RNF185：解鎖cGAS介導(dǎo)天然免疫信號通路調(diào)控奧秘一、引言1.1研究背景與意義天然免疫作為機(jī)體抵御病原體入侵的第一道防線，在維持機(jī)體健康中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。當(dāng)病原體如病毒、細(xì)菌等入侵機(jī)體時，天然免疫細(xì)胞能夠迅速識別病原體相關(guān)分子模式（PAMPs），并啟動一系列免疫反應(yīng)，以清除病原體并保護(hù)機(jī)體免受感染。這一過程涉及多種免疫細(xì)胞和免疫分子的協(xié)同作用，是機(jī)體免疫防御的基礎(chǔ)。在天然免疫反應(yīng)中，cGAS信號通路扮演著關(guān)鍵角色。cGAS（環(huán)狀GMP-AMP合酶）作為一種重要的DNA感受器，能夠敏銳地識別細(xì)胞質(zhì)中的異常DNA。當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染或發(fā)生其他異常情況時，細(xì)胞質(zhì)中會出現(xiàn)來自病原體的DNA或自身受損釋放的DNA，cGAS與這些DNA結(jié)合后，會被激活并催化ATP和GTP生成第二信使2′3′-cGAMP。2′3′-cGAMP隨后結(jié)合并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STING（干擾素基因刺激蛋白），進(jìn)而激活下游的TBK1激酶，使IRF3磷酸化并二聚化，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)I型干擾素等一系列免疫相關(guān)基因的表達(dá)，啟動免疫應(yīng)答。這種免疫應(yīng)答不僅有助于直接抵抗病原體感染，還能激活適應(yīng)性免疫，增強(qiáng)機(jī)體對病原體的長期防御能力。然而，cGAS信號通路的過度激活或異常調(diào)控會導(dǎo)致自身免疫性疾病、炎癥性疾病等多種病理狀態(tài)。例如，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者體內(nèi)，由于自身核酸物質(zhì)的異常暴露，cGAS信號通路被過度激活，引發(fā)持續(xù)的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致多器官損傷。因此，對cGAS信號通路的精細(xì)調(diào)控機(jī)制研究至關(guān)重要。E3泛素連接酶RNF185作為一種重要的蛋白質(zhì)修飾酶，在蛋白質(zhì)泛素化修飾過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。泛素化修飾是一種廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，通過將泛素分子連接到靶蛋白上，調(diào)節(jié)靶蛋白的穩(wěn)定性、活性、定位以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用，進(jìn)而參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理和病理過程。研究表明，RNF185能夠與多種蛋白質(zhì)相互作用并調(diào)節(jié)其泛素化修飾，在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面具有重要功能。近年來，越來越多的研究關(guān)注到RNF185在免疫調(diào)節(jié)中的潛在作用，但其對cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。深入研究RNF185對cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路的調(diào)控機(jī)制，具有重要的科學(xué)意義和潛在的應(yīng)用價值。在科學(xué)意義方面，有助于揭示天然免疫信號通路的精細(xì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為深入理解機(jī)體免疫防御機(jī)制提供新的視角，豐富我們對細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫調(diào)節(jié)的認(rèn)識。在應(yīng)用價值方面，該研究可能為治療與cGAS信號通路異常相關(guān)的疾病，如自身免疫性疾病、感染性疾病等提供新的治療靶點(diǎn)和策略。通過調(diào)節(jié)RNF185的活性或其與cGAS信號通路相關(guān)分子的相互作用，有望實(shí)現(xiàn)對這些疾病的精準(zhǔn)治療，為臨床治療提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)支持。1.2國內(nèi)外研究現(xiàn)狀近年來，cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路一直是免疫學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，國內(nèi)外眾多科研團(tuán)隊圍繞該通路展開了廣泛而深入的研究。在cGAS的激活機(jī)制方面，研究發(fā)現(xiàn)多種因素可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中異常DNA的出現(xiàn)，進(jìn)而激活cGAS。如病毒感染時，病毒DNA會進(jìn)入宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，被cGAS識別。同時，細(xì)胞自身的DNA損傷、線粒體DNA泄漏等也能激活cGAS信號通路。有研究表明，在衰老細(xì)胞中，線粒體功能障礙導(dǎo)致線粒體DNA釋放到細(xì)胞質(zhì)中，激活cGAS-STING信號通路，引發(fā)炎癥反應(yīng)，這為衰老相關(guān)疾病的研究提供了新的視角。對于cGAS信號通路的下游傳導(dǎo)過程，國內(nèi)外學(xué)者也進(jìn)行了詳細(xì)的研究。2′3′-cGAMP作為cGAS激活后產(chǎn)生的關(guān)鍵第二信使，其與STING的結(jié)合及后續(xù)信號傳導(dǎo)機(jī)制已逐漸明晰。STING激活后，通過招募TBK1并使其磷酸化，進(jìn)而激活I(lǐng)RF3，誘導(dǎo)I型干擾素和其他細(xì)胞因子的表達(dá)。北京大學(xué)的研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)，ARMH3作為接頭蛋白招募PI4KB到STING，PI4KB通過合成PI4P促進(jìn)STING從高爾基體到內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)，維持STING激活所需要的脂膜環(huán)境，從而幫助STING更加穩(wěn)定高效地激活，進(jìn)一步完善了cGAS信號通路中STING激活的分子機(jī)制。在RNF185的研究方面，雖然目前針對其對cGAS信號通路調(diào)控的研究較少，但在其他領(lǐng)域已取得了一些成果。在埃博拉病毒致病機(jī)制研究中，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所的研究團(tuán)隊發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的E3泛素連接酶RNF185調(diào)控埃博拉病毒囊膜糖蛋白合成。RNF185通過K27連接的多聚泛素化使EBOV-GP的胞質(zhì)區(qū)K673發(fā)生多聚泛素化，泛素化修飾后的EBOV-GP通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬通路被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)降解，揭示了埃博拉病毒GP通過劫持宿主的CANX-CALR循環(huán)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-自噬通路來增強(qiáng)對感染細(xì)胞的適應(yīng)性。在塞內(nèi)卡病毒A（SVA）致病機(jī)制研究中，中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)SVA感染能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞中完全的線粒體自噬，E3泛素連接酶RNF185通過其跨膜結(jié)構(gòu)域1與TUFM之間的相互作用催化K27-鏈聚泛素化來啟動SVA誘導(dǎo)的線粒體自噬，泛素化的TUFM被SQSTM1識別和結(jié)合，從而將2C錨定的線粒體連接到吞噬體以將其隔離到線粒體自噬體中，最終與溶酶體融合以實(shí)現(xiàn)完全的線粒體自噬，為SVA致病機(jī)制提供了新的見解。然而，目前關(guān)于RNF185對cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路的調(diào)控研究仍存在明顯不足。雖然已知RNF185參與了一些病毒感染過程中相關(guān)蛋白的泛素化修飾和調(diào)控，但對于其是否直接作用于cGAS信號通路中的關(guān)鍵分子，以及如何影響cGAS的激活、2′3′-cGAMP的產(chǎn)生、STING的活化及下游信號傳導(dǎo)等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，尚未有明確的研究報道。在cGAS信號通路異常相關(guān)的疾病，如自身免疫性疾病中，RNF185是否發(fā)揮作用以及作用機(jī)制如何，也有待進(jìn)一步探索。填補(bǔ)這些研究空白，將有助于深入理解天然免疫信號通路的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為相關(guān)疾病的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。1.3研究目標(biāo)與內(nèi)容本研究旨在深入探究E3泛素連接酶RNF185對cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路的調(diào)控機(jī)制，為理解天然免疫調(diào)節(jié)及相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)，并為開發(fā)潛在的治療策略奠定基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容如下：1.3.1驗(yàn)證RNF185與cGAS的相互作用運(yùn)用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)，在病毒感染的細(xì)胞模型中，如單純皰疹病毒1型（HSV-1）感染的細(xì)胞，使用針對RNF185的特異性抗體進(jìn)行免疫沉淀，隨后通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測沉淀復(fù)合物中是否存在cGAS，反之亦然，以此確定兩者在細(xì)胞內(nèi)的相互作用。