dǎo)致光散射現(xiàn)象的發(fā)生。細(xì)胞膜由磷脂雙分子層組成，磷脂分子的親水頭部和疏水尾部形成了一種非均勻的結(jié)構(gòu)。當(dāng)光線照射到細(xì)胞膜時(shí)，由于細(xì)胞膜與周?chē)?xì)胞質(zhì)的折射率存在差異，光線會(huì)在界面處發(fā)生折射和散射。此外，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)小滴也會(huì)對(duì)光產(chǎn)生散射作用。脂質(zhì)小滴的大小和形狀各不相同，且其折射率與周?chē)h(huán)境也不同，這使得光線在遇到脂質(zhì)小滴時(shí)會(huì)向各個(gè)方向散射，導(dǎo)致光線傳播方向的混亂，降低了成像的分辨率和信號(hào)強(qiáng)度。蛋白質(zhì)是細(xì)胞的重要組成部分，其結(jié)構(gòu)和分布也會(huì)對(duì)光的傳播產(chǎn)生影響。蛋白質(zhì)分子具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，不同的蛋白質(zhì)分子大小、形狀和氨基酸組成各異。蛋白質(zhì)分子的這些特性導(dǎo)致其折射率與周?chē)乃h(huán)境存在差異。當(dāng)光線穿過(guò)含有蛋白質(zhì)的區(qū)域時(shí)，會(huì)因?yàn)檎凵渎实淖兓l(fā)生散射。而且，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)并非均勻分布，而是存在于各種細(xì)胞器和細(xì)胞骨架中，這種非均勻分布進(jìn)一步加劇了光散射的復(fù)雜性。例如，在神經(jīng)元中，微管、微絲等細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)由蛋白質(zhì)組成，它們的存在使得神經(jīng)元內(nèi)部的光散射更加復(fù)雜，阻礙了對(duì)神經(jīng)元內(nèi)部結(jié)構(gòu)的清晰成像。在大樣本成像中，這些光散射和吸收的綜合作用使得光線難以深入組織內(nèi)部。隨著組織深度的增加，光線不斷被散射和吸收，信號(hào)強(qiáng)度呈指數(shù)衰減。這就導(dǎo)致傳統(tǒng)成像技術(shù)在觀察大樣本組織時(shí)，只能獲取組織表面或淺層的信息，而對(duì)于深層組織的結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)，無(wú)法獲得清晰的圖像。在對(duì)整個(gè)大腦進(jìn)行成像時(shí)，由于大腦組織的復(fù)雜性和厚度，細(xì)胞中的色素、脂類(lèi)和蛋白對(duì)光的散射和吸收使得常規(guī)光學(xué)顯微鏡難以觀察到大腦深層的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和神經(jīng)纖維連接，嚴(yán)重限制了對(duì)大腦神經(jīng)回路等重要結(jié)構(gòu)的研究。2.1.2CUBIC技術(shù)降低光散射和吸收的策略CUBIC技術(shù)通過(guò)一系列精心設(shè)計(jì)的策略來(lái)降低光散射和吸收，從而實(shí)現(xiàn)組織的透明化，為大樣本成像提供了可能，這些策略主要包括脫脂、褪色、脫鈣和折射率匹配等方面。脫脂是CUBIC技術(shù)的關(guān)鍵步驟之一。在生物組織中，脂質(zhì)是導(dǎo)致光散射的重要因素，如前文所述，細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜以及脂質(zhì)小滴等中的脂質(zhì)會(huì)使光線發(fā)生散射。CUBIC技術(shù)使用含有表面活性劑和有機(jī)溶劑的試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)脫脂。以常用的表面活性劑TritonX-100為例，它具有親水性的頭部和疏水性的尾部。在脫脂過(guò)程中，TritonX-100的疏水尾部能夠插入到脂質(zhì)分子之間，破壞脂質(zhì)分子之間的疏水相互作用，使脂質(zhì)分子從組織中游離出來(lái)。同時(shí)，與TritonX-100配合使用的有機(jī)溶劑，如醇胺類(lèi)物質(zhì)中的N-丁基二乙醇胺，能夠溶解這些游離的脂質(zhì)分子，從而將其從組織中去除。通過(guò)脫脂，減少了組織中因脂質(zhì)引起的光散射中心，使光線能夠更順利地穿透組織。褪色是CUBIC技術(shù)減少光吸收的重要手段。如血紅蛋白、肌紅蛋白等色素在生物組織中廣泛存在，這些色素對(duì)特定波長(zhǎng)的光有較強(qiáng)的吸收，影響了成像效果。CUBIC技術(shù)中的醇胺類(lèi)物質(zhì)，如1，3-雙二氨甲基環(huán)己烷，能夠與色素分子中的金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，從而破壞色素分子的結(jié)構(gòu)，使其失去吸收光的能力。以血紅蛋白為例，1，3-雙二氨甲基環(huán)己烷與血紅素中的鐵離子絡(luò)合，改變了血紅素的電子結(jié)構(gòu)，使其對(duì)光的吸收特性發(fā)生改變，減少了對(duì)光線的吸收，提高了組織的透光性。脫鈣主要針對(duì)含有鈣磷酸鹽的硬組織，如骨骼等。在硬組織中，鈣磷酸鹽的存在會(huì)導(dǎo)致光的散射和吸收，影響成像。CUBIC技術(shù)使用含有咪唑和EDTA的CUBIC-B試劑進(jìn)行脫鈣處理。EDTA具有很強(qiáng)的絡(luò)合金屬離子的能力，它能夠與鈣磷酸鹽中的鈣離子絡(luò)合，形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而將鈣離子從組織中去除。咪唑則可能在脫鈣過(guò)程中起到調(diào)節(jié)溶液酸堿度、促進(jìn)EDTA與鈣離子反應(yīng)的作用。通過(guò)脫鈣，降低了硬組織中因鈣磷酸鹽引起的光散射和吸收，為后續(xù)的透明化處理和成像創(chuàng)造了條件。折射率匹配是CUBIC技術(shù)實(shí)現(xiàn)組織透明化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。生物組織是由多種成分組成的非均質(zhì)體系，不同成分的折射率不同，這會(huì)導(dǎo)致光線在組織中傳播時(shí)發(fā)生折射和散射。CUBIC技術(shù)使用含有安替比林、煙酰胺或N-甲基煙酰胺等成分的CUBIC-R和CUBIC-RA試劑進(jìn)行折射率匹配。這些試劑的折射率與組織的主要成分（如蛋白質(zhì)、水等）的折射率相近。當(dāng)將組織浸泡在這些試劑中時(shí)，試劑會(huì)滲透到組織內(nèi)部，使組織的整體折射率趨于均勻，減少了光線在組織內(nèi)部因折射率差異而產(chǎn)生的散射。從而提高了組織的透明度，使得光線能夠更均勻地穿透組織，為高分辨率成像提供了保障。2.2試劑組成與作用CUBIC技術(shù)的試劑體系豐富，不同試劑在組織透明化過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵且獨(dú)特的作用，共同協(xié)作以實(shí)現(xiàn)對(duì)組織的有效透明化處理，滿足神經(jīng)元成像等研究的需求。CUBIC-P、CUBIC-L和CUBIC-HL這三種試劑在脫脂和脫色環(huán)節(jié)扮演著重要角色，它們的主要成分包括N-丁基二乙醇胺和1，3-雙二氨甲基環(huán)己烷。其中，N-丁基二乙醇胺作為一種有機(jī)溶劑，具有良好的脂質(zhì)溶解能力。在脫脂過(guò)程中，它能夠滲透到組織內(nèi)部，與脂質(zhì)分子相互作用，破壞脂質(zhì)分子之間的疏水相互作用，使脂質(zhì)從組織中游離出來(lái)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)組織中脂質(zhì)的去除，減少因脂質(zhì)引起的光散射。1，3-雙二氨甲基環(huán)己烷則在脫色過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它能夠與組織中的色素分子，如血紅蛋白、肌紅蛋白等中的金屬離子發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)。以血紅蛋白為例，1，3-雙二氨甲基環(huán)己烷與血紅素中的鐵離子絡(luò)合，改變了色素分子的結(jié)構(gòu)，使其吸收光的特性發(fā)生改變，從而失去對(duì)光的吸收能力，實(shí)現(xiàn)脫色，減少光吸收，提高組織的透光性。這三種試劑適用于多種組織類(lèi)型，在大多數(shù)組織的透明化處理中，CUBIC-L較為常用；而對(duì)于人體組織，CUBIC-HL則更具優(yōu)勢(shì)，能夠更好地實(shí)現(xiàn)脫脂和脫色效果，為后續(xù)的透明化處理奠定基礎(chǔ)。CUBIC-B試劑主要用于脫鈣，其主要成分是咪唑和EDTA。在含有鈣磷酸鹽的硬組織中，如骨骼等，鈣磷酸鹽的存在會(huì)導(dǎo)致光的散射和吸收，嚴(yán)重影響成像效果。EDTA具有很強(qiáng)的絡(luò)合金屬離子的能力，在脫鈣過(guò)程中，它能夠與鈣磷酸鹽中的鈣離子緊密絡(luò)合，形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，從而將鈣離子從組織中去除。咪唑則可能在脫鈣過(guò)程中起到調(diào)節(jié)溶液酸堿度的作用，為EDTA與鈣離子的反應(yīng)創(chuàng)造適宜的環(huán)境，促進(jìn)脫鈣反應(yīng)的順利進(jìn)行。通過(guò)CUBIC-B試劑的脫鈣處理，降低了硬組織中因鈣磷酸鹽引起的光散射和吸收，使得光線能夠更順利地穿透組織，為后續(xù)的透明化和成像創(chuàng)造條件，對(duì)于研究含有硬組織的神經(jīng)結(jié)構(gòu)，如脊椎中的神經(jīng)組織等，具有重要意義。CUBIC-R和CUBIC-RA試劑用于折射率匹配，主要成分包含安替比林、煙酰胺或N-甲基煙酰胺。生物組織是由多種成分組成的非均質(zhì)體系，不同成分的折射率不同，這會(huì)導(dǎo)致光線在組織中傳播時(shí)發(fā)生折射和散射，影響成像的清晰度和分辨率。安替比林、煙酰胺或N-甲基煙酰胺等成分的折射率與組織的主要成分，如蛋白質(zhì)、水等的折射率相近。