核酸分子雜交核酸分子雜交是指具有一定同源序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基互補配對原則退火形成異質(zhì)雙鏈的過程,即來源不同的兩條單鏈核酸分子通過堿基互補可形成異源雙螺旋，稱為核酸分子雜交(hybridization)。具有靈敏度高、特異性強等優(yōu)點，主要用于特異DNA或RNA的定性、定量檢測。

第一節(jié)

核酸分子雜交的基本原理

DNA和DNA鏈、RNA與DNA鏈或兩條RNA鏈之間，只要具有一定的互補序列均可在適當?shù)臈l件下發(fā)生雜交。常用已知的DNA或RNA的片段作為探針，包括特異的DNA序列，或轉(zhuǎn)錄的RNA序列或cDNA序列，或人工合成的寡核苷酸片段。根據(jù)支持物的不同，分為固相雜交和液相雜交。固相雜交又包括膜上印跡雜交和細胞原位雜交兩種。膜上印跡雜交即將核酸從細胞中分離純化后，在體外與探針雜交，細胞原位雜交是在細胞內(nèi)進行的雜交。一、雜交的穩(wěn)定性（表7-1）Tm是核酸雙鏈解鏈成單鏈過程中，其克原子消光系數(shù)

(P)值的增加達到最高值一半時的溫度。不同雜交雙鏈其Tm值不同，影響因素有：(1)雜交鏈GC含量愈高的雜交雙鏈其Tm值愈高。(2)

雜交鏈愈長其Tm值愈高。(3)

雜交雙鏈的堿基錯配程度。(4)

溶液的離子強度越大，Tm值愈高。變性劑可影響堿基堆積力和氫鍵的形成，可降低Tm值，常用甲酰胺、脲及二甲基亞砜等。用50%的甲酰胺大約可使雜交雙鏈的Tm值降低30℃。

二、雜交動力學(xué)雜交過程的第一步是兩條核酸單鏈隨機碰撞形成局部雙鏈，如果此局部雙鏈周圍的堿基不配對則會重新解離，繼續(xù)碰撞，一旦找到正確的互補區(qū)，兩側(cè)的序列迅速配對形成完整的雙鏈分子，后一步反應(yīng)是一個自發(fā)過程。影響因素主要有：(1)

探針濃度、長度和復(fù)雜性探針濃度越高，復(fù)性速度越快。探針越長，擴散速度越慢，復(fù)雜性越高，配對難度越大。(2)

離子強度高離子強度溶液中，其正離子可中和DNA鏈磷酸基團的負電荷，消除其間的靜電斥力，有利于雜交分子的形成。(3)

溫度通常雜交溫度在低于Tm20~25℃溫度下進行。不含變性劑甲酰胺時，大多數(shù)雜交反應(yīng)在68℃進行。當含50%甲酰胺時，在42℃進行。寡核苷酸探針一般在低于Tm值5℃~10℃下進行。(4)

雜交促進劑用硫酸葡聚糖，其微粒的表面可以吸附DNA探針分子，使接觸面積增大，有利于雜交反應(yīng)。(5)

雜交條件的嚴謹性所謂嚴謹性(stringency)，是指雜交反應(yīng)體系，避免非同源性或部分同源性的核酸序列形成雜交復(fù)合物的嚴格程度。反應(yīng)溫度升高，離子強度降低，會增加反應(yīng)的嚴謹性，適用于匹配好的或序列完全同源的核酸的雜交反應(yīng)，或用于檢測點突變；反之，則適用于匹配差或序列不完全同源的核酸雜交反應(yīng)。第二節(jié)核酸探針核酸探針是指帶有放射性同位素、生物素或其他活性物質(zhì)標記的某種特定的DNA或RNA片段。一、核酸探針的類型㈠基因組DNA探針用克隆化的基因片段作探針應(yīng)盡可能選用基因的編碼序列(外顯子)。㈡cDNA探針與mRNA互補的DNA鏈稱cDNA，特異性高，是一種較理想的核酸探針。㈢RNA探針RNA探針有下述優(yōu)點：①雜交體的穩(wěn)定性高，雜交反應(yīng)條件嚴格，特異性更高。②RNA單鏈不存在雙鏈DNA探針的互補雙鏈的復(fù)性，雜交效率較高。③RNA無高度重復(fù)序列，非特異雜交少。④雜交后用RNase消化未雜交的RNA探針，可降低雜交本底。㈣寡核苷酸探針寡核苷酸探針是由實驗者設(shè)計、經(jīng)核苷酸合成儀人工合成的。1.探針制備方便，可以根據(jù)需要設(shè)計合成各種寡核苷酸片段，從基因組DNA文庫或cDNA文庫中篩選特定的克隆。2.非常適用于檢測已知序列基因中的點突變或定點誘變技術(shù)產(chǎn)生的點突變。3.用新的酶促方法標記可以得到高比活度標記探針。二、標記物標記物與探針的結(jié)合不影響雜交的特異性和穩(wěn)定性。㈠放射性同位素放射性同位素探針標記物，有高度特異性，缺點是易造成放射性污染，半衰期較短，不能長期存放。常用的有32P、3H、35S，有時也用14C、125I或131I。㈡非放射性標記物(1)