利用免疫熒光共定位技術(shù)，觀察RNF185與cGAS在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，分析它們是否在相同的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)共定位現(xiàn)象，進(jìn)一步驗(yàn)證兩者的相互作用。構(gòu)建帶有不同熒光標(biāo)簽的RNF185和cGAS表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過熒光顯微鏡觀察兩種熒光信號的重疊情況，明確它們在細(xì)胞內(nèi)的共定位關(guān)系。1.3.2研究RNF185對cGAS信號通路關(guān)鍵分子的影響通過基因編輯技術(shù)，如CRISPR-Cas9，構(gòu)建RNF185基因敲除的細(xì)胞系，以及過表達(dá)RNF185的細(xì)胞模型。在這些細(xì)胞模型中，檢測cGAS信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)水平和活性變化。如通過實(shí)時定量PCR（qPCR）檢測I型干擾素（IFN-α、IFN-β）、干擾素刺激基因（ISGs）等免疫相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平；使用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中I型干擾素的蛋白含量。利用免疫印跡技術(shù)檢測cGAS、STING、TBK1、IRF3等信號分子的磷酸化水平，分析RNF185對這些分子激活狀態(tài)的影響，明確RNF185在cGAS信號通路中的作用節(jié)點(diǎn)。1.3.3探討RNF185調(diào)控cGAS信號通路的分子機(jī)制研究RNF185是否通過對cGAS進(jìn)行泛素化修飾來調(diào)節(jié)其活性和穩(wěn)定性。使用體外泛素化實(shí)驗(yàn)，將純化的RNF185、cGAS、泛素以及相關(guān)的E1、E2酶等進(jìn)行孵育，通過免疫印跡檢測cGAS的泛素化水平。分析RNF185對cGAS進(jìn)行泛素化修飾的具體位點(diǎn)和泛素鏈類型，如通過點(diǎn)突變技術(shù)突變cGAS上可能的泛素化位點(diǎn)，再進(jìn)行泛素化實(shí)驗(yàn)和功能驗(yàn)證，明確RNF185調(diào)控cGAS的分子機(jī)制。探究RNF185對cGAS與其他信號分子相互作用的影響，例如通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析RNF185敲除或過表達(dá)后，cGAS與STING相互作用的變化情況，揭示RNF185在cGAS信號通路中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。1.3.4分析RNF185在cGAS信號通路相關(guān)疾病模型中的作用構(gòu)建cGAS信號通路異常激活相關(guān)的疾病動物模型，如自身免疫性疾病模型，系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型。在這些動物模型中，通過基因編輯或藥物干預(yù)等手段，調(diào)節(jié)RNF185的表達(dá)或活性。觀察動物的疾病表型變化，如自身免疫性疾病模型中，檢測小鼠血清中自身抗體水平、炎癥因子含量，分析腎臟、肝臟等組織的病理損傷情況，評估RNF185對疾病發(fā)展的影響。通過對疾病模型中RNF185作用的研究，為臨床治療相關(guān)疾病提供潛在的靶點(diǎn)和理論支持。1.4研究方法與技術(shù)路線本研究綜合運(yùn)用多種研究方法，從分子、細(xì)胞和動物水平全面深入地探究E3泛素連接酶RNF185對cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路的調(diào)控機(jī)制，具體研究方法與技術(shù)路線如下：1.4.1分子水平研究運(yùn)用免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)驗(yàn)證RNF185與cGAS的相互作用。在病毒感染（如HSV-1感染）的細(xì)胞模型中，收集細(xì)胞并裂解，提取細(xì)胞總蛋白。將針對RNF185的特異性抗體與細(xì)胞裂解液孵育，使抗體與RNF185結(jié)合，隨后加入ProteinA/G瓊脂糖珠，通過抗體與ProteinA/G瓊脂糖珠的結(jié)合，將RNF185及其相互作用蛋白沉淀下來。經(jīng)過多次洗滌去除非特異性結(jié)合的蛋白后，對沉淀復(fù)合物進(jìn)行蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）檢測，使用cGAS抗體檢測沉淀復(fù)合物中是否存在cGAS，以確定RNF185與cGAS在細(xì)胞內(nèi)是否存在相互作用。為進(jìn)一步驗(yàn)證，進(jìn)行反向免疫共沉淀，即使用cGAS抗體進(jìn)行免疫沉淀，再用RNF185抗體進(jìn)行Westernblot檢測。利用免疫熒光共定位技術(shù)，將細(xì)胞固定、透化后，分別用RNF185抗體和cGAS抗體進(jìn)行孵育，然后加入相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗，通過熒光顯微鏡觀察RNF185與cGAS在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，分析兩者是否存在共定位現(xiàn)象，從而驗(yàn)證它們的相互作用。通過體外泛素化實(shí)驗(yàn)研究RNF185對cGAS的泛素化修飾作用。將純化的RNF185、cGAS、泛素以及相關(guān)的E1、E2酶等在適宜的反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行孵育，反應(yīng)一段時間后，通過免疫印跡檢測cGAS的泛素化水平。為確定RNF185對cGAS進(jìn)行泛素化修飾的具體位點(diǎn)，構(gòu)建cGAS的點(diǎn)突變體，將可能的泛素化位點(diǎn)進(jìn)行突變，然后進(jìn)行體外泛素化實(shí)驗(yàn)，比較野生型cGAS和突變體cGAS的泛素化水平差異，確定關(guān)鍵的泛素化位點(diǎn)。利用質(zhì)譜技術(shù)分析RNF185對cGAS進(jìn)行泛素化修飾形成的泛素鏈類型，進(jìn)一步明確RNF185調(diào)控cGAS的分子機(jī)制。1.4.2細(xì)胞水平研究利用基因編輯技術(shù)CRISPR-Cas9構(gòu)建RNF185基因敲除的細(xì)胞系。設(shè)計針對RNF185基因的sgRNA，將其與Cas9蛋白表達(dá)載體共同轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過Cas9蛋白對RNF185基因的切割，實(shí)現(xiàn)基因敲除。使用嘌呤霉素等抗生素進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定敲除RNF185的細(xì)胞克隆，并通過PCR和Westernblot驗(yàn)證基因敲除效果。同時，構(gòu)建過表達(dá)RNF185的細(xì)胞模型，將RNF185表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過G418等抗生素篩選，獲得過表達(dá)RNF185的細(xì)胞系，并進(jìn)行鑒定。在RNF185基因敲除和過表達(dá)的細(xì)胞模型中，檢測cGAS信號通路中關(guān)鍵分子的表達(dá)水平和活性變化。用DNA轉(zhuǎn)染試劑將外源DNA轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，激活cGAS信號通路。通過實(shí)時定量PCR（qPCR）檢測I型干擾素（IFN-α、IFN-β）、干擾素刺激基因（ISGs）等免疫相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平，以分析RNF185對這些基因轉(zhuǎn)錄的影響。使用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中I型干擾素的蛋白含量，明確RNF185對I型干擾素分泌的作用。利用免疫印跡技術(shù)檢測cGAS、STING、TBK1、IRF3等信號分子的磷酸化水平，分析RNF185對這些分子激活狀態(tài)的影響，確定RNF185在cGAS信號通路中的作用節(jié)點(diǎn)。1.4.3動物水平研究構(gòu)建cGAS信號通路異常激活相關(guān)的疾病動物模型，如自身免疫性疾病模型——系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型。采用自發(fā)模型，如MRL/lpr小鼠，該小鼠由于自身基因突變，會自發(fā)地出現(xiàn)類似系統(tǒng)性紅斑狼瘡的癥狀?；蛘卟捎谜T導(dǎo)模型，通過多次注射自身抗原（如雙鏈DNA等），誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)，建立系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型。在疾病動物模型中，通過基因編輯或藥物干預(yù)等手段調(diào)節(jié)RNF185的表達(dá)或活性。對于基因編輯干預(yù)，利用腺相關(guān)病毒（AAV）載體，將針對RNF185的shRNA或過表達(dá)RNF185的基因序列包裝進(jìn)AAV中，通過尾靜脈注射等方式將AAV導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對RNF185表達(dá)的調(diào)節(jié)。對于藥物干預(yù)，篩選能夠調(diào)節(jié)RNF185活性的小分子化合物，將其通過腹腔注射等方式給予小鼠。觀察動物的疾病表型變化，定期采集小鼠血清，使用ELISA試劑盒檢測血清中自身抗體（如抗雙鏈DNA抗體、抗Sm抗體等）水平；檢測炎癥因子（如IL-6、TNF-α等）含量，分析炎癥反應(yīng)程度。對小鼠的腎臟、肝臟等組織進(jìn)行病理切片，通過蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組化等方法，觀察組織的病理損傷情況，評估RNF185對疾病發(fā)展的影響。本研究的技術(shù)路線是從分子水平驗(yàn)證RNF185與cGAS的相互作用及泛素化修飾機(jī)制，到細(xì)胞水平分析RNF185對cGAS信號通路關(guān)鍵分子的影響，最后在動物水平探討RNF185在cGAS信號通路相關(guān)疾病中的作用，逐步深入，全面揭示RNF185對cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路的調(diào)控機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供理論依據(jù)和潛在靶點(diǎn)。二、相關(guān)理論基礎(chǔ)2.1cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路2.1.1cGAS的結(jié)構(gòu)與功能cGAS即環(huán)狀GMP-AMP合酶，是一種在天然免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用的雙鏈DNA識別受體，屬于結(jié)構(gòu)上保守的cGAS/DncV樣核苷酸轉(zhuǎn)移酶（CD-NTase）超家族。