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海水中痕量銨鹽的測定

流動分析-鄰苯二甲醛固相萃取-熒光光度法

1范圍

本文件規(guī)定了采用流動分析-鄰苯二甲醛固相萃取-熒光光度法測定海水中痕量銨鹽的方法原理、干

擾和消除、試劑與材料、儀器和設(shè)備、樣品采集與保存、分析步驟、結(jié)果計算與記錄、精密度和準(zhǔn)確度、

質(zhì)量保證和質(zhì)量控制的要求。

本文件適用于海水中nmol/L級別痕量銨鹽的測定。樣品富集體積為10mL時，本方法的檢出限為

9nmol/L，測定下限為15nmol/L。

2規(guī)范性引用文件

下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

GB/T12763.4海洋調(diào)查規(guī)范第4部分：海水化學(xué)要素調(diào)查

GB17378.2海洋監(jiān)測規(guī)范第2部分：數(shù)據(jù)處理與分析質(zhì)量控制

3術(shù)語和定義

本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。

4方法原理

4.1流動分析系統(tǒng)工作原理

樣品與試劑在蠕動泵的推動下進(jìn)入分析模塊，在密閉的管道中按設(shè)定的順序和比例進(jìn)行混合、反應(yīng)、

固相萃取、洗脫，洗脫液進(jìn)入熒光檢測器測定熒光強(qiáng)度，計算樣品中被測物質(zhì)的含量。

4.2化學(xué)反應(yīng)原理

在堿性介質(zhì)中，海水樣品中的銨鹽與鄰苯二甲醛、亞硫酸鹽發(fā)生衍生化反應(yīng)，生成具有熒光性質(zhì)的

異吲哚衍生物，該衍生物富集在固相萃取小柱上，經(jīng)乙醇洗脫后，用熒光檢測器在365nm激發(fā)波長、

425nm發(fā)射波長下測定。

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參考分析流路圖見圖1。

說明：

P1——蠕動泵1P2——蠕動泵2C1——混合盤管1，80cm

C2——混合盤管2，80cmC3——混合盤管3，80cmL——10mL定量環(huán)

E——固相萃取小柱（見6.22）WB——65℃水浴V1——六通閥1

V2——六通閥2V3——多位選擇閥D——熒光檢測器

R1——鄰苯二甲醛溶液（見6.11）R2——亞硫酸鈉溶液（見6.12）R3——四硼酸鈉緩沖溶液（見6.13）

R4——洗脫液（見6.14）R5——超純水S——樣品

W——廢液

圖1流動分析-鄰苯二甲醛固相萃取-熒光光度法測定痕量銨鹽的分析流路圖

5干擾和消除

為防止空氣中的氨氣及顆粒物對試劑的干擾和污染，需增加試劑保護(hù)柱，試劑保護(hù)柱由一次性注射

器改裝而成。去除5mL一次性注射器的活塞和針頭，在空筒內(nèi)填充3mL酸化硅膠（見6.21），即制成

試劑保護(hù)柱。在試劑瓶瓶蓋上打孔，其大小以能夠套緊注射器空筒的乳頭為宜；將乳頭即整支試劑保護(hù)