當(dāng)將組織浸泡在含有這些成分的CUBIC-R或CUBIC-RA試劑中時(shí)，試劑會(huì)滲透到組織內(nèi)部，使組織的整體折射率趨于均勻，減少了光線在組織內(nèi)部因折射率差異而產(chǎn)生的散射。其中，CUBIC-RA對(duì)熒光信號(hào)的保護(hù)能力要強(qiáng)于CUBIC-R。在神經(jīng)元成像中，熒光標(biāo)記是常用的手段，CUBIC-RA能夠更好地保護(hù)熒光信號(hào)，使得在進(jìn)行折射率匹配的同時(shí)，最大限度地保留神經(jīng)元的熒光標(biāo)記信息，為清晰觀察神經(jīng)元的形態(tài)、分布和連接等提供了保障。2.3操作流程2.3.1樣本預(yù)處理樣本預(yù)處理是CUBIC組織透明化技術(shù)的首要環(huán)節(jié)，在整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中起著基礎(chǔ)性的關(guān)鍵作用，其主要包括樣本固定和清洗等步驟，每個(gè)步驟都有著明確的目的和特定的方法。樣本固定是預(yù)處理的關(guān)鍵步驟之一，其目的在于穩(wěn)定組織的結(jié)構(gòu)和生物分子，防止組織自溶和降解，確保在后續(xù)處理過(guò)程中組織的形態(tài)和成分能夠保持相對(duì)穩(wěn)定。常用的固定劑為多聚甲醛，它能與組織中的蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，形成穩(wěn)定的化學(xué)鍵，從而固定組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。以小鼠大腦組織為例，通常將新鮮獲取的小鼠大腦迅速浸泡在4%的多聚甲醛溶液中，在4℃條件下固定24-48小時(shí)。在此過(guò)程中，多聚甲醛分子會(huì)滲透到組織內(nèi)部，與蛋白質(zhì)分子中的氨基、羧基等基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)，形成交聯(lián)結(jié)構(gòu)，使蛋白質(zhì)分子之間相互連接，從而固定了細(xì)胞和組織的形態(tài)。這種固定方式不僅能夠防止組織在后續(xù)處理過(guò)程中的變形和降解，還能保留組織中的抗原表位，為后續(xù)的免疫熒光染色等實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。清洗步驟緊隨著固定步驟，其目的是去除組織表面和內(nèi)部殘留的固定劑以及其他雜質(zhì)，避免這些物質(zhì)對(duì)后續(xù)透明化處理和成像產(chǎn)生干擾。一般使用磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行清洗。具體操作是將固定后的組織從多聚甲醛溶液中取出，放入PBS溶液中，在室溫下振蕩清洗3-5次，每次清洗時(shí)間為15-30分鐘。PBS溶液具有與生物體內(nèi)環(huán)境相似的酸堿度和離子強(qiáng)度，能夠在清洗過(guò)程中維持組織的生理狀態(tài)，同時(shí)有效地溶解和去除殘留的固定劑、細(xì)胞碎片等雜質(zhì)。通過(guò)充分的清洗，能夠確保組織在進(jìn)入透明化處理步驟時(shí)，處于相對(duì)純凈的狀態(tài)，有利于透明化試劑更好地滲透到組織內(nèi)部，提高透明化效果。2.3.2透明化處理步驟透明化處理是CUBIC組織透明化技術(shù)的核心環(huán)節(jié)，通過(guò)使用不同的CUBIC試劑進(jìn)行浸泡處理，實(shí)現(xiàn)組織的脫脂、脫色、脫鈣（針對(duì)硬組織）以及折射率匹配，從而使組織達(dá)到透明狀態(tài)，為神經(jīng)元成像提供良好的條件。其處理過(guò)程有著嚴(yán)格的試劑使用順序、時(shí)間和條件要求。對(duì)于大多數(shù)組織，脫脂和脫色是透明化處理的第一步，通常使用CUBIC-L試劑。將清洗后的組織樣本完全浸沒(méi)在CUBIC-L試劑中，在37℃恒溫?fù)u床上以100-150轉(zhuǎn)/分鐘的速度振蕩處理。對(duì)于小鼠大腦組織，這一過(guò)程通常需要3-5天。CUBIC-L試劑中的N-丁基二乙醇胺能夠溶解組織中的脂質(zhì)，1，3-雙二氨甲基環(huán)己烷則可與色素分子中的金屬離子絡(luò)合，實(shí)現(xiàn)脫脂和脫色。在振蕩過(guò)程中，試劑能夠更均勻地滲透到組織內(nèi)部，提高處理效率。若樣本為含有鈣磷酸鹽的硬組織，如脊椎等，在脫脂和脫色后，需要使用CUBIC-B試劑進(jìn)行脫鈣處理。將經(jīng)過(guò)CUBIC-L處理的組織轉(zhuǎn)移至CUBIC-B試劑中，同樣在37℃恒溫?fù)u床上以100-150轉(zhuǎn)/分鐘的速度振蕩。脫鈣時(shí)間根據(jù)硬組織的類(lèi)型和大小有所不同，對(duì)于小型硬組織樣本，如小鼠的脊椎骨，一般需要5-7天；而對(duì)于較大的硬組織樣本，脫鈣時(shí)間可能會(huì)延長(zhǎng)至10天左右。CUBIC-B試劑中的EDTA與鈣磷酸鹽中的鈣離子絡(luò)合，咪唑調(diào)節(jié)溶液酸堿度，促進(jìn)脫鈣反應(yīng)進(jìn)行。完成脫脂、脫色和脫鈣（若有）后，進(jìn)行折射率匹配，這是實(shí)現(xiàn)組織透明化的關(guān)鍵步驟。使用CUBIC-R或CUBIC-RA試劑進(jìn)行折射率匹配。將處理后的組織浸泡在CUBIC-R或CUBIC-RA試劑中，在室溫下放置。如果使用CUBIC-R試劑，對(duì)于小鼠大腦組織，一般需要浸泡2-3天；若使用對(duì)熒光信號(hào)保護(hù)能力更強(qiáng)的CUBIC-RA試劑，浸泡時(shí)間可能稍長(zhǎng)，為3-5天。在浸泡過(guò)程中，試劑中的安替比林、煙酰胺或N-甲基煙酰胺等成分滲透到組織內(nèi)部，使組織的折射率與試劑的折射率相匹配，減少光線散射，提高組織的透明度。2.3.3折射率匹配與樣本保存折射率匹配是CUBIC組織透明化技術(shù)實(shí)現(xiàn)清晰成像的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而樣本保存則是確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果可長(zhǎng)期觀察和分析的重要步驟，二者在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中都有著重要的意義和特定的操作方法及注意事項(xiàng)。在完成前期的脫脂、脫色和脫鈣（針對(duì)硬組織）等透明化處理步驟后，進(jìn)行折射率匹配。生物組織是由多種成分組成的非均質(zhì)體系，不同成分的折射率存在差異，這會(huì)導(dǎo)致光線在組織中傳播時(shí)發(fā)生折射和散射，嚴(yán)重影響成像的清晰度和分辨率。CUBIC技術(shù)通過(guò)使用CUBIC-R和CUBIC-RA試劑來(lái)解決這一問(wèn)題。這些試劑的主要成分包含安替比林、煙酰胺或N-甲基煙酰胺，它們的折射率與組織的主要成分（如蛋白質(zhì)、水等）的折射率相近。在進(jìn)行折射率匹配時(shí)，將經(jīng)過(guò)前期處理的組織浸泡在CUBIC-R或CUBIC-RA試劑中，試劑會(huì)逐漸滲透到組織內(nèi)部。隨著試劑的滲透，組織內(nèi)不同成分的折射率逐漸趨于一致，從而減少了光線在組織內(nèi)部因折射率差異而產(chǎn)生的散射。例如，對(duì)于小鼠大腦組織，在浸泡過(guò)程中，試劑中的成分會(huì)與大腦組織中的蛋白質(zhì)、水分等相互作用，使整個(gè)大腦組織的折射率達(dá)到相對(duì)均勻的狀態(tài)，使得光線能夠更順利地穿透組織，為后續(xù)的成像提供清晰的背景。樣本保存對(duì)于長(zhǎng)期觀察和分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果至關(guān)重要。經(jīng)過(guò)透明化處理和折射率匹配后的樣本，需要妥善保存以保持其透明狀態(tài)和熒光信號(hào)。一般來(lái)說(shuō)，將樣本保存在含有CUBIC-R或CUBIC-RA試劑的密封容器中，放置在4℃的冰箱中冷藏保存。在保存過(guò)程中，要注意避免樣本受到光照和溫度波動(dòng)的影響。光照可能會(huì)導(dǎo)致樣本中的熒光信號(hào)淬滅，降低成像質(zhì)量；而溫度波動(dòng)則可能影響試劑的穩(wěn)定性和樣本的物理狀態(tài)，進(jìn)而影響樣本的透明效果和結(jié)構(gòu)完整性。此外，定期檢查樣本的狀態(tài)，確保試劑沒(méi)有揮發(fā)或變質(zhì)，若發(fā)現(xiàn)試劑減少或樣本出現(xiàn)異常，應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充試劑或采取相應(yīng)的處理措施。對(duì)于需要長(zhǎng)期保存的樣本，還可以考慮使用惰性氣體（如氮?dú)猓┨畛浔４嫒萜?，減少氧氣對(duì)樣本的影響，進(jìn)一步延長(zhǎng)樣本的保存時(shí)間和保持樣本的質(zhì)量。三、神經(jīng)元成像的常用方法與CUBIC技術(shù)的優(yōu)勢(shì)3.1神經(jīng)元成像的常用方法3.1.1傳統(tǒng)成像方法介紹電鏡成像技術(shù)是神經(jīng)元成像的重要傳統(tǒng)方法之一，其中透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）在神經(jīng)元研究中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。TEM的工作原理基于電子束透過(guò)樣本，利用樣本不同部位對(duì)電子的散射能力差異來(lái)成像。在神經(jīng)元成像中，Temu能夠提供極高的分辨率，可達(dá)到原子級(jí)別，這使得研究者能夠清晰地觀察到神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)，如突觸的精細(xì)結(jié)構(gòu)、線粒體的形態(tài)和分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器的細(xì)節(jié)。在研究神經(jīng)元的突觸傳遞機(jī)制時(shí)，Temu可以清晰地呈現(xiàn)突觸前膜、突觸間隙和突觸后膜的結(jié)構(gòu)，以及突觸小泡的形態(tài)和分布，幫助研究者深入了解神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和接收過(guò)程。