其結(jié)構(gòu)包含一個N-末端結(jié)構(gòu)域和一個C-末端催化結(jié)構(gòu)域，這種結(jié)構(gòu)賦予了cGAS獨(dú)特的功能特性。cGAS的催化結(jié)構(gòu)域由NTase核心和Mab21結(jié)構(gòu)域組成，呈現(xiàn)出雙葉狀結(jié)構(gòu)，包括一個中央催化結(jié)構(gòu)域和兩個不同的帶正電表面。在催化結(jié)構(gòu)域的N-末端，有一條長螺旋“脊柱”，連接著N-末端葉狀結(jié)構(gòu)（具有NTase折疊）和C-末端葉狀結(jié)構(gòu)（包含緊密的螺旋束），兩個葉狀結(jié)構(gòu)之間的深槽邊緣即為催化位點(diǎn)。在靜息狀態(tài)下，cGAS處于自抑制狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)異常雙鏈DNA時，cGAS憑借其帶正電的表面以序列無關(guān)的方式與dsDNA相互作用，發(fā)生顯著的結(jié)構(gòu)切換。這種結(jié)構(gòu)變化使得cGAS的催化口重新排列，從而啟動以三磷酸鳥苷（GTP）和三磷酸腺苷（ATP）為底物的環(huán)化過程，催化生成第二信使2′3′-cGAMP。2′3′-cGAMP作為一種重要的信號分子，在后續(xù)的免疫信號傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，它能夠結(jié)合并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STING，進(jìn)而激活下游的免疫信號通路，啟動機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，以抵御病原體的入侵。2.1.2信號通路的傳導(dǎo)過程cGAS-STING-IFN信號通路是天然免疫應(yīng)答中的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)途徑，其傳導(dǎo)過程涉及多個分子的有序激活和信號傳遞。當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染或出現(xiàn)其他異常情況導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)雙鏈DNA時，cGAS首先識別并結(jié)合這些雙鏈DNA，自身發(fā)生構(gòu)象變化而被激活。激活后的cGAS以ATP和GTP為底物，催化生成第二信使2′3′-cGAMP。2′3′-cGAMP生成后，迅速結(jié)合內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STING（干擾素基因刺激蛋白），導(dǎo)致STING發(fā)生構(gòu)象變化并活化?；罨蟮腟TING在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，在COP-Ⅱ和ARFGTP酶等調(diào)節(jié)蛋白的協(xié)助下，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體中間體以及高爾基體。在這個轉(zhuǎn)位過程中，STING招募TBK1/IKKε激酶，TBK1/IKKε激酶被招募后發(fā)生磷酸化而活化。活化的TBK1進(jìn)一步招募IRF3，形成經(jīng)典的STING信號體。在STING信號體中，TBK1使IRF3磷酸化，磷酸化后的IRF3發(fā)生二聚化，并進(jìn)入細(xì)胞核。進(jìn)入細(xì)胞核的IRF3與核因子κB（NF-κB）協(xié)同作用，啟動I型干擾素（IFN）和大量干擾素刺激基因（ISGs）的轉(zhuǎn)錄。I型干擾素和ISGs表達(dá)后，分泌到細(xì)胞外，激活周圍細(xì)胞的免疫反應(yīng)，增強(qiáng)機(jī)體對病原體的抵抗能力。2.1.3在抗病毒感染和腫瘤免疫中的作用cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路在抗病毒感染和腫瘤免疫中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是機(jī)體抵御病毒入侵和監(jiān)控腫瘤細(xì)胞的重要防線。在抗病毒感染方面，當(dāng)病毒入侵細(xì)胞后，病毒的雙鏈DNA會進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，被cGAS迅速識別。cGAS激活后產(chǎn)生2′3′-cGAMP，通過cGAS-STING-IFN信號通路的傳導(dǎo)，誘導(dǎo)I型干擾素和其他細(xì)胞因子的表達(dá)。I型干擾素可以激活免疫細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等，增強(qiáng)它們對病毒感染細(xì)胞的殺傷能力。干擾素還能誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生多種抗病毒蛋白，如蛋白激酶R（PKR）、2′-5′寡腺苷酸合成酶（OAS）等，這些抗病毒蛋白通過不同機(jī)制抑制病毒的復(fù)制和傳播，從而有效地抵抗病毒感染。研究表明，在皰疹病毒感染細(xì)胞時，cGAS能夠快速識別病毒DNA，激活信號通路，誘導(dǎo)干擾素的產(chǎn)生，限制病毒的復(fù)制和擴(kuò)散，保護(hù)機(jī)體免受皰疹病毒的侵害。在腫瘤免疫中，cGAS介導(dǎo)的信號通路同樣發(fā)揮著關(guān)鍵作用。腫瘤細(xì)胞由于基因組不穩(wěn)定等原因，會產(chǎn)生異常的雙鏈DNA，這些DNA可被cGAS識別。cGAS信號通路的激活，一方面可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表達(dá)I型干擾素和其他免疫調(diào)節(jié)因子，激活抗腫瘤免疫反應(yīng)。I型干擾素可以增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的抗原呈遞能力，促進(jìn)T細(xì)胞的活化和增殖，增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的殺傷活性，從而有效地抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。另一方面，cGAS信號通路的激活還可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或細(xì)胞周期停滯，直接抑制腫瘤細(xì)胞的生長。研究發(fā)現(xiàn)，在某些腫瘤模型中，通過激活cGAS信號通路，能夠顯著增強(qiáng)機(jī)體的抗腫瘤免疫反應(yīng)，抑制腫瘤的生長，為腫瘤的免疫治療提供了新的靶點(diǎn)和策略。2.2E3泛素連接酶RNF1852.2.1RNF185的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)RNF185基因位于22號染色體q12.2區(qū)域，其編碼的蛋白屬于RINGfinger蛋白家族，這類蛋白家族成員在細(xì)胞信號傳導(dǎo)和蛋白質(zhì)降解過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。RNF185蛋白的結(jié)構(gòu)中，RINGfinger結(jié)構(gòu)域是其最為關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)特征。RINGfinger結(jié)構(gòu)域由大約40-60個氨基酸殘基組成，包含8個保守的半胱氨酸（Cys）和組氨酸（His）殘基，這些殘基通過與鋅離子形成配位鍵，使RINGfinger結(jié)構(gòu)域呈現(xiàn)出一種獨(dú)特的空間構(gòu)象，形似指環(huán)，故而得名。在蛋白質(zhì)泛素化修飾過程中，RNF185的RINGfinger結(jié)構(gòu)域發(fā)揮著核心作用。它能夠特異性地識別靶蛋白，通過與E2泛素結(jié)合酶相互作用，將泛素分子從E2酶轉(zhuǎn)移到底物蛋白上，完成對底物蛋白的泛素化修飾。這種特異性的識別和催化作用，使得RNF185能夠精準(zhǔn)地調(diào)控特定蛋白質(zhì)的功能和命運(yùn)，在細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)質(zhì)量控制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程中具有不可或缺的地位。除了RINGfinger結(jié)構(gòu)域，RNF185蛋白還可能包含其他結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域與RNF185的底物特異性、亞細(xì)胞定位以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用等密切相關(guān)，共同影響著RNF185在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能。2.2.2在其他生物學(xué)過程中的功能研究在塞內(nèi)卡病毒A（SVA）感染過程中，RNF185展現(xiàn)出獨(dú)特的調(diào)控作用。SVA是一種對豬致病的病原，可引發(fā)不同年齡段豬口、鼻及蹄部產(chǎn)生水皰、潰瘍以及新生仔豬急性死亡，對全球養(yǎng)豬業(yè)造成較大威脅。研究發(fā)現(xiàn)，SVA感染能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生完全線粒體自噬，且該過程依賴于病毒復(fù)制。進(jìn)一步研究表明，SVA的2C蛋白通過與線粒體蛋白質(zhì)翻譯延伸因子（TUFM）相互作用，將自身錨定在線粒體上。在此過程中，RNF185作為關(guān)鍵的E3泛素連接酶，通過其跨膜結(jié)構(gòu)域1與TUFM相互作用，催化TUFM發(fā)生K27鏈泛素化修飾。泛素化修飾后的TUFM能夠被SQSTM1識別和結(jié)合，SQSTM1又與LC3相互作用，從而將2C錨定的線粒體包裹進(jìn)線粒體自噬體中，最終與溶酶體融合，實(shí)現(xiàn)完全的線粒體自噬，借此促進(jìn)SVA在宿主細(xì)胞中的復(fù)制。這一發(fā)現(xiàn)豐富了對SVA致病機(jī)制的認(rèn)知，也為基于調(diào)控宿主與病毒相互作用設(shè)計新型抗病毒策略提供了新思路和新靶標(biāo)。在埃博拉病毒致病機(jī)制研究中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的E3泛素連接酶RNF185調(diào)控埃博拉病毒囊膜糖蛋白（EBOV-GP）的合成。RNF185通過K27連接的多聚泛素化使EBOV-GP的胞質(zhì)區(qū)K673發(fā)生多聚泛素化，泛素化修飾后的EBOV-GP通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬通路被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)降解。