柱固定在試劑瓶瓶蓋上。

6試劑與材料

除非另有說明，在分析中均使用確認(rèn)為分析純的化學(xué)試劑，實(shí)驗用水均為新制備的超純水（電阻率

≥18.0MΩ·cm）。

6.1鄰苯二甲醛（C8H6O2）。

6.2甲醇（CH3OH）：色譜純。

6.3無水亞硫酸鈉（Na2SO3）。

6.4甲醛（HCHO）：優(yōu)級純。

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6.5十水合四硼酸鈉（Na2B4O7·10H2O）。

6.695%（V/V）乙醇（C2H5OH）。

6.7硫酸（H2SO4）：優(yōu)級純，ρ(H2SO4)=1.84g/mL。

6.8鹽酸（HCl）：優(yōu)級純，ρ(HCl)=1.19g/mL。

6.9氯化銨（NH4Cl）：優(yōu)級純，在100℃±5℃下烘干并恒重后，保存在干燥器中。

6.10硅膠（200目）。

6.11鄰苯二甲醛溶液：c(C8H6O2)=3mmol/L。配制方法為：稱取3.35g鄰苯二甲醛（見6.1）溶于200

mL甲醇（見6.2）中，用水稀釋至1L，得到鄰苯二甲醛溶液濃度為25mmol/L。該溶液貯存于

高密度聚乙烯瓶中，在4℃下保存，可穩(wěn)定1個月。臨用時用水稀釋至3mmol/L。

6.12亞硫酸鈉溶液：c(Na2SO3)=0.8mmol/L。配制方法為：稱取1.26g無水亞硫酸鈉（見6.3）溶于水

中，并定容至1L，加入0.2mL甲醛（見6.4），得到亞硫酸鈉溶液濃度為10mmol/L。該溶液貯

存于高密度聚乙烯瓶中，在4℃下保存，可穩(wěn)定1個月。臨用時用水稀釋至0.8mmol/L。

6.13四硼酸鈉緩沖溶液：c(Na2B4O7)=15g/L。配制方法為：稱取15g十水合四硼酸鈉（見6.5）溶于

水中，并定容至1L。該溶液貯存于高密度聚乙烯瓶中，在4℃下保存，可穩(wěn)定1個月。

6.14洗脫液：95%（V/V）乙醇（見6.6），使用前用超聲波脫氣10min。

6.15硫酸溶液：c(H2SO4)=6mol/L。配制方法為：量取300mL硫酸（見6.7），在不斷攪拌下緩緩加入

600mL水中。

6.16鹽酸溶液：c(HCl)=1mol/L。配制方法為：量取50mL鹽酸（見6.8）與550mL水混合均勻。

6.17銨鹽標(biāo)準(zhǔn)貯備液：c(NH4Cl)=10.00mmol/L。配制方法為：準(zhǔn)確稱取0.3304g氯化銨（見6.9）溶

于水中，并定容至500mL，貯存于高密度聚乙烯瓶中，在4℃下保存，可穩(wěn)定1個月。

6.18銨鹽標(biāo)準(zhǔn)中間溶液：c(NH4Cl)=100.00μmol/L。配制方法為：準(zhǔn)確量取1.00mL銨鹽標(biāo)準(zhǔn)貯備液（見

6.17），用水定容至100mL，貯存于高密度聚乙烯瓶中，在4℃下保存，可穩(wěn)定7天。

6.19銨鹽標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：c(NH4Cl)=1.00μmol/L。配制方法為：準(zhǔn)確量取1.00mL銨鹽標(biāo)準(zhǔn)中間溶液（見