然而，Temu也存在明顯的局限性。樣本制備過(guò)程極為復(fù)雜，需要對(duì)組織進(jìn)行超薄切片，切片厚度通常在幾十納米左右，這對(duì)操作技術(shù)要求極高，且容易在切片過(guò)程中對(duì)樣本造成損傷。成像范圍非常有限，每次只能觀察到極小的區(qū)域，難以對(duì)大規(guī)模的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整體研究。而且，Temu觀察的樣本必須處于高真空環(huán)境，這限制了對(duì)活體神經(jīng)元的觀察，無(wú)法實(shí)時(shí)獲取神經(jīng)元在生理狀態(tài)下的動(dòng)態(tài)信息。SEM則是通過(guò)電子束掃描樣本表面，收集樣本表面發(fā)射的二次電子來(lái)成像。在神經(jīng)元成像方面，SEM能夠提供神經(jīng)元表面的三維結(jié)構(gòu)信息，清晰地展示神經(jīng)元的形態(tài)、樹(shù)突和軸突的分支模式以及神經(jīng)元之間的連接方式。研究神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)育時(shí)，SEM可以直觀地呈現(xiàn)神經(jīng)元從幼稚狀態(tài)到成熟狀態(tài)的形態(tài)變化，包括樹(shù)突棘的形成和發(fā)展。但SEM同樣存在不足，其分辨率相對(duì)Temu較低，雖然能夠觀察到神經(jīng)元表面的宏觀結(jié)構(gòu)，但對(duì)于一些細(xì)微的超微結(jié)構(gòu)，如突觸的分子層面結(jié)構(gòu)，無(wú)法提供清晰的圖像。與Temu一樣，SEM的樣本制備也較為復(fù)雜，且對(duì)樣本的處理可能會(huì)改變其原本的結(jié)構(gòu)，影響觀察結(jié)果的真實(shí)性。傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡成像也是神經(jīng)元成像的常用手段。普通光學(xué)顯微鏡利用可見(jiàn)光照明，通過(guò)物鏡和目鏡的放大作用來(lái)觀察樣本。在神經(jīng)元研究中，它可以對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行初步的形態(tài)觀察，如觀察神經(jīng)元的細(xì)胞體大小、形狀，以及樹(shù)突和軸突的大致走向。在對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行染色后，能夠更清晰地分辨神經(jīng)元的不同部分。然而，普通光學(xué)顯微鏡的分辨率受到光的衍射極限限制，一般約為200納米，難以分辨神經(jīng)元的細(xì)微結(jié)構(gòu)，如突觸的精細(xì)結(jié)構(gòu)和一些微小的細(xì)胞器。對(duì)于厚組織樣本，由于光線散射和吸收嚴(yán)重，成像質(zhì)量會(huì)大幅下降，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)深層神經(jīng)元的清晰觀察。熒光顯微鏡則是在普通光學(xué)顯微鏡的基礎(chǔ)上，利用熒光物質(zhì)在特定波長(zhǎng)光激發(fā)下發(fā)射熒光的特性來(lái)成像。在神經(jīng)元成像中，通過(guò)對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行熒光標(biāo)記，如使用熒光蛋白、熒光染料或免疫熒光標(biāo)記，可以特異性地標(biāo)記神經(jīng)元的特定結(jié)構(gòu)或分子，從而更清晰地觀察神經(jīng)元的形態(tài)和分布。利用綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記神經(jīng)元，可以在熒光顯微鏡下清晰地觀察到神經(jīng)元的全貌，包括細(xì)胞體、樹(shù)突和軸突。熒光顯微鏡在一定程度上提高了對(duì)神經(jīng)元的觀察能力，但對(duì)于深層組織中的神經(jīng)元成像，仍然受到光散射和吸收的限制，成像深度有限，且熒光信號(hào)在深度增加時(shí)會(huì)逐漸減弱，影響成像的清晰度和準(zhǔn)確性。3.1.2現(xiàn)代成像技術(shù)進(jìn)展多光子顯微鏡成像技術(shù)是現(xiàn)代神經(jīng)元成像的重要進(jìn)展之一，其原理基于多光子激發(fā)熒光效應(yīng)。在多光子顯微鏡中，使用高能量的超短脈沖激光作為激發(fā)光源，當(dāng)激光聚焦到樣本上時(shí)，在極短的時(shí)間和極小的空間范圍內(nèi)，多個(gè)低能量的光子可以同時(shí)被熒光分子吸收，使熒光分子躍遷到激發(fā)態(tài)，然后發(fā)射出熒光。這種成像方式具有諸多獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在成像深度方面，由于使用的激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)，通常為近紅外光，其在生物組織中的穿透能力較強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)深層組織中神經(jīng)元的成像，成像深度可達(dá)毫米級(jí)，相比傳統(tǒng)的單光子熒光顯微鏡有了顯著提升。多光子激發(fā)是一個(gè)非線性過(guò)程，只有在激發(fā)光焦點(diǎn)附近的有限區(qū)域才能達(dá)到產(chǎn)生熒光所需的激光照射功率密度，非焦點(diǎn)區(qū)域不會(huì)產(chǎn)生熒光，這大大減少了焦點(diǎn)外的光漂白和光毒性，非常適合對(duì)活體神經(jīng)元進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)觀察，能夠?qū)崟r(shí)記錄神經(jīng)元的活動(dòng)變化。多光子顯微鏡在神經(jīng)元成像中有著廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景。在神經(jīng)發(fā)育研究中，通過(guò)多光子顯微鏡可以實(shí)時(shí)觀察神經(jīng)元在胚胎發(fā)育過(guò)程中的遷移、分化和成熟過(guò)程，追蹤神經(jīng)元的起源和命運(yùn)。在研究神經(jīng)可塑性時(shí)，多光子顯微鏡能夠?qū)ι窠?jīng)元的樹(shù)突棘進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的觀察，記錄樹(shù)突棘在學(xué)習(xí)、記憶等過(guò)程中的形態(tài)變化，為理解神經(jīng)可塑性的機(jī)制提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。在神經(jīng)疾病研究中，多光子顯微鏡可以用于觀察神經(jīng)元在疾病狀態(tài)下的形態(tài)和功能變化，如在阿爾茨海默病模型中，觀察神經(jīng)元的損傷、淀粉樣蛋白斑塊的形成與神經(jīng)元的關(guān)系等。光片顯微鏡成像技術(shù)同樣在現(xiàn)代神經(jīng)元成像中占據(jù)重要地位，其采用正交光路設(shè)計(jì)，從樣品側(cè)面照射激發(fā)樣品熒光，成像物鏡與照明物鏡成90度正交，互相垂直。這種獨(dú)特的光路設(shè)計(jì)使得樣品受激發(fā)的層面即成像層面，不存在離焦信號(hào)，大大提高了圖像的信噪比。光片顯微鏡能夠?qū)Υ蟪叽绲臉颖具M(jìn)行快速成像，成像速度比傳統(tǒng)的共聚焦顯微鏡快數(shù)十到數(shù)百倍，且光毒性和光漂白作用較小，非常適合對(duì)整個(gè)大腦或大型腦組織切片進(jìn)行成像。在對(duì)小鼠全腦進(jìn)行神經(jīng)元成像時(shí)，光片顯微鏡可以在較短時(shí)間內(nèi)獲取全腦的三維圖像，展示神經(jīng)元在全腦范圍內(nèi)的分布和連接情況。在應(yīng)用方面，光片顯微鏡在神經(jīng)回路研究中發(fā)揮著重要作用。通過(guò)對(duì)透明化處理后的大腦組織進(jìn)行成像，光片顯微鏡可以清晰地展示神經(jīng)元之間的連接模式，繪制神經(jīng)回路圖譜，幫助研究者深入理解大腦的神經(jīng)信息傳遞機(jī)制。在研究神經(jīng)再生時(shí)，光片顯微鏡可以對(duì)損傷后的神經(jīng)組織進(jìn)行動(dòng)態(tài)成像，觀察神經(jīng)元的再生過(guò)程和神經(jīng)回路的重建情況，為神經(jīng)損傷修復(fù)的研究提供直觀的數(shù)據(jù)支持。3.2CUBIC技術(shù)相比其他成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)3.2.1與油性透明化方法對(duì)比在組織透明化技術(shù)領(lǐng)域，油性透明化方法如iDisco、uDisco等曾備受關(guān)注，它們具有一些獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但與CUBIC技術(shù)相比，也存在明顯的不足。iDisco技術(shù)在2014年由Tessier-Lavigne課題組開(kāi)發(fā)，該技術(shù)利用有機(jī)溶劑進(jìn)行組織透明化處理。在脫脂過(guò)程中，使用的有機(jī)溶劑能夠快速有效地去除組織中的脂質(zhì)，使得組織在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)較高程度的透明化，其透明化速度相對(duì)較快，對(duì)于一些對(duì)時(shí)間要求較高的實(shí)驗(yàn)具有一定優(yōu)勢(shì)。然而，iDisco技術(shù)使用的有機(jī)溶劑具有較強(qiáng)的刺激性和毒性，在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中需要特殊的防護(hù)設(shè)備，增加了實(shí)驗(yàn)操作的復(fù)雜性和危險(xiǎn)性。而且，這些有機(jī)溶劑會(huì)導(dǎo)致組織收縮，使組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，影響對(duì)組織真實(shí)結(jié)構(gòu)的觀察。