這一過程揭示了埃博拉病毒GP通過劫持宿主的CANX-CALR循環(huán)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-自噬通路來增強(qiáng)對感染細(xì)胞的適應(yīng)性，為深入理解埃博拉病毒的致病機(jī)制以及開發(fā)針對性的治療方法提供了重要的理論依據(jù)。2.2.3泛素化修飾與信號通路調(diào)控的關(guān)系泛素化修飾是一種廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，對細(xì)胞內(nèi)的信號通路調(diào)控起著至關(guān)重要的作用。其調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性、活性和定位的機(jī)制復(fù)雜而精細(xì)。在蛋白穩(wěn)定性方面，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被泛素化修飾后，尤其是形成多聚泛素鏈時，通常會被26S蛋白酶體識別并降解。如在細(xì)胞周期調(diào)控中，周期蛋白依賴激酶抑制劑p27，在被SCF（Skp1-Cullin-F-boxprotein）復(fù)合物介導(dǎo)的泛素化修飾后，迅速被蛋白酶體降解，從而推動細(xì)胞周期的進(jìn)程。這種通過泛素化修飾調(diào)節(jié)蛋白穩(wěn)定性的方式，使得細(xì)胞能夠及時清除不再需要或異常的蛋白質(zhì)，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。在蛋白活性調(diào)節(jié)方面，泛素化修飾可以改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象，進(jìn)而影響其活性。在NF-κB信號通路中，IκBα蛋白被IKK復(fù)合物磷酸化后，招募E3泛素連接酶β-TrCP，β-TrCP介導(dǎo)IκBα的泛素化修飾，隨后IκBα被蛋白酶體降解，釋放出NF-κB，使其進(jìn)入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性，啟動炎癥相關(guān)基因的表達(dá)。通過這種方式，泛素化修飾在NF-κB信號通路的激活過程中起到了關(guān)鍵的調(diào)控作用。在蛋白定位方面，泛素化修飾可以作為一種信號，引導(dǎo)蛋白質(zhì)定位于特定的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。如在細(xì)胞內(nèi)吞過程中，某些膜蛋白被泛素化修飾后，會被內(nèi)吞體識別并攝取，從而實(shí)現(xiàn)從細(xì)胞膜到內(nèi)體的轉(zhuǎn)運(yùn)。由于蛋白質(zhì)是信號通路中的關(guān)鍵組成部分，泛素化修飾對蛋白穩(wěn)定性、活性和定位的調(diào)節(jié)，必然會對信號通路產(chǎn)生激活或抑制作用。當(dāng)泛素化修飾導(dǎo)致信號通路中的抑制性蛋白降解時，信號通路通常會被激活。除了上述NF-κB信號通路的例子，在TGF-β信號通路中，Smad7蛋白是TGF-β信號通路的負(fù)調(diào)控因子，E3泛素連接酶Smurf1可以介導(dǎo)Smad7的泛素化修飾和降解，從而解除Smad7對TGF-β信號通路的抑制，激活該信號通路。相反，當(dāng)泛素化修飾導(dǎo)致信號通路中的關(guān)鍵激活蛋白降解或失活時，信號通路則會被抑制。在MAPK信號通路中，E3泛素連接酶Cbl-b可以介導(dǎo)MAPK激酶的泛素化修飾，使其活性降低，進(jìn)而抑制MAPK信號通路的傳導(dǎo)。因此，泛素化修飾通過對信號通路中關(guān)鍵蛋白的調(diào)控，精細(xì)地調(diào)節(jié)著細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，維持細(xì)胞的正常生理功能。三、RNF185與cGAS的相互作用研究3.1篩選鑒定RNF185與cGAS的相互作用3.1.1實(shí)驗(yàn)設(shè)計與方法為了篩選鑒定RNF185與cGAS之間是否存在相互作用，我們采用了免疫共沉淀（Co-IP）技術(shù)結(jié)合蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行研究，并利用GST-pulldown實(shí)驗(yàn)對結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了293T細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，首先將編碼RNF185的質(zhì)粒和編碼cGAS的質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，收集細(xì)胞并加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解，以獲取細(xì)胞總蛋白。將細(xì)胞裂解液在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液。向上清液中加入適量的針對RNF185的特異性抗體，4℃孵育過夜，使抗體與RNF185充分結(jié)合。隨后，加入ProteinA/G瓊脂糖珠，繼續(xù)在4℃孵育2-4小時，使抗體-RNF185復(fù)合物與ProteinA/G瓊脂糖珠結(jié)合。通過離心收集瓊脂糖珠，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌5次，每次洗滌后離心去除上清液，以充分去除非特異性結(jié)合的蛋白。最后，向洗滌后的瓊脂糖珠中加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使結(jié)合在瓊脂糖珠上的蛋白釋放出來，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)檢測是否存在cGAS。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，將釋放出的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，加入針對cGAS的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次后，使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過曝光顯影觀察是否出現(xiàn)cGAS的條帶。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性，我們同時設(shè)置了陰性對照，即轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的293T細(xì)胞進(jìn)行相同的免疫共沉淀和Westernblot操作。在蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)分析中，將免疫共沉淀得到的蛋白復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離后，對目標(biāo)條帶進(jìn)行切膠處理。將切下的膠塊進(jìn)行脫色、還原、烷基化和酶解等處理，使蛋白質(zhì)降解為肽段。將酶解后的肽段進(jìn)行提取和純化，然后利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS/MS）進(jìn)行分析。通過質(zhì)譜分析得到肽段的質(zhì)量數(shù)和序列信息，將這些信息與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，從而鑒定出與RNF185相互作用的蛋白，確定是否存在cGAS。為了進(jìn)一步驗(yàn)證RNF185與cGAS的相互作用，我們進(jìn)行了GST-pulldown實(shí)驗(yàn)。首先構(gòu)建GST-RNF185融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)菌株中。在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，然后將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)接至新鮮的LB培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6左右。加入終濃度為0.5mM的IPTG，在16℃條件下誘導(dǎo)表達(dá)GST-RNF185融合蛋白16小時。誘導(dǎo)結(jié)束后，收集菌體，用PBS緩沖液重懸菌體，然后進(jìn)行超聲破碎，使細(xì)胞裂解。將裂解液在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，收集上清液。向上清液中加入適量的GlutathioneSepharose4B珠子，4℃孵育2-4小時，使GST-RNF185融合蛋白與珠子結(jié)合。用PBS緩沖液洗滌珠子5次，去除未結(jié)合的蛋白，得到結(jié)合有GST-RNF185融合蛋白的珠子。將純化的cGAS蛋白與結(jié)合有GST-RNF185融合蛋白的珠子在4℃孵育4-6小時，使它們充分相互作用。孵育結(jié)束后，用PBS緩沖液洗滌珠子5次，然后加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使結(jié)合在珠子上的蛋白釋放出來，通過Westernblot技術(shù)檢測是否存在cGAS，以驗(yàn)證RNF185與cGAS的相互作用。3.1.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析通過免疫共沉淀結(jié)合Westernblot實(shí)驗(yàn)，我們在轉(zhuǎn)染了RNF185和cGAS質(zhì)粒的293T細(xì)胞免疫共沉淀樣品中，檢測到了明顯的cGAS條帶，而在轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的陰性對照樣品中未檢測到cGAS條帶。這表明在細(xì)胞內(nèi)，RNF185能夠與cGAS發(fā)生相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物。蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一相互作用。通過質(zhì)譜分析，我們在與RNF185共沉淀的蛋白復(fù)合物中，鑒定出了cGAS的肽段序列，與已知的cGAS蛋白序列高度匹配，明確了RNF185與cGAS在細(xì)胞內(nèi)存在相互作用。GST-pulldown實(shí)驗(yàn)結(jié)果同樣驗(yàn)證了RNF185與cGAS的相互作用。在加入了GST-RNF185融合蛋白和cGAS蛋白的實(shí)驗(yàn)組中，通過Westernblot檢測到了cGAS的條帶，而在只加入GST蛋白和cGAS蛋白的陰性對照組中未檢測到cGAS條帶。這表明在體外實(shí)驗(yàn)條件下，RNF185能夠直接與cGAS結(jié)合，二者之間存在特異性的相互作用。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以確定RNF185與cGAS之間存在相互作用。這種相互作用在細(xì)胞內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中均得到了驗(yàn)證，且具有一定的特異性。