雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)2024.04中山職業(yè)技術(shù)學(xué)院一.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.熟悉化妝品眼刺激性評(píng)價(jià)方法；2.學(xué)習(xí)雞胚絨毛尿囊膜試驗(yàn)的原理、操作方法及結(jié)果判定。二.實(shí)驗(yàn)原理

雞胚絨毛尿囊膜（CAM）的中胚層富含的血管網(wǎng)絡(luò)很好地模擬了眼結(jié)膜結(jié)構(gòu)，因此，是化妝品眼刺激性試驗(yàn)替代方法中廣泛使用的模型之一。

將一定量受試物直接與雞胚尿囊膜接觸，作用規(guī)定時(shí)間之后觀察絨毛尿囊膜毒性效應(yīng)指標(biāo)（如：出血、凝血和血管融解）的變化情況，給予評(píng)分，用于評(píng)估受試物的眼刺激性。選取孵化9-10天齡雞胚中期絨毛尿囊膜進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。三.實(shí)驗(yàn)儀器及材料1.儀器：體視顯微鏡（帶CCD攝像頭）；

照蛋器；孵蛋箱；電子計(jì)時(shí)器；微量加樣器及一次性槍頭（0.3ml）；打孔器；牙科彎頭鑷等2.材料：SPF胚蛋；無(wú)菌生理鹽水；1%的十二烷基硫酸鈉溶液；待測(cè)物四.實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程1）從恒溫箱里取出實(shí)驗(yàn)胚蛋，并進(jìn)行編號(hào)；2）用照蛋器觀察胚蛋，選取血管發(fā)育良好的雞胚，在蛋殼表面標(biāo)記氣室位置。3）用打孔工具在氣室端開一個(gè)小孔,用鑷子剝?nèi)馐疑蠈拥牡皻ぃ冻霭咨∧ぃ?）接下來(lái)用一次性吸管滴加少量生理鹽水，濕潤(rùn)、軟化薄膜；5）再用鑷子去除薄膜，這個(gè)過(guò)程一定要小心細(xì)致，減少人為操作導(dǎo)致尿囊膜損傷；6）接下往雞胚里分別滴入0.3毫升的生理鹽水、1%的十二烷基硫酸鈉溶液、待測(cè)物溶液（5%海藻糖溶液）出血時(shí)間或分值001002003004005006出血凝血血管融解五.實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄1）對(duì)于透明液體受試物采用反應(yīng)時(shí)間法，記錄出現(xiàn)三種毒性反應(yīng)（如：出血、凝血和血管融解）的時(shí)間；2）對(duì)于膏體或混濁液體采用終點(diǎn)評(píng)價(jià)法，在反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)（5分鐘后）對(duì)反應(yīng)現(xiàn)象進(jìn)行評(píng)價(jià)。（1）出血，是指血液從CAM的血管和（或）毛細(xì)血管流出，出血可以表現(xiàn)為多種形式，如以菜花狀、平滑狀、彌散的紗狀或點(diǎn)狀出血。（2）凝血，是指血管內(nèi)和血管外蛋白的變性，表現(xiàn)為血管內(nèi)血流變慢或血栓形成，血管呈現(xiàn)棕黑色，血管外出現(xiàn)渾濁和不透明。（3）血管融解，是指CAM

膜上小血管壁破裂，血管融解消失。HET-CAM評(píng)分表分值0分1分2分3分出血無(wú)出血輕度出血：僅見細(xì)小血管出血和少量出血中度出血：小血管和大血管出血，并有明顯的血液流出重度出血：幾乎所有血管都出血，大量血液流出凝血無(wú)凝血輕度凝血：血管內(nèi)和/或血管外輕度凝血，和/或CAM膜輕度混濁中度凝血：血管內(nèi)和/或血管外中度凝血，和/或CAM膜中度混濁重度凝血：血管內(nèi)和/或血管外重度凝血，和/或CAM膜重度混濁血管融解無(wú)血管融解輕度血管融解：僅小血管融解中度血管融解：小血管和大血管融解重度血管融解：大血管和全部血束都融解六.實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析1）反應(yīng)時(shí)間法：刺激評(píng)分（IS）計(jì)算公式如下，結(jié)果保留小數(shù)點(diǎn)后兩位：根據(jù)計(jì)算的IS數(shù)值，按表１對(duì)受試物眼刺激性進(jìn)行分類。

試驗(yàn)可接受標(biāo)準(zhǔn)：采用0.9％氯化鈉作為陰性對(duì)照，IS的值是0.0；采用1％十二烷基硫酸鈉溶液作為陽(yáng)性對(duì)照，IS值的范圍在10到19之間。2）終點(diǎn)評(píng)價(jià)法：每只雞胚記分=每只雞胚觀察到的出血、凝血和血管融解程度的分值之和；終點(diǎn)評(píng)分（ES）=6只雞胚得分的數(shù)學(xué)總和的平均值。根據(jù)ES數(shù)值按表２對(duì)受試物眼刺激性進(jìn)行分類。表２終點(diǎn)評(píng)分法結(jié)果評(píng)價(jià)七.實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)1.試驗(yàn)雞胚保持于孵蛋箱中，使用時(shí)再個(gè)別取出。在規(guī)定的暴露時(shí)間終止后立刻拍照，迅速觀察出血、凝血和血管融解的毒性效應(yīng)程度，給予評(píng)分。由于是主觀判斷，試驗(yàn)人員必須接受培訓(xùn)和監(jiān)督考評(píng)。2.觀察并記錄出血、凝血和血管融解出現(xiàn)的時(shí)間和毒性效應(yīng)變化的程度，精確到秒。3.拍照記錄，并將觀察結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室歷史資料或有關(guān)參考圖片作對(duì)比。八.拓展學(xué)習(xí)資料1./Info/index/cat_id/59.html雞胚絨毛尿囊膜血管實(shí)驗(yàn)2./s?id=17370