6.18），用水定容至100mL，現(xiàn)用現(xiàn)配。

6.20低銨海水：取采集于寡營養(yǎng)鹽海域的海水作為低銨海水，常溫密封保存，其銨鹽濃度應(yīng)低于本方

法的檢出限。

6.21酸化硅膠。配制方法為：稱取200g硅膠（見6.10）在70℃下烘干過夜，加入50mL硫酸溶液（見

6.15），攪拌混勻。

6.22固相萃取小柱。OasisHLB小柱1)：6cm3/200mg。

6.23蠕動泵泵管。試劑泵管內(nèi)徑0.89mm，樣品泵管內(nèi)徑2.06mm。

6.24聚四氟乙烯管。流路管道和混合盤管內(nèi)徑0.75mm，進(jìn)樣管和反應(yīng)盤管內(nèi)徑1.5mm。

7儀器和設(shè)備

7.1商品化或?qū)嶒炇易灾频牧鲃臃治鲅b置，參見圖1，主要由下列各部分組成：

——蠕動泵；

1)Oasis?HLB小柱是由美國Waters公司提供的產(chǎn)品的商品名。給出這一信息是為了方便本文件的使用者，并不表

示對該產(chǎn)品的認(rèn)可。如果其他產(chǎn)品具有相同的效果，那么可使用這些等效產(chǎn)品。

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——多位選擇閥；

——六通閥；

——流動分析用熒光檢測器；

——數(shù)據(jù)處理及儀器控制軟件。

7.2恒溫水浴裝置。

7.3分析天平：感量為0.0001g。

7.4普通天平：感量為0.01g。

7.5一般化學(xué)實(shí)驗室常用的儀器和設(shè)備。

8樣品采集與保存

樣品采集與保存措施如下：

a）采樣前，應(yīng)依次用鹽酸溶液（見6.16）、超純水清洗所有接觸樣品的器皿；

b）采樣過程注意防止污染，應(yīng)戴無營養(yǎng)鹽污染的一次性手套，每采一次樣品應(yīng)更換手套；

c）先用樣品將高密度聚乙烯瓶潤洗三次以上，再將樣品采集于瓶中；

d）采集的樣品一般無需過濾，如果必須過濾，要特別注意防止過濾過程中引入污染；

e）樣品采集后宜現(xiàn)場分析，若無法及時分析，可置于冰箱中冷藏或在-20℃下速凍保存，冷藏不

能超過24h，冷凍不宜超過5d。

9分析步驟

9.1儀器調(diào)試

按照圖1所示連接分析系統(tǒng)。開機(jī)后，先用超純水代替試劑，檢查整個分析流路的密閉性及液體流

動的順暢性，然后依次使用超純水、鹽酸溶液（見6.16）、超純水清洗整個管路各20min，待基線穩(wěn)定

后，將各管道的入口端置入對應(yīng)的試劑或樣品中。

9.2儀器運(yùn)行程序設(shè)定

按表1設(shè)定運(yùn)行程序和參數(shù)，分析流路參見圖1，具體步驟如下：

a）步驟1，樣品與試劑R1（鄰苯二甲醛溶液）、R2（亞硫酸鈉溶液）、R3（四硼酸鈉緩沖溶液）

在P1（蠕動泵1）的推動下，在流路中混合并進(jìn)入定量環(huán)；

b）步驟2，定量環(huán)中樣品與試劑在恒溫水浴裝置中（溫度65℃±1℃）停流反應(yīng)一定時間，生成

異吲哚衍生物；

c）步驟3，超純水在P2（蠕動泵2）作用下將定量環(huán)中的衍生反應(yīng)溶液推送進(jìn)入固相萃取小柱，

衍生物被萃??；

d）步驟4，在繼續(xù)步驟3操作的同時，洗脫液清洗檢測器流通池；

e）步驟5，固相萃取小柱上富集的衍生物被洗脫液迅速洗脫，流經(jīng)熒光檢測器進(jìn)行檢測；超純水

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同時清洗定量環(huán)及反應(yīng)流路。

表1分析系統(tǒng)的運(yùn)行程序和參數(shù)

多位選持續(xù)

步蠕動泵1流速a蠕動泵2流速a六通閥1六通閥2

擇閥閥時間說明

驟mL/minmL/min閥位閥位

位s

樣品與試劑R1（鄰苯二甲

醛溶液）、R2（亞硫酸鈉

5.0（超純水）

1.7（試劑）溶液）、R3（四硼酸鈉緩

15.7（超純水，連實(shí)線位虛線位285

8.3（樣品）沖溶液）混合后，充滿定量

接多位閥的通道）

環(huán)；超純水清洗檢測器流通

池

300或停流階段，反應(yīng)生成異吲哚

20.00.0實(shí)線位實(shí)線位2

200b衍生物

5.0（超純水）

試液過柱，衍生物在固相萃

30.05.7（超純水，連虛線位虛線位275

取小柱上富集

接多位閥的通道）

試液過柱，衍生物在固相萃

5.0（超純水）

40.0虛線位虛線位115取小柱上富集；洗脫液清洗

5.7（洗脫液）

檢測器流通池

4.3（超純水）洗脫液洗脫富集在柱上的

50.0虛線位實(shí)線位185

4.6（洗脫液）衍生物，送入檢測器檢測

a流速為實(shí)測流速。

b選擇標(biāo)準(zhǔn)系列I繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，時間設(shè)置為300s；選擇標(biāo)準(zhǔn)系列II繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時，時間設(shè)置為200s。