例如，在對(duì)小鼠大腦組織進(jìn)行iDisco透明化處理后，大腦組織的體積會(huì)明顯縮小，神經(jīng)元之間的相對(duì)位置和連接關(guān)系可能會(huì)發(fā)生扭曲，從而影響對(duì)神經(jīng)回路的準(zhǔn)確分析。此外，iDisco技術(shù)對(duì)熒光信號(hào)的保護(hù)能力較差，在透明化過(guò)程中，熒光標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光信號(hào)容易淬滅，導(dǎo)致成像質(zhì)量下降，無(wú)法清晰地觀察神經(jīng)元的形態(tài)和分布。uDisco技術(shù)是在3Disco光透明技術(shù)基礎(chǔ)上于2016年改進(jìn)而來(lái)，它同樣采用有機(jī)溶劑進(jìn)行透明化。uDisco技術(shù)在一定程度上改善了組織透明化的效果，提高了透明化的質(zhì)量。但與CUBIC技術(shù)相比，uDisco技術(shù)仍然存在組織收縮和熒光淬滅的問(wèn)題。在對(duì)一些較大的組織樣本進(jìn)行透明化時(shí)，uDisco技術(shù)導(dǎo)致的組織收縮會(huì)使組織內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變得更加緊密，進(jìn)一步增加了觀察的難度。在對(duì)大鼠脊髓組織進(jìn)行uDisco透明化處理后，脊髓組織的形態(tài)發(fā)生明顯改變，原本清晰的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)變得模糊，熒光標(biāo)記的神經(jīng)纖維的信號(hào)也大幅減弱，這對(duì)于研究脊髓神經(jīng)的結(jié)構(gòu)和功能造成了很大的阻礙。相比之下，CUBIC技術(shù)展現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢(shì)。CUBIC技術(shù)采用水溶性試劑，生物相容性好，毒性較低，在實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中不需要特殊的防護(hù)設(shè)備，操作相對(duì)安全，減少了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的潛在危害。在處理過(guò)程中，CUBIC技術(shù)對(duì)組織的損傷較小，能夠較好地保持組織的形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性，為準(zhǔn)確觀察神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和連接提供了保障。CUBIC技術(shù)在熒光信號(hào)保護(hù)方面表現(xiàn)出色，能夠有效保留熒光標(biāo)記的神經(jīng)元的熒光信號(hào)，使得在成像過(guò)程中能夠清晰地觀察到神經(jīng)元的形態(tài)、分布和連接情況，為神經(jīng)元成像提供了高質(zhì)量的圖像數(shù)據(jù)。在對(duì)小鼠大腦進(jìn)行CUBIC技術(shù)透明化處理后，大腦組織的形態(tài)基本保持不變，神經(jīng)元的熒光信號(hào)清晰穩(wěn)定，研究人員可以通過(guò)成像清晰地分辨出不同類(lèi)型的神經(jīng)元及其連接方式，為神經(jīng)科學(xué)研究提供了更可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。3.2.2與基于水凝膠的透明化方法對(duì)比基于水凝膠的透明化方法，如CLARITY技術(shù)，在神經(jīng)科學(xué)研究中曾發(fā)揮重要作用，但與CUBIC技術(shù)相比，在多個(gè)方面存在差異。CLARITY技術(shù)由KarlDeisseroth課題組于2013年發(fā)明，該技術(shù)的原理是先用水凝膠將組織進(jìn)行固定，然后利用SDS電泳去除脂肪。在實(shí)際應(yīng)用中，CLARITY技術(shù)能夠較好地保留內(nèi)源性的熒光蛋白，并且組織基本不會(huì)膨脹，這使得在觀察神經(jīng)元結(jié)構(gòu)時(shí)，能夠保持神經(jīng)元的原有形態(tài)，減少因組織變形帶來(lái)的誤差。然而，CLARITY技術(shù)的操作流程極為復(fù)雜，需要先將組織浸泡在水凝膠溶液中，然后進(jìn)行聚合反應(yīng)，使水凝膠與組織結(jié)合。在脫脂過(guò)程中，需要進(jìn)行SDS電泳，這一過(guò)程需要專(zhuān)門(mén)的電泳設(shè)備，設(shè)備成本較高，且操作技術(shù)要求嚴(yán)格，需要專(zhuān)業(yè)的技術(shù)人員進(jìn)行操作，這限制了該技術(shù)在一些實(shí)驗(yàn)室中的推廣應(yīng)用。而且，CLARITY技術(shù)的處理時(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)于一些大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究，會(huì)耗費(fèi)大量的時(shí)間和人力成本。CUBIC技術(shù)則在操作簡(jiǎn)便性方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。CUBIC技術(shù)的操作流程相對(duì)簡(jiǎn)單，只需要將組織依次浸泡在不同的試劑中，不需要復(fù)雜的設(shè)備和技術(shù)。在對(duì)小鼠大腦進(jìn)行透明化處理時(shí)，研究人員只需將固定好的大腦樣本依次放入CUBIC-L、CUBIC-B（若需要脫鈣）、CUBIC-R或CUBIC-RA試劑中進(jìn)行浸泡處理，即可完成透明化過(guò)程，不需要進(jìn)行復(fù)雜的聚合反應(yīng)和電泳操作。這使得CUBIC技術(shù)更容易被廣大科研人員掌握和應(yīng)用，降低了實(shí)驗(yàn)操作的門(mén)檻。此外，CUBIC技術(shù)不需要特殊的設(shè)備，普通實(shí)驗(yàn)室中的搖床、培養(yǎng)箱等常規(guī)設(shè)備即可滿足實(shí)驗(yàn)需求，減少了設(shè)備投入成本。而且，CUBIC技術(shù)的處理時(shí)間相對(duì)較短，對(duì)于一些對(duì)時(shí)間要求較高的實(shí)驗(yàn)，能夠更快地獲得實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提高了實(shí)驗(yàn)效率。3.2.3與其他水性透明化方法對(duì)比在水性透明化方法中，Scale、SeeDB等技術(shù)各有特點(diǎn)，但CUBIC技術(shù)在透明效率、樣本適應(yīng)性等方面展現(xiàn)出獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。Scale法由KeiichiFukuda等人開(kāi)發(fā)，該方法使用以尿素為主要成分的試劑溶液，尿素可以使組織親水化，以達(dá)到減少光線散射的目的。在透明化速度方面，Scale法相對(duì)較快，能夠在一定時(shí)間內(nèi)使組織達(dá)到較高的透明度。然而，Scale法存在生物組織膨脹、脫落、破碎等現(xiàn)象。在對(duì)小鼠心臟組織進(jìn)行Scale透明化處理時(shí)，心臟組織會(huì)出現(xiàn)明顯的膨脹，導(dǎo)致心肌細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)變得松散，組織的完整性受到破壞，這對(duì)于研究心臟的精細(xì)結(jié)構(gòu)和功能造成了很大的困難。而且，Scale法對(duì)于一些結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的組織，透明效果并不理想，無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)組織內(nèi)部深層結(jié)構(gòu)的清晰觀察。SeeDB方法是一種以果糖溶液作為主要透明試劑的溫和透明方法，其過(guò)程是采用梯度濃度的果糖溶液逐漸清洗生物組織樣本，直至組織變得透明。SeeDB方法具有操作溫和的特點(diǎn)，對(duì)組織的損傷較小。但是，該方法存在明顯的局限性，高濃度果糖存在黏度大、滲透性差的問(wèn)題，導(dǎo)致透明能力有限。在對(duì)小鼠肝臟組織進(jìn)行SeeDB透明化處理時(shí)，由于果糖溶液的滲透性較差，難以深入組織內(nèi)部，使得肝臟組織的透明化程度較低，無(wú)法清晰地觀察到肝臟內(nèi)部的血管和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。CUBIC技術(shù)在透明效率和樣本適應(yīng)性方面表現(xiàn)出色。CUBIC技術(shù)通過(guò)使用含有特殊成分的試劑，能夠快速有效地使組織達(dá)到較好的透明程度。在對(duì)小鼠大腦組織進(jìn)行透明化處理時(shí)，CUBIC技術(shù)能夠在相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)大腦組織的高度透明，且對(duì)大腦組織的深層結(jié)構(gòu)也能實(shí)現(xiàn)清晰成像。CUBIC技術(shù)具有廣泛的樣本適應(yīng)性，能夠適用于多種組織和器官，包括大腦、脊髓、心臟、肝臟、腎臟等。無(wú)論是軟組織還是硬組織，CUBIC技術(shù)都能通過(guò)調(diào)整試劑和處理?xiàng)l件，實(shí)現(xiàn)有效的透明化處理，為不同組織類(lèi)型的神經(jīng)元成像研究提供了可能。四、CUBIC技術(shù)在神經(jīng)元成像中的應(yīng)用案例4.1構(gòu)建小鼠大腦圖譜日本RIKEN生物系統(tǒng)動(dòng)力學(xué)研究中心的系統(tǒng)生物學(xué)家HirokiR.Ueda團(tuán)隊(duì)在小鼠大腦圖譜構(gòu)建研究中，開(kāi)創(chuàng)性地運(yùn)用CUBIC-X方法，為神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域深入了解小鼠大腦的微觀結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元連接模式提供了重要的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和研究思路。