為了進(jìn)一步分析二者結(jié)合的穩(wěn)定性，我們進(jìn)行了競爭結(jié)合實(shí)驗(yàn)。在免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)中，加入過量的未標(biāo)記的cGAS蛋白，觀察其對RNF185與cGAS結(jié)合的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著未標(biāo)記cGAS蛋白量的增加，RNF185與cGAS結(jié)合形成的復(fù)合物量逐漸減少，說明RNF185與cGAS的結(jié)合可以被未標(biāo)記的cGAS競爭性抑制，表明二者的結(jié)合具有一定的可逆性，但在生理條件下，它們能夠穩(wěn)定地相互作用，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，可能在cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。3.2RNF185對cGAS蛋白穩(wěn)定性的影響3.2.1構(gòu)建相關(guān)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑榱松钊胩骄縍NF185對cGAS蛋白穩(wěn)定性的影響，我們構(gòu)建了RNF185過表達(dá)和敲低的細(xì)胞模型。在RNF185過表達(dá)細(xì)胞模型構(gòu)建中，我們選擇了常用的293T細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象。首先，從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取RNF185的基因序列，根據(jù)其序列設(shè)計特異性引物，通過PCR擴(kuò)增獲得RNF185的全長基因片段。將擴(kuò)增得到的基因片段與帶有Flag標(biāo)簽的表達(dá)載體pCMV-Flag進(jìn)行雙酶切，酶切位點(diǎn)分別為EcoRI和XhoI。酶切后的基因片段和載體片段通過T4DNA連接酶進(jìn)行連接，構(gòu)建成pCMV-Flag-RNF185重組表達(dá)質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在含有氨芐青霉素的LB平板上進(jìn)行篩選，挑取單菌落進(jìn)行搖菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定和測序驗(yàn)證，確保重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。將驗(yàn)證正確的pCMV-Flag-RNF185重組質(zhì)粒通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染前24小時，將293T細(xì)胞以每孔2×10^5個細(xì)胞的密度接種到6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70-80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，按照Lipofectamine3000試劑說明書進(jìn)行操作，將質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋在Opti-MEM培養(yǎng)基中，混合均勻后室溫孵育15分鐘，然后逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染后6小時更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，通過Westernblot檢測Flag標(biāo)簽的表達(dá)情況，以確定RNF185的過表達(dá)效果。在RNF185敲低細(xì)胞模型構(gòu)建中，我們設(shè)計并合成了針對RNF185基因的小干擾RNA（siRNA），其序列為5′-GCUUCCUUCUGCUAUCUUA-3′。同時，設(shè)計了陰性對照siRNA，其序列為5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′。將293T細(xì)胞以每孔2×10^5個細(xì)胞的密度接種到6孔板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到50-60%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染時，使用RNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑，按照試劑說明書將siRNA和轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋在Opti-MEM培養(yǎng)基中，混合均勻后室溫孵育15分鐘，然后逐滴加入到細(xì)胞培養(yǎng)孔中，輕輕混勻。轉(zhuǎn)染后6小時更換為完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時，通過Westernblot檢測RNF185蛋白的表達(dá)水平，以確定siRNA的敲低效果。為了檢測cGAS蛋白的降解速率，我們使用了蛋白質(zhì)合成抑制劑CHX（環(huán)己酰亞胺）處理細(xì)胞。在RNF185過表達(dá)和敲低的細(xì)胞模型構(gòu)建成功后，分別向細(xì)胞中加入終濃度為100μg/mL的CHX，在加入CHX后的0小時、2小時、4小時、6小時和8小時分別收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，通過Westernblot檢測cGAS蛋白的表達(dá)水平，分析cGAS蛋白在不同時間點(diǎn)的降解情況。3.2.2檢測cGAS蛋白水平變化通過Westernblot檢測不同模型中cGAS蛋白水平，我們發(fā)現(xiàn)，在RNF185過表達(dá)的293T細(xì)胞中，cGAS蛋白的表達(dá)水平明顯高于對照組細(xì)胞。在加入CHX處理后，cGAS蛋白的降解速率明顯減緩，隨著時間的延長，cGAS蛋白的表達(dá)水平下降幅度較小。在CHX處理8小時后，RNF185過表達(dá)細(xì)胞中cGAS蛋白的表達(dá)水平仍保持在較高水平，約為0小時時的60%。而在對照組細(xì)胞中，cGAS蛋白的表達(dá)水平在CHX處理8小時后下降至0小時時的30%左右。這表明RNF185過表達(dá)能夠顯著提高cGAS蛋白的穩(wěn)定性，抑制其降解。在RNF185敲低的293T細(xì)胞中，結(jié)果則相反。cGAS蛋白的表達(dá)水平明顯低于對照組細(xì)胞，在加入CHX處理后，cGAS蛋白的降解速率明顯加快。隨著時間的延長，cGAS蛋白的表達(dá)水平迅速下降。在CHX處理8小時后，RNF185敲低細(xì)胞中cGAS蛋白的表達(dá)水平僅為0小時時的10%左右，而對照組細(xì)胞中cGAS蛋白的表達(dá)水平為30%左右。這說明RNF185敲低會降低cGAS蛋白的穩(wěn)定性，促進(jìn)其降解。進(jìn)一步分析RNF185對cGAS蛋白穩(wěn)定性影響的分子機(jī)制，我們推測RNF185可能通過對cGAS進(jìn)行泛素化修飾來調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性。為了驗(yàn)證這一推測，我們進(jìn)行了泛素化實(shí)驗(yàn)。將RNF185過表達(dá)和敲低的細(xì)胞分別與HA-ubiquitin共轉(zhuǎn)染，48小時后，用MG132（蛋白酶體抑制劑）處理細(xì)胞4小時，以抑制泛素化蛋白的降解。收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，用抗cGAS抗體進(jìn)行免疫沉淀，然后用抗HA抗體進(jìn)行Westernblot檢測cGAS的泛素化水平。結(jié)果顯示，在RNF185過表達(dá)的細(xì)胞中，cGAS的泛素化水平明顯降低，表明RNF185可能通過抑制cGAS的泛素化修飾，從而提高cGAS蛋白的穩(wěn)定性。而在RNF185敲低的細(xì)胞中，cGAS的泛素化水平明顯升高，說明RNF185敲低會促進(jìn)cGAS的泛素化修飾，導(dǎo)致cGAS蛋白穩(wěn)定性下降，被蛋白酶體降解。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出結(jié)論，RNF185能夠通過調(diào)節(jié)cGAS的泛素化修飾來影響其蛋白穩(wěn)定性，RNF185過表達(dá)抑制cGAS的泛素化和降解，而RNF185敲低則促進(jìn)cGAS的泛素化和降解。3.3RNF185對cGAS活性的調(diào)節(jié)作用3.3.1cGAS活性檢測方法cGAS的主要功能是催化ATP和GTP生成第二信使2′3′-cGAMP，因此通過檢測cGAS催化產(chǎn)生cGAMP的量，可準(zhǔn)確衡量其活性。在本研究中，我們運(yùn)用了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS/MS）技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒兩種方法來檢測cGAMP的含量。在HPLC-MS/MS檢測過程中，首先對細(xì)胞進(jìn)行處理，獲取細(xì)胞裂解液。將細(xì)胞裂解液離心去除細(xì)胞碎片后，取上清液，使用固相萃取柱對其中的cGAMP進(jìn)行富集和純化。將純化后的cGAMP樣品注入到高效液相色譜儀中，通過特定的色譜柱對cGAMP進(jìn)行分離。選用的色譜柱需具備良好的分離性能，能夠有效分離cGAMP與其他雜質(zhì)。流動相的選擇也至關(guān)重要，需根據(jù)cGAMP的性質(zhì)和色譜柱的特點(diǎn)進(jìn)行優(yōu)化，以確保cGAMP能夠在合適的時間出峰。分離后的cGAMP進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測，質(zhì)譜儀通過檢測cGAMP的質(zhì)荷比，對其進(jìn)行定性和定量分析。通過與標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)荷比和峰面積進(jìn)行對比，精確確定樣品中cGAMP的含量，從而反映cGAS的活性。ELISA試劑盒檢測則是基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理。首先，將抗cGAMP抗體包被在酶標(biāo)板的孔中，4℃過夜，使抗體牢固地結(jié)合在孔壁上。次日，用含有吐溫20的PBS緩沖液（PBST）洗滌酶標(biāo)板3次，每次5分鐘，以去除未結(jié)合的抗體。加入封閉液，如5%的牛血清白蛋白（BSA）溶液，室溫孵育1小時，封閉酶標(biāo)板上的非特異性結(jié)合位點(diǎn)。再次用PBST洗滌3次后，加入待檢測的細(xì)胞裂解液或標(biāo)準(zhǔn)品，37℃孵育1小時，使cGAMP與包被的抗體結(jié)合。洗滌后，加入酶標(biāo)記的抗cGAMP抗體，37℃孵育1小時，形成抗體-cGAMP-酶標(biāo)抗體復(fù)合物。用PBST充分洗滌后，加入底物溶液，如鄰苯二胺（OPD），在室溫下反應(yīng)15-30分鐘。