9.3標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的制備

標(biāo)準(zhǔn)系列I：分別移取0.00mL、1.50mL、2.50mL、5.00mL、7.50mL和10.00mL的銨鹽標(biāo)準(zhǔn)使用

溶液（見6.19），用低銨海水（見6.20）稀釋并定容至100mL，制備6個濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)系列。銨鹽的濃

度分別為：0.0nmol/L、15.0nmol/L、25.0nmol/L、50.0nmol/L、75.0nmol/L和100.0nmol/L。

標(biāo)準(zhǔn)系列II：分別移取0.00mL、5.00mL、10.00mL、15.00mL、20.00mL、25.00mL和30.00mL

的銨鹽標(biāo)準(zhǔn)使用溶液（見6.19），用低銨海水（見6.20）稀釋并定容至100mL，制備7個濃度點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)

系列。銨鹽的濃度分別為：0.0nmol/L、50.0nmol/L、100.0nmol/L、150.0nmol/L、200.0nmol/L、250.0nmol/L

和300.0nmol/L。

9.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)待測樣品濃度，選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)系列（見9.3），依次從低濃度到高濃度取適量標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，

置于樣品瓶中，啟動分析系統(tǒng)進(jìn)行測定。以測定熒光信號值（熒光強(qiáng)度）為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的銨鹽濃度為

橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

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9.5樣品測定

取適量海水樣品，采用9.4相同的條件，進(jìn)行樣品的測定。

9.6空白試驗

用低銨海水（見6.20）代替樣品，按照9.5樣品測定步驟進(jìn)行空白試驗。

10結(jié)果計算與記錄

對9.4繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行線性擬合后，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程。樣品中銨鹽的濃度按照式（1）

進(jìn)行計算。測定分析記錄表見附錄A。

???

?=………………（1）

?

式中：

c——樣品中銨鹽的濃度，單位為納摩爾每升（nmol/L）；

y——測定的熒光信號值（熒光強(qiáng)度）；

b——標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程的截距；

a——標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合方程的斜率。

計算結(jié)果表示到小數(shù)點(diǎn)后一位。

11精密度和準(zhǔn)確度

11.1精密度

（6~7）家實(shí)驗室分別使用本方法對銨鹽濃度為40.0nmol/L、150.0nmo/L的樣品進(jìn)行了重復(fù)測試（n

=9~11），測定平均值分別為33.3nmol/L~45.8nmol/L和146.3nmol/L~162.4nmol/L；重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)差分別

為1.7nmol/L和5.2nmol/L；重復(fù)性限分別為4.7nmol/L和14.7nmol/L；再現(xiàn)性標(biāo)準(zhǔn)差分別為4.9nmol/L

和7.7nmol/L；再現(xiàn)性限分別為13.7nmol/L和21.4nmol/L。

在同一實(shí)驗室，由同一操作者使用相同設(shè)備，按相同的測試方法，并在短時間內(nèi)對同一被測對象相

互獨(dú)立進(jìn)行測試獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對差值應(yīng)不大于這兩個測定值的算術(shù)平均值的20%，以

大于20%的情況不超過5%為前提。

在不同的實(shí)驗室，由不同的操作者使用不同的設(shè)備，按相同的測試方法，對同一被測對象相互獨(dú)立

進(jìn)行測試獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對差值應(yīng)不大于這兩個測定值的算術(shù)平均值的35%，以大于35%