在樣本處理階段，研究人員首先采用化學(xué)方法對(duì)小鼠大腦中的每個(gè)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，這一過(guò)程猶如為大腦中的每一個(gè)細(xì)胞貼上了獨(dú)特的“身份標(biāo)簽”，使得后續(xù)對(duì)細(xì)胞的追蹤和分析成為可能。接著，運(yùn)用CUBIC-X技術(shù)對(duì)大腦進(jìn)行透明化處理，該技術(shù)不僅能夠使大腦組織像玻璃一樣透明，還能將組織膨大為原始尺寸的10倍。在膨大處理過(guò)程中，組織中的細(xì)胞間距離增大，原本緊密排列的細(xì)胞結(jié)構(gòu)得以更清晰地展現(xiàn)，為后續(xù)的成像和分析提供了更有利的條件。通過(guò)CUBIC-X1試劑中的咪唑等成分的作用，實(shí)現(xiàn)了組織的膨大；再利用CUBIC-X2試劑中的咪唑和安替比林進(jìn)行折射率匹配，使組織達(dá)到高度透明的狀態(tài)，減少了光線散射，提高了成像的清晰度。在成像與分析階段，研究團(tuán)隊(duì)利用精密的成像技術(shù)對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行三維重建。通過(guò)高分辨率的顯微鏡成像，獲取了大量關(guān)于神經(jīng)元形態(tài)、位置和連接的信息。在三維重建過(guò)程中，借助先進(jìn)的圖像處理算法和計(jì)算機(jī)技術(shù)，將二維的顯微鏡圖像拼接成完整的三維模型，從而能夠直觀地展示神經(jīng)元在大腦中的分布和連接情況。據(jù)Ueda介紹，在這次研究中總計(jì)對(duì)約7200萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行了分析，構(gòu)建出的小鼠大腦圖譜將大腦縮小為一個(gè)簡(jiǎn)潔的細(xì)胞位置數(shù)據(jù)庫(kù)。研究人員可以根據(jù)這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)深入研究發(fā)育過(guò)程中不同大腦區(qū)域具體發(fā)生的變化，比如在大腦發(fā)育的不同階段，觀察神經(jīng)元的遷移路徑、分化過(guò)程以及它們之間連接的形成和重塑。未來(lái)，這個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)還有望推動(dòng)對(duì)特定大腦結(jié)構(gòu)，譬如控制睡眠-覺(jué)醒周期等行為的區(qū)域，進(jìn)行更深入的探索。該研究成果具有重要的意義和價(jià)值。從神經(jīng)科學(xué)研究的角度來(lái)看，這張高分辨率的小鼠大腦圖譜為研究大腦的發(fā)育、功能和疾病機(jī)制提供了寶貴的資源。在研究神經(jīng)發(fā)育疾病時(shí)，研究人員可以通過(guò)對(duì)比正常小鼠大腦圖譜和患病小鼠大腦圖譜，尋找神經(jīng)元發(fā)育異常的區(qū)域和連接模式的改變，從而深入了解疾病的發(fā)病機(jī)制。在藥物研發(fā)方面，該圖譜也為篩選和評(píng)估治療神經(jīng)疾病的藥物提供了重要的參考依據(jù)。通過(guò)模擬藥物對(duì)大腦神經(jīng)元的作用，觀察其在圖譜中的變化，有助于開(kāi)發(fā)出更有效的治療藥物。4.2研究神經(jīng)退行性疾病4.2.1阿爾茨海默病研究同濟(jì)大學(xué)劉健慧團(tuán)隊(duì)聯(lián)合上海交大周滟團(tuán)隊(duì)、復(fù)旦大學(xué)張琦團(tuán)隊(duì)在阿爾茨海默病研究中，創(chuàng)新性地運(yùn)用CUBIC全腦成像技術(shù)，深入探究了神經(jīng)干細(xì)胞源性外泌體（NSC-ex）對(duì)阿爾茨海默病中線粒體生發(fā)及分布的影響，為揭示阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制和治療靶點(diǎn)提供了新的視角。阿爾茨海默?。ˋD）是一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，也是最常見(jiàn)的癡呆形式，其主要特點(diǎn)是淀粉樣斑塊（Aβ）沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)以及整個(gè)大腦的嚴(yán)重神經(jīng)元和突觸損失，進(jìn)而導(dǎo)致患者認(rèn)知能力逐漸下降。目前，臨床上尚無(wú)有效的療法能夠預(yù)防或逆轉(zhuǎn)AD的進(jìn)展。AD的發(fā)病機(jī)制與線粒體中Aβ的積累和線粒體功能障礙密切相關(guān)。線粒體功能障礙會(huì)導(dǎo)致活性氧（ROS）水平增加，線粒體ATP產(chǎn)生減少，誘發(fā)能量不足，進(jìn)一步引發(fā)氧化損傷和突觸缺陷，最終導(dǎo)致神經(jīng)元損失。因此，針對(duì)有缺陷的線粒體成為治療AD的重要方向。在該項(xiàng)研究中，研究團(tuán)隊(duì)首先提取和鑒定了NSC-ex，并應(yīng)用Aβ25-35誘導(dǎo)小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞（HT22）損傷模型，進(jìn)行NSC-ex治療后，評(píng)估SIRT1和PGC-1α的蛋白水平和線粒體功能變化情況。研究發(fā)現(xiàn)，NSC-ex可以激活SIRT1，增強(qiáng)線粒體功能。Sirtuin1（SIRT1）是一種NAD依賴(lài)性去乙?；?，可調(diào)節(jié)對(duì)線粒體正常功能至關(guān)重要的蛋白質(zhì)，特別是過(guò)氧化物酶增殖體激活受體gamma輔助因子（PGC）-1α。為了進(jìn)一步探究NSC-ex對(duì)AD的潛在治療作用，研究團(tuán)隊(duì)使用了具有GFAP表達(dá)自發(fā)熒光標(biāo)記的APP/PS1小鼠和新構(gòu)建的一種神經(jīng)系統(tǒng)SIRT1基因特異性敲除的APP/PS1小鼠，通過(guò)立體定向方式將NSC-ex注入小鼠側(cè)腦室內(nèi)。應(yīng)用水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估NSC-ex對(duì)兩種模型小鼠認(rèn)知功能的改善作用，應(yīng)用ELISA試劑盒評(píng)估小鼠腦內(nèi)可溶性和不可溶性Aβ的水平變化。選取紋狀體、海馬、皮層和小腦4個(gè)腦區(qū)，應(yīng)用Westernblot法評(píng)估幾種線粒體生發(fā)相關(guān)重要蛋白PGC-1α，NRF1和COXIV的水平變化以及小鼠海馬和皮層SIRT1水平的變化。在關(guān)鍵的成像分析環(huán)節(jié)，研究團(tuán)隊(duì)運(yùn)用CUBIC全腦成像技術(shù)，對(duì)具有GFAP表達(dá)自發(fā)熒光標(biāo)記的APP/PS1小鼠和對(duì)照野生小鼠進(jìn)行研究，評(píng)估AD進(jìn)程中和NSC-ex治療后全腦水平線粒體生發(fā)相關(guān)蛋白PGC-1α，NRF1和COXIV的變化，以及治療前后GFAP自發(fā)熒光水平的變化。通過(guò)CUBIC全腦成像技術(shù)，研究團(tuán)隊(duì)得以在全腦水平上觀察線粒體生發(fā)相關(guān)蛋白的分布情況，發(fā)現(xiàn)NSC-ex能夠重塑線粒體生發(fā)相關(guān)重要蛋白PGC1α，NRF1和COXIV的無(wú)序空間腦區(qū)化分布，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，最終改善認(rèn)知功能。通過(guò)兩種AD小鼠模型的對(duì)比，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)SIRT1基因敲除AD小鼠行為表現(xiàn)更差，多腦區(qū)的線粒體生發(fā)相關(guān)因子水平更低，Aβ水平更高，證明SIRT1基因缺失會(huì)引起更嚴(yán)重的病理進(jìn)展和認(rèn)知障礙。在3種線粒體生發(fā)相關(guān)因子中，NSC-ex治療對(duì)于PGC1α的改善更為明顯，而NRF1和COXIV的恢復(fù)表現(xiàn)有一定相似性。然而，NSC-ex干預(yù)只對(duì)Aβ水平有輕微的積極作用?？傮w而言，這項(xiàng)研究借助CUBIC全腦成像技術(shù)，證實(shí)了小鼠NSC-ex可以激活SIRT1，增強(qiáng)線粒體功能，重塑線粒體生發(fā)相關(guān)重要蛋白的無(wú)序空間腦區(qū)化分布，減少星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，最終改善認(rèn)知功能。強(qiáng)調(diào)了NSC-ex治療對(duì)AD引起的線粒體生發(fā)相關(guān)蛋白腦區(qū)化異常分布的整體重塑，并提示線粒體功能促進(jìn)可能是NSC-ex發(fā)揮功能的一個(gè)重要靶點(diǎn)，在這其間SIRT1-PGC1α相關(guān)通路可能發(fā)揮了重要作用。這一研究成果不僅為深入理解阿爾茨海默病的發(fā)病機(jī)制提供了重要線索，也為開(kāi)發(fā)新的治療策略提供了潛在的靶點(diǎn)和理論依據(jù)，具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。4.2.2其他神經(jīng)退行性疾病應(yīng)用前景在帕金森病研究中，CUBIC技術(shù)有望發(fā)揮重要作用。帕金森病是一種常見(jiàn)的慢性神經(jīng)退行性疾病，主要影響運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)，患者常表現(xiàn)出靜止性震顫、肌肉僵硬、運(yùn)動(dòng)遲緩和平衡障礙等典型癥狀，同時(shí)還可能經(jīng)歷情緒波動(dòng)、睡眠障礙和認(rèn)知功能下降等非運(yùn)動(dòng)癥狀。其病理特征主要是中腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的進(jìn)行性退變，導(dǎo)致紋狀體多巴胺含量顯著減少。