半抗原(2)

配體(3)

熒光素(4)

化學(xué)發(fā)光技術(shù)三、探針放射性同位素標記法㈠放射性同位素的選擇

32P、35S或3H均可用于標記DNA或RNA。32P最常用于核酸的標記。35S適用于原位雜交和DNA序列測定。3H放射比活度低，故常用于原位雜交。㈡核酸探針的標記方法⒈缺口平移法(圖7-1)

大腸桿菌DNA聚合酶I具有5′

3′DNA聚合酶活性，以相對應(yīng)的鏈為模板，從切口處3′-OH端逐個加入新的核苷酸，此酶還具有5′

3′外切核酸酶活性，可從切口的5′端逐個切去核苷酸，造成切口平移。若反應(yīng)體系中存在一種或多種標記的核苷酸，如[

-32P]dNTP，則隨著反應(yīng)的進行，這些標記的核苷酸將置換原有的核苷酸，制備出核素標記的DNA探針。缺口平移法適用于標記大于1kb的雙鏈DNA。⒉隨機引物法(圖7-2)

隨機引物法的基本原理是DNA聚合酶可利用隨機引物，沿單鏈模板進行DNA的合成。⒊末端標記只將DNA3′端或5′端標記的方法稱末端標記，常用的方法如下：(1)

DNA聚合酶IKlenow片段末端標記法(圖7-3)。用該酶將含有核素標記的dNTP補平切口或粘性末端。(2)

T4DNA聚合酶標記法。加入dNTP后抑制外切活性可將標記的dNTP進行填充標記。(3)

T4多核苷酸激酶標記法。用該酶可將

-32P從[

-32P]ATP轉(zhuǎn)移至核酸的5′-OH端(4)

末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記法。將多種標記的dNTP逐個轉(zhuǎn)移到核酸缺口中的3′-OH端，形成長尾標記。㈢放射自顯影檢測雜交信號利用放射線在X線片的成影作用來檢測雜交信號，稱為放射自顯影。這種方法的操作步驟如下：(1)

將濾膜用保鮮膜包好，置于暗盒中。(2)

在暗室中，將磷鎢酸鈣增感屏前屏置濾膜上，光面向上，壓1~2張X線片，而后再壓上增感屏后屏，光面向X線片，蓋上暗盒，置于70℃，曝光適當?shù)臅r間。(3)

根據(jù)放射線的強度曝光一定的時間后，在暗室里取出X線片，顯影定影。如曝光不足，可再壓片重新曝光。㈠生物素標記生物素能以共價結(jié)合方式連接到UTP或dUTP的嘧啶環(huán)C5位置上，形成生物素化的核苷酸(圖7-4)。1.摻入標記法：生物素標記的dNTP可代替相應(yīng)的單核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，通過隨機引物法或缺口平移法，將生物素化核苷酸摻入到DNA分子中，獲得生物素標記的DNA探針。2.

光敏生物素標記法：先通過連接臂將一個光敏基團連接于生物素，成為光敏生物素(photobiotin)，如圖7-5。㈡半抗原地高辛配基標記方法將Dig與dUTP(或dCTP，dCTP)相連生成Dig-dUTP復(fù)合物，再通過切口平移法和隨機引物法將其摻入到DNA上(圖7-6)。㈢非放射性核酸探針的檢測非放射性同位素標記的探針，除酶直接標記探針外，其它非放射性標記物并不能被直接檢測，需先將非放射性標記物與檢測系統(tǒng)偶聯(lián)，再顯色。⒈偶聯(lián)反應(yīng)：大多數(shù)非放射性標記物是半抗原(如地高辛)，因此可以通過抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)與顯色體系偶聯(lián)：Dig-DNA探針+抗Dig抗體-堿性磷酸酶(或辣根過氧化物酶)+底物(BCIP和NBT)；生物素可與抗生物素蛋白(卵白素，avidin)或鏈親合素(streptavidin)結(jié)合，再與顯色體系相偶聯(lián)。⒉顯色反應(yīng)：通過連接在抗體或抗生物素蛋白上的顯色物質(zhì)(如酶、熒光素等)進行雜交信號的檢測。堿性磷酸酶可使其底物BCIP脫磷并聚合，在此過程中釋放出的氫可使NBT(四氮唑藍)還原而形成紫色的化合物(圖7-7)。第三節(jié)核酸分子雜交技術(shù)在液體中進行雜交反應(yīng)稱為液相雜交；在固相支持物上進行雜交則稱為固相雜交。固相雜交包括膜上印跡雜交和細胞原位雜交兩類。固相雜交是印跡技術(shù)及雜交信號檢測技術(shù)等相結(jié)合，從而獲得清晰的雜交圖譜，有利于定性或定量分析待測核酸樣品中的特定片段(靶序列)，在核酸的結(jié)構(gòu)和功能研究以及基因工程研究中，其應(yīng)用比液相雜交更為廣泛，其技術(shù)發(fā)展也更為迅速。一、膜上印跡雜交膜上印跡雜交是指將待測核酸序列結(jié)合到一定的支持物上，然后與存在于液相中的核酸探針進行雜交的過程，是目前最常用的一種核酸分子雜交方法。㈠濾膜雜交的基本過程如圖7-8所示。(1)