的情況不超過5%為前提。

11.2準(zhǔn)確度

取適量濃度為6.00μmol/L的銨鹽國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用低銨海水稀釋后作為樣品（稀釋后濃度分

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別為40nmol/L和150nmol/L），由7家實(shí)驗室分別使用本方法進(jìn)行測試，結(jié)果的相對偏差范圍為

-7.9%~2.9%。7家實(shí)驗室分別對實(shí)際海水樣品進(jìn)行加標(biāo)回收測定，加標(biāo)濃度為25.0nmol/L~50.0nmol/L，

回收率范圍為93.6%~103.3%。

12質(zhì)量保證和質(zhì)量控制

質(zhì)量保證和質(zhì)量控制應(yīng)按照GB17378.2和GB/T12763.4的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。

每批樣品或連續(xù)測定8h后應(yīng)做一個全程方法空白樣、一組檢測樣品加標(biāo)樣、一組平行雙樣；有條

件的加帶一個標(biāo)準(zhǔn)參考物質(zhì)樣品。全程方法空白樣以低銨海水替代樣品，測定步驟同樣品。測定結(jié)果應(yīng)

符合附錄B的規(guī)定。

建議每分析10個樣品，使用標(biāo)準(zhǔn)曲線中間濃度溶液進(jìn)行校準(zhǔn)核查。如果測定值與理論值的相對誤差

在±10%之內(nèi)，說明測定系統(tǒng)在可控范圍內(nèi)。如果相對誤差超過±10%，說明測定系統(tǒng)失控，則應(yīng)檢查

儀器、試劑溶液是否正常，確定無疑后重新配制、測定、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，上一個合格檢查值之后測定的

樣品需重新測定，并依照新的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。

13注意事項

本方法操作中應(yīng)注意如下事項：

——實(shí)驗用超純水應(yīng)當(dāng)天制備，以避免空白過高；

——試劑和環(huán)境溫度會影響分析結(jié)果，冰箱內(nèi)貯存的試劑應(yīng)放置至室溫后再使用，分析過程中最好

保持室溫恒定，溫度波動不宜過大；

——實(shí)驗中應(yīng)避免使用玻璃材質(zhì)容器保存試劑或樣品；

——實(shí)驗環(huán)境對痕量銨鹽測定影響較大，應(yīng)避免空氣中的氨對試劑或樣品的玷污，避開實(shí)驗室內(nèi)及

實(shí)驗室附近區(qū)域的氨污染源；

——每批樣品分析均應(yīng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)驗過程中使用新配制的試劑或標(biāo)準(zhǔn)系列溶液時，應(yīng)重新繪

制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

——實(shí)驗過程中注意按照9.6步驟檢查低銨海水質(zhì)量，如發(fā)現(xiàn)低銨海水中銨鹽含量超出檢出限，應(yīng)

及時更換低銨海水，并重新繪制工作曲線；

——建議每測定約100個樣品更換一次固相萃取小柱，并重新繪制工作曲線。

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附錄A

（規(guī)范性）

海水中痕量銨鹽的測定分析記錄

海水中痕量銨鹽的測定分析記錄見表A.1。

表A.1海水中痕量銨鹽的測定分析記錄表

（流動分析-鄰苯二甲醛固相萃取-熒光光度法）

海區(qū)調(diào)查船采樣日期：年月日

儀器型號分析日期：年月日

熒光強(qiáng)度

樣品樣品中銨鹽濃度

序號站號備注

編號nmol/L

平行1平行2平均值

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

標(biāo)準(zhǔn)曲線線性回歸擬合方程：y=ac+b

備注

（a=b=r=）

分析者：校對者：

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附錄B

（規(guī)范性）

海水中痕量銨鹽測定的質(zhì)量控制要求

海水中痕量銨鹽測定的數(shù)據(jù)質(zhì)量控制要求見表B.1。

表B.1海水中痕量銨鹽測定的質(zhì)量控制要求

項目參數(shù)要求