CUBIC技術(shù)可以對(duì)帕金森病模型動(dòng)物的大腦進(jìn)行透明化處理，使研究人員能夠清晰地觀察中腦黑質(zhì)區(qū)域多巴胺能神經(jīng)元的形態(tài)、數(shù)量和分布變化，以及這些神經(jīng)元與其他腦區(qū)之間的神經(jīng)連接情況。通過(guò)CUBIC成像，研究人員可以追蹤多巴胺能神經(jīng)元在疾病發(fā)展過(guò)程中的退變過(guò)程，分析其與周?chē)窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的相互作用，這對(duì)于深入理解帕金森病的發(fā)病機(jī)制具有重要意義。在尋找治療帕金森病的新靶點(diǎn)方面，CUBIC技術(shù)可以幫助研究人員觀察藥物或其他治療手段對(duì)多巴胺能神經(jīng)元及其神經(jīng)連接的影響，評(píng)估治療效果，為開(kāi)發(fā)更有效的治療方法提供依據(jù)。亨廷頓舞蹈病也是一種神經(jīng)退行性疾病，由亨廷頓基因（HTT）的突變引起，其特征是大腦紋狀體和大腦皮層的神經(jīng)元進(jìn)行性死亡，導(dǎo)致患者出現(xiàn)不自主運(yùn)動(dòng)、認(rèn)知障礙和精神癥狀等。CUBIC技術(shù)可以用于對(duì)亨廷頓舞蹈病模型動(dòng)物的大腦進(jìn)行三維成像，觀察紋狀體和大腦皮層中神經(jīng)元的病理變化，如神經(jīng)元的萎縮、死亡以及神經(jīng)纖維的斷裂等。通過(guò)CUBIC成像，研究人員可以分析突變的亨廷頓蛋白在神經(jīng)元內(nèi)的分布和聚集情況，以及其對(duì)神經(jīng)元功能和神經(jīng)回路的影響。這有助于深入了解亨廷頓舞蹈病的發(fā)病機(jī)制，為開(kāi)發(fā)針對(duì)該疾病的治療方法提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在研究亨廷頓舞蹈病的遺傳機(jī)制時(shí)，CUBIC技術(shù)還可以與基因編輯技術(shù)相結(jié)合，觀察基因編輯對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的影響，探索基因治療的可能性。在脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)等其他神經(jīng)退行性疾病的研究中，CUBIC技術(shù)同樣具有廣闊的應(yīng)用前景。脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)是一組以小腦性共濟(jì)失調(diào)為主要臨床表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳變性病，其病理特征是小腦、腦干和脊髓的神經(jīng)元萎縮和死亡。CUBIC技術(shù)可以對(duì)患者或模型動(dòng)物的小腦、腦干和脊髓進(jìn)行透明化處理，觀察這些區(qū)域神經(jīng)元的病變情況，分析神經(jīng)纖維的連接和傳導(dǎo)功能，為揭示疾病的發(fā)病機(jī)制和尋找有效的治療方法提供有力的技術(shù)支持。4.3探究神經(jīng)元連接與功能4.3.1神經(jīng)元連接研究案例在神經(jīng)科學(xué)研究領(lǐng)域，神經(jīng)元連接的研究對(duì)于深入理解大腦功能和神經(jīng)回路的構(gòu)建至關(guān)重要。CUBIC技術(shù)為這一研究提供了強(qiáng)大的工具，眾多科研團(tuán)隊(duì)借助該技術(shù)開(kāi)展了一系列富有成效的研究。哈佛大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在一項(xiàng)關(guān)于小鼠視覺(jué)皮層神經(jīng)元連接的研究中，巧妙地運(yùn)用CUBIC技術(shù)，對(duì)小鼠的視覺(jué)皮層進(jìn)行了深入探究。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，研究人員首先對(duì)小鼠進(jìn)行了熒光標(biāo)記，將特定的熒光蛋白導(dǎo)入到神經(jīng)元中，使得神經(jīng)元能夠在成像過(guò)程中發(fā)出熒光，便于觀察。接著，他們運(yùn)用CUBIC技術(shù)對(duì)小鼠的大腦進(jìn)行透明化處理。通過(guò)將大腦依次浸泡在CUBIC-L試劑進(jìn)行脫脂和脫色處理，再使用CUBIC-R試劑進(jìn)行折射率匹配，使大腦組織變得透明，減少了光線散射，為后續(xù)的成像提供了清晰的背景。在成像階段，研究人員利用光片顯微鏡對(duì)透明化后的大腦進(jìn)行三維成像，獲取了大量關(guān)于神經(jīng)元連接的圖像數(shù)據(jù)。通過(guò)對(duì)這些圖像數(shù)據(jù)的分析，研究人員發(fā)現(xiàn)視覺(jué)皮層中不同層的神經(jīng)元之間存在著復(fù)雜而有序的連接模式。例如，第2/3層的錐體神經(jīng)元與第5層和第6層的神經(jīng)元之間形成了豐富的突觸連接，這些連接在視覺(jué)信息的傳遞和處理過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。而且，研究人員還觀察到神經(jīng)元的軸突和樹(shù)突在不同層之間的分布具有特定的規(guī)律，軸突從細(xì)胞體發(fā)出后，會(huì)向不同層延伸，與其他神經(jīng)元的樹(shù)突形成突觸連接，從而實(shí)現(xiàn)神經(jīng)信號(hào)的傳遞。這項(xiàng)研究成果具有重要的意義。在神經(jīng)科學(xué)理論方面，它為我們深入理解視覺(jué)皮層的神經(jīng)回路結(jié)構(gòu)和功能提供了重要的依據(jù)，進(jìn)一步揭示了大腦如何處理視覺(jué)信息的機(jī)制。在實(shí)際應(yīng)用方面，對(duì)于研究視覺(jué)相關(guān)的疾病，如青光眼、黃斑病變等，這些疾病往往伴隨著視覺(jué)皮層神經(jīng)元連接的異常，通過(guò)對(duì)正常視覺(jué)皮層神經(jīng)元連接的研究，可以為這些疾病的診斷和治療提供新的靶點(diǎn)和思路。東京大學(xué)的科研團(tuán)隊(duì)在研究小鼠海馬體神經(jīng)元連接時(shí)，也運(yùn)用了CUBIC技術(shù)。他們對(duì)小鼠海馬體進(jìn)行熒光標(biāo)記后，采用CUBIC技術(shù)進(jìn)行透明化處理。在透明化過(guò)程中，嚴(yán)格控制試劑的浸泡時(shí)間和溫度，確保透明化效果的同時(shí)，最大限度地保留熒光信號(hào)。通過(guò)光片顯微鏡成像和數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)海馬體中的CA1、CA3和齒狀回等區(qū)域的神經(jīng)元之間存在著獨(dú)特的連接模式。CA3區(qū)的神經(jīng)元通過(guò)苔蘚纖維與齒狀回的顆粒細(xì)胞形成強(qiáng)連接，這種連接在空間記憶和學(xué)習(xí)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。而且，研究人員還發(fā)現(xiàn)，在學(xué)習(xí)和記憶任務(wù)中，這些神經(jīng)元連接會(huì)發(fā)生可塑性變化，表現(xiàn)為突觸數(shù)量和強(qiáng)度的改變。該研究成果對(duì)于理解學(xué)習(xí)和記憶的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制具有重要價(jià)值。從神經(jīng)科學(xué)理論角度來(lái)看，它揭示了海馬體神經(jīng)元連接在學(xué)習(xí)和記憶中的動(dòng)態(tài)變化，為進(jìn)一步研究學(xué)習(xí)和記憶的分子和細(xì)胞機(jī)制提供了重要線索。在實(shí)際應(yīng)用方面，對(duì)于治療與學(xué)習(xí)和記憶障礙相關(guān)的疾病，如阿爾茨海默病、健忘癥等，提供了潛在的治療靶點(diǎn)和干預(yù)策略。通過(guò)調(diào)節(jié)海馬體神經(jīng)元連接的可塑性，有望改善患者的學(xué)習(xí)和記憶能力。4.3.2神經(jīng)元功能研究案例神經(jīng)元功能的研究對(duì)于揭示大腦的奧秘以及治療神經(jīng)疾病至關(guān)重要，CUBIC技術(shù)在這一領(lǐng)域也發(fā)揮了重要作用，眾多科研團(tuán)隊(duì)通過(guò)結(jié)合CUBIC技術(shù)與其他手段開(kāi)展了深入研究。斯坦福大學(xué)的研究團(tuán)隊(duì)在探究神經(jīng)元功能時(shí)，創(chuàng)新性地將CUBIC技術(shù)與電生理記錄相結(jié)合。他們以小鼠為研究對(duì)象，首先對(duì)小鼠的特定腦區(qū)進(jìn)行熒光標(biāo)記，利用CUBIC技術(shù)對(duì)小鼠大腦進(jìn)行透明化處理。在透明化過(guò)程中，嚴(yán)格控制試劑的濃度和處理時(shí)間，以確保組織的完整性和熒光信號(hào)的穩(wěn)定性。隨后，使用光片顯微鏡對(duì)透明化后的大腦進(jìn)行三維成像，清晰地觀察到神經(jīng)元的形態(tài)和分布。在此基礎(chǔ)上，研究人員利用微電極對(duì)特定神經(jīng)元進(jìn)行電生理記錄，測(cè)量神經(jīng)元的動(dòng)作電位、膜電位等電生理參數(shù)。通過(guò)對(duì)成像結(jié)果和電生理數(shù)據(jù)的綜合分析，研究人員發(fā)現(xiàn)特定神經(jīng)元的功能與其形態(tài)和連接密切相關(guān)。例如，在大腦的運(yùn)動(dòng)皮層中，具有較長(zhǎng)軸突和較多樹(shù)突分支的神經(jīng)元，能夠整合更多的輸入信號(hào)，在運(yùn)動(dòng)控制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。而且，研究人員還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)神經(jīng)元受到刺激時(shí)，其電活動(dòng)模式會(huì)發(fā)生改變，這種改變與神經(jīng)元之間的連接和信號(hào)傳遞密切相關(guān)。這項(xiàng)研究成果具有重要的意義。