核酸的制備(2)

電泳(3)

印跡(4)

預(yù)雜交(5)

雜交(6)

洗膜(7)

檢測㈡固相支持物的選擇一種良好的固相支持物應(yīng)具備以下幾個特點：(1)

具有較強的結(jié)合核酸分子的能力，一(2)

與核酸分子結(jié)合后應(yīng)不影響其與探針分子的雜交反應(yīng)。(3)

與核酸分子的結(jié)合穩(wěn)定牢固，(4)

非特異性吸附少。(5)

具有良好的機械性能。下面介紹幾種常用的固相支持物：(1)

硝酸纖維素膜：特別適用于蛋白質(zhì)(如抗體和酶等)的非放射性標記探針的雜交體系。(2)

尼龍膜(nylonmembrane)：尼龍膜結(jié)合單鏈及雙鏈DNA和RNA的能力較硝酸纖維素膜更強，耐堿處理適合于一步法的菌落原位印跡法。尼龍膜的缺點是不宜使用非同位素探針，即使用各種蛋白(如BSA、牛奶等)進行預(yù)雜交，產(chǎn)生的雜交信號本底較高，與非特異吸附有關(guān)。PVDF膜：比尼龍膜結(jié)合力更強，且在預(yù)雜交中很容易被封閉，使用同位素和非同位素探針都可產(chǎn)生較淺的本底，而且結(jié)實耐用，可以多次雜交。㈢印跡方法⒈虹吸印跡法(圖7-9)

利用毛細管的虹吸作用由轉(zhuǎn)移緩沖液帶動核酸分子轉(zhuǎn)移至濾膜上。⒉真空轉(zhuǎn)移法(圖7-10)

其原理是利用真空泵將轉(zhuǎn)移緩沖液從上層容器中通過凝膠抽到下層真空室中，同時帶動核酸分子轉(zhuǎn)移到凝膠下面的濾膜上。該法的最大優(yōu)點是快速，轉(zhuǎn)膜的同時進行DNA的變性和中和，整個過程只需1h左右。⒊電轉(zhuǎn)法如圖7-11所示。㈣印跡類型Southern印跡雜交法(Southernblothybridization)(圖7-12)。2.Northern印跡雜交(Northernblothybridization)：

Northern雜交是將RNA樣品變性和通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，再轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜等固相載體上，用標記的DNA或RNA特異探針對固定在膜上的RNA進行雜交。其基本原理與Southern雜交相同，只不過變性方法不能采用堿變性法，因為堿導(dǎo)致RNA水解，一般采用聚乙二醛和二甲基亞砜、甲醛、甲基氫氧化汞等變性方法。

3.斑點雜交(dothybridization)：直接將變性DNA樣品點于硝酸纖維素膜上，固定好后先預(yù)雜交，再與標記探針雜交，然后通過高嚴謹性沖洗(低鹽高溫)，降低本底和提高特異性。預(yù)雜交和雜交可在密封袋中進行，密封袋比較方便，反應(yīng)體積小，可以使用高濃度探針，封口前去除氣泡，使雜交液與膜充分接觸，反應(yīng)體積以膜不貼壁、能浮動為宜。探針與同源樣品雜交后，陽性結(jié)果產(chǎn)生斑點，故稱斑點雜交。4.反向斑點雜交(reversedothybridization)：直接將不同的探針點印并固定在膜上，再將待測的DNA樣品與之雜交，這樣一次雜交反應(yīng)就可以判斷待測DNA是否含有這些探針的同源序列。5.菌落或噬菌斑雜交(圖7-13)。

二、核酸原位雜交用標記的已知核酸序列為探針，使其與細胞或組織切片中核酸進行雜交檢測的方法稱為核酸原位雜交(nucleicacidhybridizationinsitu)一般的原位雜交有兩種類型：與胞內(nèi)DNA的雜交和與RNA的雜交。三、液相雜交技術(shù)液相雜交是指待測的核酸和標記的探針同時溶于雜交液中進行反應(yīng)，然后分離雜交雙鏈和未參加反應(yīng)的標記探針，再進行檢測。㈠核酸酶Sl保護分析法(nucleaseSlprotectionassay)

用標記的基因組DNA作為探針，在適宜條件下與待測RNA進行液相雜交，DNA外顯子區(qū)可與mRNA形成DNA:R