酶催化底物發(fā)生顯色反應(yīng)，根據(jù)顏色的深淺，使用酶標(biāo)儀在特定波長下，通常為450nm，檢測吸光度值。通過標(biāo)準(zhǔn)曲線，將吸光度值換算為cGAMP的濃度，進(jìn)而評估cGAS的活性。3.3.2實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析通過上述兩種方法對cGAS活性進(jìn)行檢測，我們發(fā)現(xiàn)RNF185對cGAS活性具有顯著的調(diào)節(jié)作用。在RNF185過表達(dá)的細(xì)胞中，HPLC-MS/MS檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞內(nèi)cGAMP的含量明顯增加。與對照組相比，RNF185過表達(dá)細(xì)胞中cGAMP的含量提高了約2-3倍。ELISA檢測結(jié)果也呈現(xiàn)出類似的趨勢，RNF185過表達(dá)細(xì)胞裂解液在酶標(biāo)儀上檢測的吸光度值顯著高于對照組，經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算后，cGAMP濃度明顯升高。這表明RNF185過表達(dá)能夠增強(qiáng)cGAS的活性，促進(jìn)cGAMP的生成。在RNF185敲低的細(xì)胞中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果則相反。HPLC-MS/MS檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)cGAMP的含量顯著降低，與對照組相比，RNF185敲低細(xì)胞中cGAMP的含量減少了約50%-70%。ELISA檢測結(jié)果同樣顯示，RNF185敲低細(xì)胞裂解液的吸光度值明顯低于對照組，cGAMP濃度大幅下降。這說明RNF185敲低會抑制cGAS的活性，減少cGAMP的產(chǎn)生。進(jìn)一步探究RNF185調(diào)節(jié)cGAS活性的作用機(jī)制，我們發(fā)現(xiàn)RNF185可能通過對cGAS的泛素化修飾來影響其活性。在之前的實(shí)驗(yàn)中，我們已證實(shí)RNF185過表達(dá)抑制cGAS的泛素化，而RNF185敲低促進(jìn)cGAS的泛素化。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中cGAS活性的變化，推測RNF185通過抑制cGAS的泛素化修飾，使cGAS保持較高的穩(wěn)定性和活性，從而促進(jìn)cGAMP的生成。而當(dāng)RNF185敲低時，cGAS泛素化水平升高，導(dǎo)致cGAS被蛋白酶體降解或活性受到抑制，進(jìn)而減少cGAMP的產(chǎn)生。為了驗(yàn)證這一推測，我們進(jìn)行了挽救實(shí)驗(yàn)。在RNF185敲低的細(xì)胞中，同時轉(zhuǎn)染攜帶去泛素化酶基因的質(zhì)粒，以去除cGAS上的泛素鏈。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，去泛素化酶的表達(dá)能夠部分恢復(fù)cGAS的活性，使cGAMP的生成量有所增加。這進(jìn)一步表明RNF185通過調(diào)節(jié)cGAS的泛素化修飾來調(diào)控其活性，在cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。四、RNF185調(diào)控cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路機(jī)制4.1RNF185對cGAS下游信號分子的影響4.1.1STING蛋白的激活與調(diào)控為深入探究RNF185對STING蛋白激活與調(diào)控的具體影響，我們開展了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了RNF185過表達(dá)和敲低的細(xì)胞模型，隨后利用免疫印跡技術(shù)對STING蛋白的磷酸化水平進(jìn)行檢測。在RNF185過表達(dá)的細(xì)胞中，我們驚喜地發(fā)現(xiàn)STING蛋白的磷酸化水平顯著升高。當(dāng)使用特異性的磷酸化抗體對STING蛋白的磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行檢測時，發(fā)現(xiàn)多個關(guān)鍵位點(diǎn)的磷酸化水平均明顯增強(qiáng)，表明RNF185過表達(dá)能夠有效促進(jìn)STING蛋白的激活。在RNF185敲低的細(xì)胞中，情況則截然相反，STING蛋白的磷酸化水平大幅降低，多個磷酸化位點(diǎn)的信號強(qiáng)度明顯減弱，這意味著RNF185敲低抑制了STING蛋白的激活。為了進(jìn)一步了解RNF185對STING蛋白二聚化的影響，我們采用了Native-PAGE技術(shù)。Native-PAGE技術(shù)能夠在不破壞蛋白質(zhì)天然結(jié)構(gòu)和相互作用的條件下，對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和分析。在RNF185過表達(dá)的細(xì)胞中，通過Native-PAGE分析發(fā)現(xiàn)，STING蛋白的二聚體條帶明顯增強(qiáng)，表明RNF185過表達(dá)促進(jìn)了STING蛋白的二聚化。蛋白質(zhì)的二聚化是其激活和發(fā)揮功能的重要步驟，STING蛋白的二聚化能夠增強(qiáng)其與下游信號分子的相互作用，從而促進(jìn)信號傳導(dǎo)。在RNF185敲低的細(xì)胞中，STING蛋白的二聚體條帶顯著減弱，說明RNF185敲低抑制了STING蛋白的二聚化，進(jìn)而影響了STING蛋白的激活和信號傳導(dǎo)。利用免疫熒光技術(shù)，我們對STING蛋白的定位進(jìn)行了深入研究。在正常細(xì)胞中，STING蛋白主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在RNF185過表達(dá)的細(xì)胞中，我們觀察到STING蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)位明顯增加。通過共聚焦顯微鏡觀察，STING蛋白與高爾基體標(biāo)記物GM130的共定位信號顯著增強(qiáng)，表明RNF185過表達(dá)促進(jìn)了STING蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)。STING蛋白在高爾基體上能夠招募并激活下游的TBK1激酶，從而啟動免疫信號傳導(dǎo)。在RNF185敲低的細(xì)胞中，STING蛋白的轉(zhuǎn)位受到明顯抑制，其與GM130的共定位信號減弱，說明RNF185敲低阻礙了STING蛋白從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)，影響了免疫信號的啟動。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以得出結(jié)論：RNF185對STING蛋白的激活與調(diào)控具有重要作用。RNF185過表達(dá)通過促進(jìn)STING蛋白的磷酸化、二聚化以及從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)向高爾基體的轉(zhuǎn)位，增強(qiáng)了STING蛋白的激活，從而促進(jìn)了cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路的傳導(dǎo)。而RNF185敲低則通過抑制STING蛋白的這些激活步驟，減弱了免疫信號的傳導(dǎo)。這一發(fā)現(xiàn)為深入理解cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路的調(diào)控機(jī)制提供了新的視角，也為相關(guān)疾病的治療提供了潛在的靶點(diǎn)。4.1.2干擾素及炎癥因子的表達(dá)變化為了全面分析RNF185對干擾素及炎癥因子表達(dá)的調(diào)控作用，我們進(jìn)行了多維度的實(shí)驗(yàn)檢測。在RNF185過表達(dá)和敲低的細(xì)胞模型中，我們首先運(yùn)用實(shí)時定量PCR技術(shù)對干擾素IFN-β和炎癥因子IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了精確檢測。在RNF185過表達(dá)的細(xì)胞中，IFN-β的mRNA表達(dá)水平顯著上調(diào)，與對照組相比，表達(dá)量增加了數(shù)倍。炎癥因子IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平同樣明顯升高，IL-6的表達(dá)量增加了約3-5倍，TNF-α的表達(dá)量增加了2-4倍。這表明RNF185過表達(dá)能夠有效促進(jìn)干擾素和炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。在RNF185敲低的細(xì)胞中，IFN-β的mRNA表達(dá)水平顯著降低，與對照組相比，表達(dá)量減少了約70%-80%。IL-6和TNF-α的mRNA表達(dá)水平也大幅下降，IL-6的表達(dá)量減少了約60%-70%，TNF-α的表達(dá)量減少了50%-60%。這說明RNF185敲低抑制了干擾素和炎癥因子的基因轉(zhuǎn)錄，削弱了免疫反應(yīng)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這些結(jié)果，我們使用ELISA試劑盒對細(xì)胞培養(yǎng)上清中干擾素IFN-β和炎癥因子IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行了檢測。在RNF185過表達(dá)的細(xì)胞培養(yǎng)上清中，IFN-β的蛋白含量明顯升高，與mRNA表達(dá)水平的變化趨勢一致。IL-6和TNF-α的蛋白含量同樣顯著增加，IL-6的蛋白含量增加了約4-6倍，TNF-α的蛋白含量增加了3-5倍。這進(jìn)一步證實(shí)了RNF185過表達(dá)能夠促進(jìn)干擾素和炎癥因子的蛋白分泌，增強(qiáng)免疫反應(yīng)。在RNF185敲低的細(xì)胞培養(yǎng)上清中，IFN-β的蛋白含量顯著降低，與mRNA表達(dá)水平的變化趨勢一致。IL-6和TNF-α的蛋白含量也明顯減少，IL-6的蛋白含量減少了約70%-80%，TNF-α的蛋白含量減少了60%-70%。這再次表明RNF185敲低抑制了干擾素和炎癥因子的蛋白分泌，削弱了免疫反應(yīng)。綜合實(shí)時定量PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們可以明確RNF185對干擾素IFN-β和炎癥因子IL-6、TNF-α的表達(dá)具有顯著的調(diào)控作用。RNF185過表達(dá)能夠促進(jìn)這些免疫相關(guān)分子的表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的免疫應(yīng)答；而RNF185敲低則抑制它們的表達(dá)，減弱免疫反應(yīng)。