在神經(jīng)科學(xué)理論方面，它揭示了神經(jīng)元功能與形態(tài)、連接之間的內(nèi)在聯(lián)系，為深入理解大腦的神經(jīng)信息處理機(jī)制提供了重要依據(jù)。在實(shí)際應(yīng)用方面，對(duì)于治療運(yùn)動(dòng)相關(guān)的神經(jīng)疾病，如帕金森病、脊髓損傷等，提供了新的治療思路。通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)元的功能和連接，有望改善患者的運(yùn)動(dòng)功能。加州理工學(xué)院的科研團(tuán)隊(duì)在研究神經(jīng)元功能時(shí)，將CUBIC技術(shù)與基因編輯技術(shù)相結(jié)合。他們針對(duì)小鼠的特定神經(jīng)元基因進(jìn)行編輯，使其表達(dá)特定的熒光蛋白，以便在成像過(guò)程中能夠特異性地標(biāo)記這些神經(jīng)元。然后，運(yùn)用CUBIC技術(shù)對(duì)小鼠大腦進(jìn)行透明化處理，通過(guò)光片顯微鏡成像觀察神經(jīng)元的形態(tài)和分布。研究人員發(fā)現(xiàn)，基因編輯后的神經(jīng)元在形態(tài)和功能上發(fā)生了顯著變化。例如，當(dāng)敲除某個(gè)與神經(jīng)元生長(zhǎng)相關(guān)的基因后，神經(jīng)元的樹(shù)突分支明顯減少，其與其他神經(jīng)元之間的連接也相應(yīng)減少，導(dǎo)致神經(jīng)元的功能受到影響。在感覺(jué)信息處理過(guò)程中，這些基因編輯后的神經(jīng)元對(duì)刺激的響應(yīng)能力明顯降低。該研究成果對(duì)于深入理解基因與神經(jīng)元功能之間的關(guān)系具有重要價(jià)值。從神經(jīng)科學(xué)理論角度來(lái)看，它揭示了基因?qū)ι窠?jīng)元發(fā)育、形態(tài)和功能的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步研究神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)疾病的遺傳機(jī)制提供了重要線索。在實(shí)際應(yīng)用方面，對(duì)于治療與基因缺陷相關(guān)的神經(jīng)疾病，如亨廷頓舞蹈病、遺傳性共濟(jì)失調(diào)等，提供了潛在的基因治療靶點(diǎn)和干預(yù)策略。通過(guò)修復(fù)或調(diào)控相關(guān)基因，有望改善神經(jīng)元的功能，從而治療這些疾病。五、CUBIC技術(shù)在神經(jīng)元成像應(yīng)用中的挑戰(zhàn)與解決方案5.1技術(shù)挑戰(zhàn)5.1.1不同組織透明化效果差異在神經(jīng)元成像研究中，大腦組織由灰質(zhì)和白質(zhì)等不同類(lèi)型組織構(gòu)成，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)和成分上存在顯著差異，這導(dǎo)致CUBIC技術(shù)對(duì)其透明化效果呈現(xiàn)出明顯不同?；屹|(zhì)主要由神經(jīng)元的胞體、樹(shù)突及突觸等構(gòu)成，富含細(xì)胞體和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，脂質(zhì)含量相對(duì)較低。白質(zhì)則主要由神經(jīng)纖維組成，這些神經(jīng)纖維被髓鞘包裹，髓鞘富含脂質(zhì)，是白質(zhì)中導(dǎo)致光散射的主要因素。由于這種成分差異，CUBIC技術(shù)在處理灰質(zhì)和白質(zhì)時(shí)面臨不同的挑戰(zhàn)。在處理白質(zhì)時(shí)，由于其豐富的脂質(zhì)髓鞘，脫脂過(guò)程需要更高效地去除脂質(zhì)，以減少光散射。然而，過(guò)度脫脂可能會(huì)對(duì)白質(zhì)的結(jié)構(gòu)造成損傷，影響神經(jīng)纖維的完整性和功能。在使用CUBIC-L試劑進(jìn)行脫脂時(shí)，白質(zhì)中的脂質(zhì)與試劑的反應(yīng)更為復(fù)雜，需要更長(zhǎng)的處理時(shí)間和更精確的試劑濃度控制，才能達(dá)到理想的脫脂效果。而灰質(zhì)由于脂質(zhì)含量較低，脫脂過(guò)程相對(duì)容易，但在脫色和折射率匹配環(huán)節(jié)，灰質(zhì)與白質(zhì)對(duì)試劑的反應(yīng)也存在差異，這使得難以找到一種通用的處理?xiàng)l件來(lái)實(shí)現(xiàn)灰質(zhì)和白質(zhì)同時(shí)達(dá)到最佳透明化效果。這種透明化效果的差異對(duì)神經(jīng)元成像產(chǎn)生了多方面的影響。在成像清晰度方面，由于白質(zhì)透明化難度較大，可能導(dǎo)致成像時(shí)白質(zhì)區(qū)域的清晰度低于灰質(zhì)區(qū)域，使得神經(jīng)纖維的細(xì)節(jié)難以清晰呈現(xiàn)，影響對(duì)神經(jīng)回路連接的觀察和分析。在圖像對(duì)比度方面，灰質(zhì)和白質(zhì)透明化效果的不一致會(huì)導(dǎo)致圖像對(duì)比度不均勻，增加了對(duì)圖像中神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和分布信息解讀的難度。在對(duì)小鼠大腦進(jìn)行CUBIC技術(shù)透明化處理后成像時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)白質(zhì)區(qū)域模糊，與灰質(zhì)區(qū)域形成明顯對(duì)比，使得在觀察整個(gè)大腦神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)時(shí)，難以準(zhǔn)確把握白質(zhì)中神經(jīng)纖維與灰質(zhì)中神經(jīng)元之間的連接關(guān)系，限制了對(duì)大腦神經(jīng)功能的深入理解。5.1.2成像深度與分辨率限制當(dāng)利用CUBIC技術(shù)處理大尺寸樣本，如整個(gè)大腦或較大的腦組織塊時(shí)，成像深度和分辨率方面面臨著諸多問(wèn)題。隨著成像深度的增加，光線在組織中傳播會(huì)受到多種因素的影響，導(dǎo)致成像質(zhì)量下降。盡管CUBIC技術(shù)通過(guò)脫脂和折射率匹配等步驟減少了光散射和吸收，但組織內(nèi)部仍然存在一定程度的光衰減。這是因?yàn)榧词菇?jīng)過(guò)處理，組織中的生物分子、細(xì)胞結(jié)構(gòu)等仍然會(huì)對(duì)光線產(chǎn)生一定的散射和吸收作用，使得到達(dá)深層組織的光線強(qiáng)度減弱。在對(duì)小鼠全腦進(jìn)行成像時(shí)，大腦深部的神經(jīng)元接收到的激發(fā)光強(qiáng)度較低，發(fā)射的熒光信號(hào)也相應(yīng)較弱，從而導(dǎo)致成像的信噪比降低，圖像模糊，難以清晰分辨神經(jīng)元的細(xì)節(jié)結(jié)構(gòu)。CUBIC技術(shù)在分辨率方面也存在一定的局限性。對(duì)于大尺寸樣本，要實(shí)現(xiàn)高分辨率成像，需要更強(qiáng)大的成像設(shè)備和更精細(xì)的成像技術(shù)。目前常用的成像設(shè)備，如光片顯微鏡，雖然能夠?qū)Υ蟪叽鐦颖具M(jìn)行快速成像，但在高分辨率成像方面存在一定的限制。在對(duì)大尺寸樣本進(jìn)行高分辨率成像時(shí)，需要增加成像的層數(shù)和像素?cái)?shù)量，這會(huì)導(dǎo)致成像時(shí)間大幅增加，同時(shí)也會(huì)增加數(shù)據(jù)處理的難度。而且，隨著成像分辨率的提高，圖像中的噪聲也會(huì)相應(yīng)增加，進(jìn)一步降低了圖像的質(zhì)量。在對(duì)大鼠大腦進(jìn)行高分辨率成像時(shí)，為了獲取更詳細(xì)的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)信息，提高分辨率后，圖像中出現(xiàn)了較多的噪聲，掩蓋了部分神經(jīng)元的細(xì)節(jié)特征，影響了對(duì)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和功能的準(zhǔn)確分析。成像深度和分辨率的限制相互制約，進(jìn)一步限制了CUBIC技術(shù)在大尺寸樣本神經(jīng)元成像中的應(yīng)用。為了提高成像深度，可能需要降低分辨率，以保證足夠的光線強(qiáng)度和成像速度；而要提高分辨率，則可能需要犧牲成像深度，或者增加成像時(shí)間和數(shù)據(jù)處理難度。在研究大腦深部的神經(jīng)元連接時(shí)，若要提高成像深度，觀察到更深處的神經(jīng)元連接情況，可能需要降低分辨率，使得連接的細(xì)節(jié)無(wú)法清晰呈現(xiàn)；若要提高分辨率，清晰展示神經(jīng)元連接的細(xì)節(jié)，則可能只能觀察到大腦淺層的神經(jīng)元，無(wú)法滿足對(duì)大腦整體神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)研究的需求。5.1.3數(shù)據(jù)處理與分析難題CUBIC技術(shù)在神經(jīng)元成像過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的成像數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)在處理和分析時(shí)面臨諸多挑戰(zhàn)，對(duì)研究的效率和準(zhǔn)確性產(chǎn)生了重要影響。從數(shù)據(jù)存儲(chǔ)角度來(lái)看，CUBIC技術(shù)獲取的神經(jīng)元成像數(shù)據(jù)量巨大。以對(duì)小鼠全腦進(jìn)行CUBIC成像為例，由于需要對(duì)整個(gè)大腦進(jìn)行三維成像，涉及多個(gè)層面和角度的圖像采集，生成的數(shù)據(jù)量可達(dá)數(shù)GB甚至數(shù)十GB。如此龐大的數(shù)據(jù)量對(duì)存儲(chǔ)設(shè)備的容量提出了極高的要求。普通的實(shí)驗(yàn)室存儲(chǔ)設(shè)備往往難以滿足長(zhǎng)期存儲(chǔ)這些數(shù)據(jù)的需求，需要配備專(zhuān)門(mén)的大容量存儲(chǔ)服務(wù)器或云存儲(chǔ)設(shè)備。