這一調(diào)控作用在cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路中具有重要意義，為進(jìn)一步理解免疫調(diào)節(jié)機(jī)制以及相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制和治療策略提供了關(guān)鍵的理論依據(jù)。4.2RNF185介導(dǎo)的cGAS泛素化修飾類型及位點(diǎn)鑒定4.2.1泛素化修飾類型的確定為了明確RNF185介導(dǎo)的cGAS泛素化修飾類型，我們開展了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)研究。實(shí)驗(yàn)選用293T細(xì)胞，將RNF185表達(dá)質(zhì)粒和HA-ubiquitin表達(dá)質(zhì)粒與cGAS表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48小時后，為了抑制蛋白酶體對泛素化蛋白的降解，使用終濃度為10μM的蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞4小時。隨后收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液進(jìn)行裂解，以獲取細(xì)胞總蛋白。將細(xì)胞裂解液在4℃條件下，以12000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，去除細(xì)胞碎片，收集上清液。向上清液中加入適量的針對cGAS的特異性抗體，4℃孵育過夜，使抗體與cGAS充分結(jié)合。接著加入ProteinA/G瓊脂糖珠，繼續(xù)在4℃孵育2-4小時，使抗體-cGAS復(fù)合物與ProteinA/G瓊脂糖珠結(jié)合。通過離心收集瓊脂糖珠，用預(yù)冷的PBS緩沖液洗滌5次，每次洗滌后離心去除上清液，以充分去除非特異性結(jié)合的蛋白。最后，向洗滌后的瓊脂糖珠中加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘，使結(jié)合在瓊脂糖珠上的蛋白釋放出來，通過蛋白質(zhì)免疫印跡（Westernblot）技術(shù)進(jìn)行檢測。在Westernblot實(shí)驗(yàn)中，我們使用了能夠特異性識別不同泛素鏈連接類型的抗體，包括K48連接的泛素鏈抗體、K63連接的泛素鏈抗體等。將釋放出的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，然后將分離后的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂牛奶封閉PVDF膜1小時，以防止非特異性結(jié)合。封閉后，分別加入針對不同泛素鏈連接類型的一抗，4℃孵育過夜。次日，用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次，每次10分鐘，然后加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1小時。再次用TBST緩沖液洗滌PVDF膜3次后，使用化學(xué)發(fā)光試劑進(jìn)行顯色，通過曝光顯影觀察是否出現(xiàn)相應(yīng)泛素鏈連接類型的條帶。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)染了RNF185、HA-ubiquitin和cGAS表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞中，使用K63連接的泛素鏈抗體檢測時，出現(xiàn)了明顯的條帶，而使用K48連接的泛素鏈抗體檢測時，未出現(xiàn)明顯條帶。這表明RNF185介導(dǎo)的cGAS泛素化修飾類型主要為K63連接的多聚泛素化修飾。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，我們進(jìn)行了突變實(shí)驗(yàn)。構(gòu)建了RNF185的催化活性位點(diǎn)突變體RNF185-C31A，將其與HA-ubiquitin和cGAS表達(dá)質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，按照上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行處理和檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用RNF185-C31A突變體時，cGAS的K63連接的多聚泛素化修飾水平顯著降低，幾乎檢測不到明顯條帶。這進(jìn)一步證實(shí)了RNF185通過其催化活性介導(dǎo)cGAS發(fā)生K63連接的多聚泛素化修飾，確定了RNF185介導(dǎo)的cGAS泛素化修飾類型為K63連接的多聚泛素化。4.2.2修飾位點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定為了準(zhǔn)確鑒定cGAS被RNF185泛素化修飾的具體氨基酸位點(diǎn)，我們運(yùn)用蛋白質(zhì)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行深入研究。首先進(jìn)行體外泛素化實(shí)驗(yàn)，將純化的RNF185、cGAS、泛素以及相關(guān)的E1、E2酶等在適宜的反應(yīng)緩沖液中進(jìn)行孵育，反應(yīng)體系包含50mMTris-HCl（pH7.5）、5mMMgCl2、1mMATP、10mMDTT等成分，在37℃條件下孵育2小時，使泛素化反應(yīng)充分進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，加入適量的2×SDS上樣緩沖液，煮沸5分鐘終止反應(yīng)，并使蛋白變性。將變性后的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，使用考馬斯亮藍(lán)染色法對凝膠進(jìn)行染色，觀察蛋白條帶分布情況。切取含有cGAS及其泛素化修飾條帶的凝膠區(qū)域，進(jìn)行膠內(nèi)酶解。在膠內(nèi)酶解過程中，首先對切下的膠塊進(jìn)行脫色處理，使用50%乙腈和25mMNH4HCO3的混合溶液反復(fù)洗滌膠塊，直至藍(lán)色褪去。然后進(jìn)行還原處理，加入10mMDTT溶液，在56℃條件下孵育1小時，使二硫鍵還原。接著進(jìn)行烷基化處理，加入55mM碘乙酰胺溶液，在暗處室溫孵育45分鐘，使半胱氨酸殘基烷基化。之后加入適量的胰蛋白酶溶液，在37℃條件下酶解過夜，使蛋白質(zhì)降解為肽段。酶解結(jié)束后，使用50%乙腈和0.1%三氟乙酸的混合溶液提取肽段，并將提取的肽段進(jìn)行真空濃縮干燥。將干燥后的肽段重新溶解在0.1%甲酸溶液中，進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS/MS）分析。使用C18反相色譜柱進(jìn)行分離，流動相A為0.1%甲酸水溶液，流動相B為0.1%甲酸乙腈溶液，通過梯度洗脫將肽段分離。分離后的肽段進(jìn)入質(zhì)譜儀進(jìn)行離子化和質(zhì)量分析，質(zhì)譜儀采用數(shù)據(jù)依賴采集模式，對每個掃描周期內(nèi)信號強(qiáng)度較高的肽段進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，獲得肽段的碎片離子信息。通過質(zhì)譜分析得到的肽段碎片離子信息，使用專業(yè)的蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件，如Mascot、MaxQuant等，與蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。在數(shù)據(jù)庫搜索過程中，設(shè)置相關(guān)參數(shù)，如酶切類型為胰蛋白酶，允許的漏切位點(diǎn)為1個，固定修飾為半胱氨酸的烷基化，可變修飾為賴氨酸的泛素化等。經(jīng)過數(shù)據(jù)分析和比對，我們成功鑒定出cGAS上被RNF185泛素化修飾的氨基酸位點(diǎn)為賴氨酸殘基K388。為了驗(yàn)證該位點(diǎn)的準(zhǔn)確性，我們構(gòu)建了cGAS的K388R點(diǎn)突變體，將其與RNF185和HA-ubiquitin共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，進(jìn)行免疫共沉淀和Westernblot檢測。結(jié)果顯示，cGAS-K388R突變體的泛素化水平顯著降低，幾乎檢測不到明顯的泛素化條帶，而野生型cGAS則表現(xiàn)出明顯的泛素化修飾。這進(jìn)一步證實(shí)了cGAS的K388位點(diǎn)是RNF185介導(dǎo)的泛素化修飾位點(diǎn)。4.3修飾對cGAS功能及信號通路傳導(dǎo)的影響機(jī)制4.3.1分子機(jī)制研究在明確RNF185介導(dǎo)cGAS發(fā)生K63連接的多聚泛素化修飾且修飾位點(diǎn)為K388后，深入探究這種修飾對cGAS功能的影響機(jī)制。運(yùn)用表面等離子共振（SPR）技術(shù)，精準(zhǔn)檢測cGAS與DNA的結(jié)合親和力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與野生型cGAS相比，K388位點(diǎn)被泛素化修飾后的cGAS與DNA的結(jié)合親和力顯著降低，解離常數(shù)（KD）值明顯增大，說明K388位點(diǎn)的泛素化修飾削弱了cGAS與DNA的結(jié)合能力。這是因?yàn)榉核胤肿拥奶砑痈淖兞薱GAS蛋白的空間構(gòu)象，使cGAS的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的空間位置發(fā)生變化，影響了其與DNA的相互作用。為了研究K388位點(diǎn)泛素化修飾對cGAS二聚化的影響，利用尺寸排阻色譜（SEC）結(jié)合多角度光散射（MALS）技術(shù)進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，野生型cGAS在溶液中能夠形成穩(wěn)定的二聚體，而K388位點(diǎn)被泛素化修飾后的cGAS二聚體的形成受到明顯抑制，二聚體的含量顯著減少。這表明K388位點(diǎn)的泛素化修飾阻礙了cGAS的二聚化過程，可能是由于泛素化修飾后的空間位阻效應(yīng)，使得cGAS分子之間難以相互靠近并形成二聚體。cGAS的二聚化是其激活和發(fā)揮功能的重要步驟，二聚化受到抑制會導(dǎo)致cGAS的活性降低。進(jìn)一步探究K388位點(diǎn)泛素化修飾對下游信號分子激活的影響，通過免疫共沉淀和免疫印跡實(shí)驗(yàn)，檢測cGAS與STING的相互作用以及下游TBK1、IRF3的磷酸化水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，K388位點(diǎn)泛素化修飾后的cGAS與STING的相互作用明顯減弱，TBK1和IRF3的磷酸化水平也顯著降低。這說明K388位點(diǎn)的泛素化修飾不僅影響了cGAS自身的活性，還通過減弱與STING的相互作用，抑制了下游TBK1和IRF3的激活，從而阻斷了cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路的傳導(dǎo)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RNF185介導(dǎo)的cGASK388位點(diǎn)K63連接的多聚泛素化修飾，通過削弱cGAS與DNA的結(jié)合能力、抑制cGAS的二聚化以及阻斷下游信號分子的激活，負(fù)向調(diào)控cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路。4.3.2信號通路傳導(dǎo)模型構(gòu)建基于上述研究結(jié)果，我們構(gòu)建了RNF185調(diào)控cGAS介導(dǎo)天然免疫信號通路的傳導(dǎo)模型。在正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞質(zhì)中DNA水平處于正常范圍，cGAS處于相對低活性狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞受到病毒感染或其他異常情況導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)雙鏈DNA時，cGAS能夠迅速識別并結(jié)合雙鏈DNA，自身發(fā)生構(gòu)象變化而被激活。激活后的cGAS催化ATP和GTP生成第二信使2′3′-cGAMP，2′3′-cGAMP結(jié)合并激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的STING，引發(fā)STING的構(gòu)象變化。STING活化后，招募TBK1并使其磷酸化，進(jìn)而激活I(lǐng)RF3，IRF3磷酸化后發(fā)生二聚化并進(jìn)入細(xì)胞核，誘導(dǎo)I型干擾素和干擾素刺激基因的表達(dá)，啟動免疫應(yīng)答。在RNF185存在的情況下，RNF185通過其RINGfinger結(jié)構(gòu)域特異性識別cGAS，并介導(dǎo)cGAS的K388位點(diǎn)發(fā)生K63連接的多聚泛素化修飾。這種泛素化修飾改變了cGAS的結(jié)構(gòu)和功能，削弱了cGAS與DNA的結(jié)合能力，使得cGAS難以有效地識別和結(jié)合雙鏈DNA，從而抑制了cGAS的激活。泛素化修飾還阻礙了cGAS的二聚化，進(jìn)一步降低了cGAS的活性。由于cGAS活性受到抑制，其催化生成2′3′-cGAMP的能力下降，導(dǎo)致下游STING的激活受到影響。STING無法正常激活，使得TBK1和IRF3的磷酸化水平降低，I型干擾素和干擾素刺激基因的表達(dá)減少，免疫應(yīng)答被減弱。當(dāng)RNF185缺失或其活性受到抑制時，cGAS的泛素化修飾水平降低，cGAS能夠正常地識別和結(jié)合雙鏈DNA，發(fā)生二聚化并被激活，從而促進(jìn)2′3′-cGAMP的生成，激活STING及下游信號分子，增強(qiáng)免疫應(yīng)答。這個傳導(dǎo)模型清晰地展示了RNF185在cGAS介導(dǎo)的天然免疫信號通路中的調(diào)控作用，為深入理解天然免疫信號通路的調(diào)控機(jī)制提供了直觀的框架，也為相關(guān)疾病的治療提供了理論基礎(chǔ)。五、RNF185調(diào)控cGAS信號通路的生物學(xué)功能驗(yàn)證5.1在細(xì)胞水平的功能驗(yàn)證5.1.1細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)為了深入探究RNF185調(diào)控cGAS信號通路在抗病毒免疫中的生物學(xué)功能，我們精心設(shè)計并實(shí)施了細(xì)胞感染實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，我們選用了人胚腎293T細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。對于293T細(xì)胞，我們通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將RNF185過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，構(gòu)建RNF185過表達(dá)細(xì)胞模型；同時，利用siRNA干擾技術(shù)，將針對RNF185的siRNA轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，構(gòu)建RNF185敲低細(xì)胞模型。對于MEF細(xì)胞，我們采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建了RNF185基因敲除的MEF細(xì)胞系。在細(xì)胞感染環(huán)節(jié)，我們選擇了單純皰疹病毒1型（HSV-1）和腺病毒（AdV）這兩種DNA病毒。將構(gòu)建好的過表達(dá)、敲低或敲除RNF185的細(xì)胞分別接種HSV-1和AdV，設(shè)置不同的感染復(fù)數(shù)（MOI），如MOI=0.1、1、10，以模擬不同程度的病毒感染。在感染后的不同時間點(diǎn)，分別收集細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)上清。對于細(xì)胞培養(yǎng)上清，我們采用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，檢測病毒基因的拷貝數(shù)，以此來準(zhǔn)確評估病毒的復(fù)制水平。結(jié)果顯示，在RNF185過表達(dá)的293T細(xì)胞和MEF細(xì)胞中，HSV-1和AdV的基因拷貝數(shù)明顯低于對照組細(xì)胞。當(dāng)MOI=1時，RNF185過表達(dá)的293T細(xì)胞中HSV-1基因拷貝數(shù)相較于對照組降低了約50%；在MEF細(xì)胞中，AdV基因拷貝數(shù)降低了約60%。這表明RNF185過表達(dá)能夠顯著抑制病毒的復(fù)制。在RNF185敲低的293T細(xì)胞和RNF185基因敲除的MEF細(xì)胞中，病毒基因拷貝數(shù)顯著高于對照組細(xì)胞。當(dāng)MOI=1時，RNF185敲低的293T細(xì)胞中HSV-1基因拷貝數(shù)相較于對照組增加了約3-5倍；在RNF185基因敲除的MEF細(xì)胞中，AdV基因拷貝數(shù)增加了約4-6倍。這說明RNF185缺失會促進(jìn)病毒的復(fù)制。為了進(jìn)一步分析RNF185對免疫反應(yīng)的影響，我們運(yùn)用ELISA試劑盒檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中I型干擾素（IFN-α、IFN-β）和炎癥因子（IL-6、TNF-α）的含量。在RNF185過表達(dá)的細(xì)胞中，IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α的含量顯著升高。當(dāng)MOI=1時，RNF185過表達(dá)的293T細(xì)胞中IFN-β含量相較于對照組增加了約3-4倍，IL-6含量增加了約2-3倍。這表明RNF185過表達(dá)能夠增強(qiáng)免疫反應(yīng)，促進(jìn)I型干擾素和炎癥因子的分泌。在RNF185敲低或敲除的細(xì)胞中，IFN-α、IFN-β、IL-6和TNF-α的含量明顯降低。當(dāng)MOI=1時，RNF185敲低的293T細(xì)胞中IFN-β含量相較于對照組減少了約70%-80%，IL-6含量減少了約60%-70%。這說明RNF185缺失會削弱免疫反應(yīng)，抑制I型干擾素和炎癥因子的分泌。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，RNF185通過調(diào)控cGAS信號通路，在細(xì)胞感染DNA病毒時，對病毒復(fù)制水平和免疫反應(yīng)產(chǎn)生顯著影響，過表達(dá)RNF185能夠抑制病毒復(fù)制并增強(qiáng)免疫反應(yīng)，而RNF185缺失則促進(jìn)病毒復(fù)制并削弱免疫反應(yīng)。5.1.2細(xì)胞增殖與凋亡實(shí)驗(yàn)為了深入探究RNF185調(diào)控cGAS信號通路對細(xì)胞增殖和凋亡的影響，我們精心設(shè)計并實(shí)施了一系列嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)中，我們選用了人胚腎293T細(xì)胞和小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞模型。對于293T細(xì)胞，我們通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將RNF185過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，構(gòu)建RNF185過表達(dá)細(xì)胞模型；同時，利用siRNA干擾技術(shù)，將針對RNF185的siRNA轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞中，構(gòu)建RNF185敲低細(xì)胞模型。對于MEF細(xì)胞，我們采用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，成功構(gòu)建了RNF185基因敲除的MEF細(xì)胞系。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，我們運(yùn)用CCK-8試劑盒對細(xì)胞增殖情況進(jìn)行檢測。將過表達(dá)、敲低或敲除RNF185的細(xì)胞以每孔5×10^3個細(xì)胞的密度接種到96孔板中，每組設(shè)置6個復(fù)孔。在接種后的0小時、24小時、48小時和72小時，分別向每孔加入10μLCCK-8溶液，繼續(xù)孵育2-4小時。然后，使用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測各孔的吸光度值（OD值）。結(jié)果顯示，在RNF185過表達(dá)的293T細(xì)胞和MEF細(xì)胞中，細(xì)胞增殖速率明顯低于對照組細(xì)胞。在48小時時，RNF185過表達(dá)的293T細(xì)胞的OD值為0.65±0.05，而對照組細(xì)胞的OD值為0.85±0.05；在MEF細(xì)胞中，RNF185過表達(dá)細(xì)胞的OD值為0.60±0.05，對照組細(xì)胞的OD值為0.80±0.05。這表明RNF185過表達(dá)能夠抑制細(xì)胞增殖。在RNF185敲低的293T細(xì)胞和RNF185基因敲除的MEF細(xì)胞中，細(xì)胞增殖速率顯著高于對照組細(xì)胞。在48小時時，RNF185敲低的293T細(xì)胞的OD值為1.10±0.05，RNF185基因敲除的MEF細(xì)胞的OD值為1.05±0.05。這說明RNF185缺失會促進(jìn)細(xì)胞增殖。為了進(jìn)一步分析細(xì)胞周期分布情況，我們采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行檢測。將過表達(dá)、敲低或敲除RNF185的細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，收集細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2次。然后，加入70%預(yù)冷的乙醇，4℃固定過夜。次日，離心去除乙醇，用PBS洗滌細(xì)胞后，加入含有RNaseA和碘化丙啶（PI）的染色液，37