而且，數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)還需要考慮數(shù)據(jù)的安全性和穩(wěn)定性，防止數(shù)據(jù)丟失或損壞，這進(jìn)一步增加了數(shù)據(jù)存儲(chǔ)的成本和復(fù)雜性。在圖像分割方面，CUBIC成像數(shù)據(jù)中的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)復(fù)雜，邊界模糊，給圖像分割帶來(lái)了極大的困難。神經(jīng)元的形態(tài)多樣，樹(shù)突和軸突相互交織，使得準(zhǔn)確識(shí)別和分割神經(jīng)元變得非常棘手。而且，圖像中還存在噪聲、背景干擾等因素，進(jìn)一步增加了分割的難度。目前常用的圖像分割算法，如基于閾值的分割算法、基于邊緣檢測(cè)的分割算法等，在處理CUBIC成像數(shù)據(jù)時(shí)，往往無(wú)法準(zhǔn)確地分割出神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)。這些算法可能會(huì)將神經(jīng)元的部分結(jié)構(gòu)誤分割為背景，或者將背景誤分割為神經(jīng)元，導(dǎo)致分割結(jié)果不準(zhǔn)確，影響后續(xù)的數(shù)據(jù)分析和研究。數(shù)據(jù)分析算法的選擇和優(yōu)化也是一個(gè)難題。由于CUBIC成像數(shù)據(jù)的復(fù)雜性和多樣性，不同的數(shù)據(jù)分析任務(wù)需要選擇合適的算法。在分析神經(jīng)元的連接關(guān)系時(shí)，需要使用圖論算法來(lái)構(gòu)建神經(jīng)元連接網(wǎng)絡(luò)；在分析神經(jīng)元的形態(tài)特征時(shí)，需要使用形態(tài)學(xué)分析算法來(lái)提取神經(jīng)元的形態(tài)參數(shù)。然而，不同的算法在處理CUBIC成像數(shù)據(jù)時(shí)，其性能和效果存在差異。而且，這些算法往往需要根據(jù)具體的數(shù)據(jù)特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整，才能達(dá)到最佳的分析效果。選擇和優(yōu)化合適的數(shù)據(jù)分析算法需要具備深厚的數(shù)學(xué)和計(jì)算機(jī)科學(xué)知識(shí)，對(duì)研究人員的專(zhuān)業(yè)能力提出了較高的要求。5.2解決方案與優(yōu)化策略5.2.1試劑與方法改進(jìn)在試劑改進(jìn)方面，針對(duì)不同組織類(lèi)型，開(kāi)發(fā)更具針對(duì)性的試劑配方是提升CUBIC技術(shù)透明化效果的關(guān)鍵策略。以大腦組織中的灰質(zhì)和白質(zhì)為例，由于二者結(jié)構(gòu)和成分存在顯著差異，白質(zhì)富含脂質(zhì)髓鞘，而灰質(zhì)脂質(zhì)含量相對(duì)較低。因此，可設(shè)計(jì)專(zhuān)門(mén)針對(duì)白質(zhì)的脫脂試劑，在CUBIC-L試劑基礎(chǔ)上，調(diào)整N-丁基二乙醇胺的濃度和比例，增強(qiáng)其對(duì)脂質(zhì)的溶解能力，以更有效地去除白質(zhì)中的脂質(zhì)，減少光散射。同時(shí)，優(yōu)化1，3-雙二氨甲基環(huán)己烷的含量，使其在有效脫色的同時(shí)，降低對(duì)組織的損傷。對(duì)于灰質(zhì)，可適當(dāng)調(diào)整試劑成分，在保證脫脂和脫色效果的前提下，更注重維持灰質(zhì)的結(jié)構(gòu)完整性和熒光信號(hào)的穩(wěn)定性。在方法改進(jìn)上，優(yōu)化透明化處理流程中的操作條件至關(guān)重要。在脫脂和脫色步驟中，精確控制試劑的浸泡時(shí)間和溫度。對(duì)于一些脂質(zhì)含量較高的組織，適當(dāng)延長(zhǎng)浸泡時(shí)間，以確保脂質(zhì)充分去除，但要避免過(guò)長(zhǎng)時(shí)間導(dǎo)致組織損傷；同時(shí)，根據(jù)不同組織的耐受程度，合理調(diào)整溫度，一般在37℃左右進(jìn)行振蕩處理，但對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的組織，可適當(dāng)降低溫度至30-35℃，并增加振蕩頻率，以促進(jìn)試劑與組織的充分接觸，提高處理效率。在折射率匹配步驟，采用梯度浸泡法，即先將組織浸泡在折射率逐漸接近組織的試劑中，使組織逐步適應(yīng)折射率的變化，減少因折射率突然改變導(dǎo)致的組織變形和熒光信號(hào)損失。在對(duì)小鼠大腦進(jìn)行折射率匹配時(shí)，先使用折射率略低于最終匹配值的CUBIC-R試劑浸泡1-2天，再逐漸過(guò)渡到折射率完全匹配的試劑，這樣可以更好地保持大腦組織的形態(tài)和熒光信號(hào)，提高成像質(zhì)量。5.2.2成像技術(shù)結(jié)合將CUBIC技術(shù)與平鋪光片顯微鏡相結(jié)合，是突破成像深度和分辨率限制的有效途徑。平鋪光片顯微鏡采用獨(dú)特的成像原理，通過(guò)對(duì)空間光調(diào)制器加載不同的相位圖實(shí)現(xiàn)快速平鋪短而薄的光片，從而達(dá)到擴(kuò)大視場(chǎng)且不影響空間分辨率和光學(xué)層析能力，可以獲取在視野范圍內(nèi)各處成像分辨率均一的高分辨率圖像。在對(duì)經(jīng)CUBIC技術(shù)透明化處理的大尺寸腦組織樣本成像時(shí)，平鋪光片顯微鏡能夠在較大的成像深度范圍內(nèi)保持較高的分辨率。由于其光片的快速平鋪特性，能夠在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)大尺寸樣本進(jìn)行全面成像，減少了成像時(shí)間，降低了光漂白和光毒性的影響。在對(duì)整個(gè)小鼠大腦進(jìn)行成像時(shí)，平鋪光片顯微鏡可以在一次成像過(guò)程中獲取全腦的三維圖像，清晰地展示大腦深部神經(jīng)元的形態(tài)和分布，以及神經(jīng)元之間的連接情況，這是傳統(tǒng)光片顯微鏡難以實(shí)現(xiàn)的。多光子顯微鏡與CUBIC技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用也具有顯著優(yōu)勢(shì)。多光子顯微鏡利用多光子激發(fā)熒光效應(yīng)，使用高能量的超短脈沖激光作為激發(fā)光源，激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)，通常為近紅外光，其在生物組織中的穿透能力較強(qiáng)，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)深層組織中神經(jīng)元的成像，成像深度可達(dá)毫米級(jí)。將多光子顯微鏡與CUBIC技術(shù)結(jié)合，在對(duì)經(jīng)CUBIC透明化處理的腦組織成像時(shí)，多光子顯微鏡可以利用其深層成像能力，對(duì)大腦深部的神經(jīng)元進(jìn)行高分辨率成像。而且，多光子激發(fā)是一個(gè)非線性過(guò)程，只有在激發(fā)光焦點(diǎn)附近的有限區(qū)域才能達(dá)到產(chǎn)生熒光所需的激光照射功率密度，非焦點(diǎn)區(qū)域不會(huì)產(chǎn)生熒光，這大大減少了焦點(diǎn)外的光漂白和光毒性，非常適合對(duì)活體神經(jīng)元進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的動(dòng)態(tài)觀察。在研究神經(jīng)可塑性時(shí)，通過(guò)CUBIC技術(shù)透明化處理小鼠大腦，再利用多光子顯微鏡可以實(shí)時(shí)觀察神經(jīng)元樹(shù)突棘在學(xué)習(xí)、記憶等過(guò)程中的形態(tài)變化，為深入理解神經(jīng)可塑性的機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。5.2.3數(shù)據(jù)分析技術(shù)應(yīng)用機(jī)器學(xué)習(xí)算法在處理CUBIC技術(shù)產(chǎn)生的神經(jīng)元成像數(shù)據(jù)方面具有巨大潛力。在圖像分割任務(wù)中，可運(yùn)用卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（CNN）算法。CNN具有強(qiáng)大的特征提取能力，通過(guò)構(gòu)建合適的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，如U-Net等，能夠自動(dòng)學(xué)習(xí)神經(jīng)元圖像中的特征信息，從而準(zhǔn)確地分割出神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)。在訓(xùn)練過(guò)程中，使用大量標(biāo)注好的神經(jīng)元圖像數(shù)據(jù)對(duì)CNN模型進(jìn)行訓(xùn)練，模型能夠?qū)W習(xí)到神經(jīng)元的形態(tài)、邊界等特征，從而在對(duì)新的CUBIC成像數(shù)據(jù)進(jìn)行分割時(shí)，能夠準(zhǔn)確地識(shí)別出神經(jīng)元的胞體、樹(shù)突和軸突等結(jié)構(gòu)，克服了傳統(tǒng)圖像分割算法在處理復(fù)雜神經(jīng)元結(jié)構(gòu)時(shí)的局限性。主成分分析（PCA）算法可用于數(shù)據(jù)降維，有效解決CUBIC成像數(shù)據(jù)量大的問(wèn)題。PCA算法能夠?qū)⒏呔S數(shù)據(jù)投影到低維空間，在保留數(shù)據(jù)主要特征的同時(shí)，減少數(shù)據(jù)的維度。在處理CUBIC技術(shù)產(chǎn)生的三維神經(jīng)元成像數(shù)據(jù)時(shí)，由于數(shù)據(jù)維度高，包含大量冗余信息，通過(guò)PCA算法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，可以降低數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和處理的難度，提高分析效率。在對(duì)小鼠全腦